一种从金银花花茎叶中提取及测定绿源酸的方法
本发明涉及农业饲料领域，特别涉及一种从金银花花茎叶中提取及测定绿源酸的方法。
背景技术：
1、目前，含有抗生素的饲料在中华人民共和国是全面禁止使用的，这从一定程度上来说有助于我国农业畜牧业、农村、农民和生态环境建设的良好发展，同时对于动物感染致病性菌种或者发生疾病有着比较重要的防治作用。显而易见，长期使用含抗生素的饲料对于农业畜牧业所产生的后果是比较严重的，尤其是会对肉食品的安全带来很大的隐患，从而对人类的身体健康也产生很大的威胁。所以我国目前已经全面禁用含抗生素的饲料，这对于保障农业畜牧业长远发展、肉食品安全以及人们的身体健康有着很大的促进作用。
2、金银花是我国一种以干燥花蕾和初花为主的传统中药材。在传统中医中，主要用于治疗喉痹、外感风热、中暑、消炎去热、抗流感、温病发热、热毒血痢在内的多种病症，全国近三分之一的中药方都用到金银花。随着研究的不断深入，金银花的应用已经从单一的药逐步走向饮料、食品、保键酒、日用化妆品和饲料养殖业等方面发展。
3、研究表明，金银花中含有大量的绿源酸，绿源酸具有优越的抗菌、抗病毒和调节血脂的性能，使得其在替代抗生素发挥功能上有着巨大的应用前景。随着制药业的兴起以及保健产品和食品市场的扩张，对绿色健康添加剂绿源酸的需求也是逐年增加。
4、但目前市场上的绿源酸供应短缺，这主要是由于目前从金银花中提取绿源酸的工艺水平不足，为此，我们提出一种从金银花花茎叶中提取及测定绿源酸的方法来解决上述问题。
技术实现思路
1、本发明的主要目的在于提供一种从金银花花茎叶中提取及测定绿源酸的方法，可以有效解决背景技术中的问题。
2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
3、一种从金银花花茎叶中提取及测定绿源酸的方法，具体步骤如下：
4、步骤一：提取绿源酸
5、供试金银花花瓣、茎和叶→50℃烘干→粉碎过筛→称量→提取→过滤→旋转蒸发浓缩→稀释定容→hplc测定绿源酸含量；
6、步骤二：制备实验样品溶液
7、1、将金银花花、茎和叶分型，分别在电热鼓风恒温干燥箱中以50℃烘干，冷却后用中草药粉碎机切碎备用，
8、2、用精密天平分别精确称取第1步中得到的新品系金银花花、茎和叶的粉末各2g，
9、3、取相应物质溶液比例的提取液至100ml的烧瓶中浸泡24h，在70℃下提取1.5h，重复提取2次，得到2次滤液，
10、4、滤出并混合两次过滤溶液，减压混合滤液浓缩凝结，不再产生液滴后，取100ml的容量瓶1个，将混合的两次过滤溶液用玻璃棒引流倒入其中，然后往混合滤液中添加足量的50％的乙醇溶液使溶液体积达到容量瓶的刻度线，
11、5、将4中所得的容量瓶中的过滤溶液在室温下静置一段时间以后，使溶液中浑浊部分沉淀至瓶底，然后取上清液并用孔隙为0.45μm的微滤膜进行过滤，用胶头滴管取1ml所得的微滤膜滤液，直接加入一个新的100ml容量瓶中，再加入足量的50％的乙醇溶液使溶液体积达到容量瓶的刻度线；
12、步骤三：测定绿源酸
13、1、标准溶液的配制
14、用精密天平精确称量购入的6.5mg的绿源酸，纯度99％，溶于25ml的容量瓶中，加入浓度为0.26mg/ml的50％乙醇溶液定容至刻度线，静置于4℃的冰箱中备用，
15、2、色谱条件
16、用实验室lc-8080高效液相色谱质谱仪，色谱柱选择4.6mm*150mm，5μm的agilentextend-c18，流动相为乙腈-水-磷酸，比例为33:218:1，设置高效液相色谱仪的进样流速为每min进样1ml溶液，调节色谱柱的温度为25℃，设置高效液相色谱仪的探测波长为固定波长330nm，样本进样量为20μl，
17、3、绘制标准曲线
18、分别取6个25ml的容量瓶，精确移取前述步骤中所得到的绿源酸标准溶液，1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml于加入其中，并将6个容量瓶分别编号为1号瓶、2号瓶、3号瓶、4号瓶、5号瓶、6号瓶；
19、步骤四：金银花中绿源酸的测定
20、优选的，取制备的实验样品溶液，用前述高效液相色谱法的色谱条件对实验样品溶液进行测定，对照所得的标准曲线回归方程，采用如下公式计算实验样品溶液中的绿源酸含量x。
21、
22、其中：
23、c＝样品溶液中绿源酸的浓度
24、v＝提取液的体积
25、m＝所取金银花花、茎、叶实验样品的质量；
26、步骤五：精密度实验
27、优选的，取同一批金银花新品系，按上述步骤配制样品溶液，在前述高效液相色谱法的色谱条件下连续进5次样，分别记录得到的峰面积值，以5次进样的峰面积值计算绿源酸的含量并进一步计算出标准方差及精密度；
28、步骤六：稳定性实验
29、取制备的金银花实验样品溶液，在取出后的第0、2、4、6、8、10、24h测量其绿酸含量，并确定试验峰的面积值，计算出稳定性试验的相对标准差；
30、步骤七：重复性实验
31、取同一批次金银花2g，按照前述步骤配制样品溶液，分为5个平行样品分别进样，测定溶液中绿源酸的含量，计算出5次重复的平行进样试验的相对标准偏差，从而测量系统的重复性；
32、加步骤八：样回收率实验
33、优选的，对5份已知绿源酸含量的金银花粉末精确称量，按照前述步骤配制样品溶液，并加入相同剂量的前述配制的绿源酸标准溶液定容至25ml，制备出供试溶液，在前述色谱条件下用实验室高效液相色谱质谱仪准确测定并计算加样回收率以及加样回收试验的相对标准偏差。
34、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
35、采用单因素法和正交实验法确定从金银花的花、茎、叶中进行绿源酸的高效且绿色环保的新提取工艺以及与之配套的分离纯化技术，并采用高效液相色谱法来分别测定其花、茎、叶中绿源酸的含量，以期能有效提取种植中采摘金银花后剩下的上亿吨茎秆叶藤条中所富含的绿源酸，缓解市场对绿源酸的需求，并降低传统提取技术的成本，带动产生更多显著的社会经济效益，具有实用价值和现实意义。
技术特征：
1.一种从金银花花茎叶中提取及测定绿源酸的方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的一种从金银花花茎叶中提取及测定绿源酸的方法，其特征在于：所述步骤二制备实验样品溶液中将金银花花、茎和叶分型，分别在电热鼓风恒温干燥箱中以50℃烘干，冷却后用中草药粉碎机切碎备用。
3.根据权利要求2所述的一种从金银花花茎叶中提取及测定绿源酸的方法，其特征在于：所述步骤二制备实验样品溶液中用精密天平分别精确称取第1步中得到的新品系金银花花、茎和叶的粉末各2g。
4.根据权利要求3所述的一种从金银花花茎叶中提取及测定绿源酸的方法，其特征在于：所述步骤二制备实验样品溶液中取相应物质溶液比例的提取液至100ml的烧瓶中浸泡24h，在70℃下提取1.5h，重复提取2次，得到2次滤液。
5.根据权利要求4所述的一种从金银花花茎叶中提取及测定绿源酸的方法，其特征在于：所述步骤二制备实验样品溶液中滤出并混合两次过滤溶液，减压混合滤液浓缩凝结，不再产生液滴后，取100ml的容量瓶1个，将混合的两次过滤溶液用玻璃棒引流倒入其中，然后往混合滤液中添加足量的50％的乙醇溶液使溶液体积达到容量瓶的刻度线。
6.根据权利要求4所述的一种从金银花花茎叶中提取及测定绿源酸的方法，其特征在于：所述步骤二制备实验样品溶液中将所得的容量瓶中的过滤溶液在室温下静置一段时间以后，使溶液中浑浊部分沉淀至瓶底，然后取上清液并用孔隙为0.45μm的微滤膜进行过滤，用胶头滴管取1ml所得的微滤膜滤液，直接加入一个新的100ml容量瓶中，再加入足量的50％的乙醇溶液使溶液体积达到容量瓶的刻度线。
7.根据权利要求1所述的一种从金银花花茎叶中提取及测定绿源酸的方法，其特征在于：所述步骤三中测定绿源酸，用精密天平精确称量购入的6.5mg的绿源酸，纯度99％，溶于25ml的容量瓶中，加入浓度为0.26mg/ml的50％乙醇溶液定容至刻度线，静置于4℃的冰箱中备用。
8.根据权利要求7所述的一种从金银花花茎叶中提取及测定绿源酸的方法，其特征在于：所述步骤三中测定绿源酸，用实验室lc-8080高效液相色谱质谱仪，色谱柱选择4.6mm*150mm，5μm的agilent extend-c18，流动相为乙腈-水-磷酸，比例为33:218:1，设置高效液相色谱仪的进样流速为每min进样1ml溶液，调节色谱柱的温度为25℃，设置高效液相色谱仪的探测波长为固定波长330nm，样本进样量为20μl。
9.根据权利要求8所述的一种从金银花花茎叶中提取及测定绿源酸的方法，其特征在于：所述步骤三中测定绿源酸，分别取6个25ml的容量瓶，精确移取前述步骤中所得到的绿源酸标准溶液，1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml于加入其中，并将6个容量瓶分别编号为1号瓶、2号瓶、3号瓶、4号瓶、5号瓶、6号瓶，
10.根据权利要求9所述的一种从金银花花茎叶中提取及测定绿源酸的方法，其特征在于：所述步骤三中测定绿源酸，对5份已知绿源酸含量的金银花粉末精确称量，按照前述步骤配制样品溶液，并加入相同剂量的前述配制的绿源酸标准溶液定容至25ml，制备出供试溶液，在前述色谱条件下用实验室高效液相色谱质谱仪准确测定并计算加样回收率以及加样回收试验的相对标准偏差。
技术总结
本发明公开了一种从金银花花茎叶中提取及测定绿源酸的方法，步骤如下：提取绿源酸，供试金银花花瓣、茎和叶→50℃烘干→粉碎过筛→称量→提取→过滤→旋转蒸发浓缩→稀释定容→HPLC测定绿源酸含量；制备实验样品溶液；测定绿源酸；精密度实验；稳定性实验；重复性实验；样回收率实验技术方案是，采用单因素法和正交实验法确定从金银花的花、茎、叶中进行绿源酸的高效且绿色环保的新提取工艺以及与之配套的分离纯化技术，并采用高效液相色谱法来分别测定其花、茎、叶中绿源酸的含量，以期能有效提取种植中采摘金银花后剩下的上亿吨茎秆叶藤条中所富含的绿源酸，缓解市场对绿源酸的需求，并降低传统提取技术的成本，带动产生更多显著的社会经济效益。
技术研发人员：王道源,王正武
受保护的技术使用者：上海交通大学四川研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23