一种饲喂型缓释抗猪丁型冠状病毒病卵黄抗体的制作方法
本发明涉及一种饲喂型缓释抗猪丁型冠状病毒病卵黄抗体，属于兽用生物制品领域。
背景技术：
1、猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus，pdcov)属于冠状病毒科丁型冠状病毒属成员之一，pdcov可以感染不同年龄的猪，其中以哺乳仔猪最易感。其主要临床症状为水样腹泻、脱水和死亡。有研究证明近年来pdcov常与猪流行性腹泻病毒(pedv)、传染性胃肠炎病毒(tgev)混合感染，导致仔猪死亡率骤升，目前尚无相关的预防性疫苗和治疗性药物。
2、卵黄抗体是指从被抗原免疫的禽蛋中提取的免疫球蛋白，免疫特定病原菌制备的卵黄抗体，可以直接抑制病原菌的生长或与病原菌的黏附因子结合而使其失去致病性。目前，卵黄抗体在动物疫病的预防、治疗和诊断中均得到了广泛的应用。但是，现在市售的卵黄抗体注射液存在保存期短、对动物应激大等缺陷，而卵黄抗体冻干粉存在使用方法复杂、不易保存等弱点，且目前尚无用于预防或治疗猪丁型冠状病毒病的卵黄抗体。
3、因此，急需开发一种保存时间长，对动物无应激、使用方便的抗猪丁型冠状病毒病的卵黄抗体。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种饲喂型缓释抗猪丁型冠状病毒病卵黄抗体。
2、同时，本发明还提供一种上述饲喂型缓释抗猪丁型冠状病毒卵黄抗体的制备方法。
3、为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案包括如下步骤：
4、步骤1：猪丁型冠状病毒病灭活疫苗的制备经猪丁型冠状病毒接种于llc-pk1sa细胞，待细胞病变率达到80％以上，经离心收获病毒液，加入二乙烯亚胺(binary ethyleneimine，bei)灭活，将montanide isa 201vg矿物油佐剂与灭活pdcov抗原等体积比混合，充分乳化后即得猪丁型冠状病毒灭活疫苗。
5、步骤2：蛋鸡免疫将上述制备的猪丁型冠状病毒灭活疫苗，免疫90-120日龄蛋鸡，共计免疫4-6次。
6、步骤3：饲喂型缓释抗猪丁型冠状病毒卵黄抗体的制备将采集的鸡蛋经消毒处理后，经酸化法提取卵黄抗体，经过滤纯化后，经冷冻干燥后与肠溶性包膜材料混匀后经干燥制备颗粒，采用流化床喷雾技术包被特殊脂肪材料，经充分混匀即得。
7、上述猪丁型冠状病毒灭活疫苗制备时油相与水相的乳化条件为31±1℃条件下，500r/min搅拌10min，乳化完成后，自然降温1小时以上。
8、上述蛋鸡的免疫程序为：第一次经翅根肌内免疫猪丁型冠状病毒病灭活疫苗，1.0ml/只；间隔10-14日，第二次经翅根肌内免疫猪丁型冠状病毒病灭活疫苗，1.5ml/只；间隔10-14日，第三次经胸部肌内免疫猪丁型冠状病毒病灭活疫苗，2.0ml/只；间隔10-14日，第四次经胸部肌内免疫猪丁型冠状病毒病灭活疫苗，1.5ml/只；间隔10-14日，第五次经翅根肌内免疫猪丁型冠状病毒病灭活疫苗，1.0ml/只；间隔10-14日，第六次经翅根肌内免疫猪丁型冠状病毒病灭活疫苗，1.5ml/只。
9、上述收集鸡蛋的条件为卵黄抗体水平≥1:1024。
10、上述在萃提卵黄抗体时，将卵黄与酸化水(用1mol/l盐酸调ph值至5.0的纯化水，并降温至1～4℃)按1∶7(v/v)-1∶9(v/v)加入提取罐中，边加边搅拌，2～8℃静置12～20小时。
11、上述在灭活卵黄抗体时，加入终浓度为0.2％的正辛酸，搅拌均匀，18～26℃静置12～20小时，抽取上清液。
12、上述肠溶性包膜材料为以下材料中的至少一种：(1)邻苯二甲酸醋酸纤维素(cap)；(2)邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(hpmcp)；(3)邻苯二甲酸聚乙烯醇酯(pvap)；(4)苯乙烯马来酸共聚物(styma)；(5)丙烯酸树脂ⅰ、ⅱ、ⅲ。
13、上述特殊脂肪材料为以下材料中的至少一种：(1)硬脂酸；(2)棕榈酸；(3)油酸；(4)亚油酸。
14、上述卵黄抗体的包被方法包括以下步骤：
15、步骤1将肠溶性包膜材料溶解于乙醇和水的混合液(v:v＝75:25)中；
16、步骤2将上述肠溶性包膜材料溶液加入冻干卵黄抗体中，常温下磁力搅拌直至液体完全挥发，用蒸馏水洗涤3-5次，经冷冻干燥制备肠溶性包膜颗粒；
17、步骤3将溶解后的特殊脂肪材料经流化床底喷喷雾至肠溶性包膜颗粒表面，彻底干燥后即得饲喂型缓释抗猪丁型冠状病毒卵黄抗体。
18、上述流化床喷雾技术，其特征在于，喷雾的工艺条件为：空气压力0.4-0.6mpa，进风温度25～45℃，蠕动泵转速60～80rpm，包材喷完后，关闭喷枪，继续流化5-10分钟，确保彻底干燥。
19、上述肠溶性包膜颗粒与冻干卵黄抗体的质量比为1:2。
20、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
21、(1)与现有技术相比，本发明提供的一种饲喂型缓释抗猪丁型冠状病毒病卵黄抗体的制备方法，采用特殊脂肪材料包被，可克服胃酸对蛋白的消化，通过口服直接饲喂或与饲料混合后饲喂，显著减少对动物的应激。
22、(2)与现有技术相比，本发明提供的一种饲喂型缓释抗猪丁型冠状病毒病卵黄抗体的制备方法，采用肠溶性包膜材料包被卵黄抗体，可使特异性卵黄抗体在肠道定位释放，可直接与肠道中增殖的猪丁型冠状病毒发生中和反应，提高作用效果。
23、(3)与现有技术相比，本发明提供的一种饲喂型缓释抗猪丁型冠状病毒病卵黄抗体，具有抗原纯净、效价高、成本低廉、易于规模化生产等优势。
技术特征：
1.一种饲喂型缓释抗猪丁型冠状病毒病卵黄抗体，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种饲喂型缓释抗猪丁型冠状病毒病卵黄抗体的制备方法，其特征在于，猪丁型冠状病毒灭活疫苗制备时油相与水相的乳化条件为31±1℃条件下，500r/min搅拌10min，乳化完成后，自然降温1小时以上。
3.根据权利要求1所述的一种饲喂型缓释抗猪丁型冠状病毒病卵黄抗体的制备方法，其特征在于，蛋鸡的免疫程序为：第一次经翅根肌内免疫猪丁型冠状病毒灭活疫苗，1.0ml/只；间隔10-14日，第二次经翅根肌内免疫猪丁型冠状病毒灭活疫苗，1.5ml/只；间隔10-14日，第三次经胸部肌内免疫猪丁型冠状病毒灭活疫苗，2.0ml/只；间隔10-14日，第四次经胸部肌内免疫猪丁型冠状病毒灭活疫苗，1.5ml/只；间隔10-14日，第五次经翅根肌内免疫猪丁型冠状病毒灭活疫苗，1.0ml/只；间隔10-14日，第六次经翅根肌内免疫猪丁型冠状病毒灭活疫苗，1.5ml/只。
4.根据权利要求1所述的一种饲喂型缓释抗猪丁型冠状病毒病卵黄抗体的制备方法，其特征在于，当卵黄抗体水平≥1:1024时开始采蛋。
5.根据权利要求1所述的一种饲喂型缓释抗猪丁型冠状病毒病卵黄抗体的制备方法，其特征在于，在萃提卵黄抗体时，将卵黄与酸化水(用1mol/l盐酸调ph值至5.0的纯化水，并降温至1～4℃)按1∶7(v/v)-1∶9(v/v)加入提取罐中，边加边搅拌，2～8℃静置12～20小时。
6.根据权利要求1所述的一种饲喂型缓释抗猪丁型冠状病毒病卵黄抗体的制备方法，其特征在于，在灭活卵黄抗体时，加入终浓度为0.2％的正辛酸，搅拌均匀，18～26℃静置12～20小时，抽取上清液。
7.根据权利要求1所述的一种饲喂型缓释抗猪丁型冠状病毒病卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述肠溶性包膜材料为以下材料中的至少一种：(1)邻苯二甲酸醋酸纤维素(cap)；(2)邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(hpmcp)；(3)邻苯二甲酸聚乙烯醇酯(pvap)；(4)苯乙烯马来酸共聚物(styma)；(5)丙烯酸树脂ⅰ、ⅱ、ⅲ。
8.根据权利要求1所述的一种饲喂型缓释抗猪丁型冠状病毒病卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述的特殊脂肪材料为以下材料中的至少一种：(1)硬脂酸；(2)棕榈酸；(3)油酸；(4)亚油酸。
9.根据权利要求1所述的一种饲喂型缓释抗猪丁型冠状病毒病卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述的卵黄抗体的包被方法包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的流化床喷雾技术，其特征在于，喷雾的工艺条件为：空气压力0.4-0.6mpa，进风温度25～45℃，蠕动泵转速60～80rpm，包材喷完后，关闭喷枪，继续流化5-10分钟，确保彻底干燥。
11.根据权利要求9所述的肠溶性包膜颗粒与冻干卵黄抗体的质量比为1:2。
12.一种饲喂型缓释抗猪丁型冠状病毒病卵黄抗体，其特征在于，是通过权利要求1-11所述制备方法得到。
技术总结
本发明涉及一种饲喂型缓释抗猪丁型冠状病毒病卵黄抗体，属于兽用生物制品技术领域。本发明涉及的方法主要包括肠溶性包膜及脂肪材料包膜的双层包膜技术。应用本发明制备的卵黄抗体通过口服即可在肠道定位释放，提高卵黄抗体的作用效果，成本低廉，应用方便，有利于规模化生产，具有良好的市场前景。
技术研发人员：李厚伟,姬星宇,王彦辉,余社会,张蒙蒙,张先锋,李自波,李倩倩,张真真
受保护的技术使用者：商丘美兰生物工程有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23