一种基于金属-有机框架材料的生物复合催化剂的制备工艺

本发明属于生物复合材料制备与应用领域，具体涉及利用金属-有机框架材料的缺陷产生，用于固定化酶，构建新型复合催化体系，从而得到一类高效稳定的非均相催化剂。

背景技术：

1、酶是一种生物大分子催化剂，由于其具有底物特异性、选择性和绿色化学等特点，在医药、食品、化工、农业等领域得到了广泛应用。然而，天然酶的热稳定性和操作稳定性较低，最优ph范围狭窄，对大多数有机溶剂的耐受能力较低，回收困难以及在操作条件下缺乏重复使用性。此外，酶通常在均相体系中表现最好，这导致从产品混合物中去除酶需要复杂的分离步骤。因此，开发高效的固定化酶载体，在维持酶活的同时提高酶的使用稳定性且便于其分离重复使用是酶在体外工业催化应用中亟待解决的重要问题。

2、金属-有机框架材料(metal-organic frameworks，mofs)是由带有连接点的金属离子和有机配体通过配位键连接组成的二维或者三维结构的多孔结构材料，在分子分离、催化和药物的缓释等方面存在着很大的应用潜力。与传统的有机和无机多孔材料相比，由于金属连接点和配体的几何结构和连接的丰富性，mofs材料拥有高比表面积、高孔体积、易调控孔径尺寸以及合成条件温和等特点，使其成为固定化酶材料的重要选择依据。目前mofs材料固定化酶主要包括共价结合、表面吸附、孔吸附和原位共沉淀等方法。共价结合法载体活化的操作复杂，所使用的化学交联剂会影响酶的空间结构，从而影响酶的催化活性；表面吸附法结合力弱，易解吸附；孔吸附法反应条件要求高，制备成本高，并且固定化效果受限于酶和孔道的尺寸；原位共沉淀法可使用的mofs载体数量很有限，并且大多数固定化酶分子位于载体内部，限制了催化反应中的传质，降低了酶的活性。以上的各类固定化酶方法均存在着多种缺陷，所以，迫切需要提出一种新的通用的金属-有机框架材料固定化酶方法。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供了一种金属-有机框架材料的缺陷产生用于固定化酶的生物复合材料，其制备工艺流程方便、快速、便捷，易于实现大规模工业化应用。该方法具体为将mofs载体颗粒浸泡在酶的溶液中，该酶具有可引发及调控其配体解离及交换的能力及浓度。本方法有别于传统的mofs表面的酶物理吸附法，方法简单有效，合成条件温和绿色，通用性很强，极大地扩展了生物复合催化剂的适用范围。

2、一方面，本发明提供一种温和条件下利用mofs的自发缺陷产生对酶固定化形成的生物复合材料，其特征在于，本发明所述的生物复合材料包括金属-有机框架材料和酶，金属-有机框架材料通过自发缺陷产生对酶进行固定化。

3、本发明中，所述金属-有机框架材料是含有金属配位的多孔框架材料，或者可以转变为金属-有机框架材料的其他材料，例如所述金属-有机框架材料是文献中已报道的含有不同金属配位的各类金属-有机框架，选自uio-66，hkust-1，zif-8，mof-808，zpf-2，zif-90，mof-801，mil-101，mil-100(fe)及其他金属-有机框架中的任一种及其任意组合。

4、本发明中，所述酶为水溶性酶，选自蛋白水解酶、氧化还原酶、转移酶、异构酶、裂解酶或合成酶，例如所述酶是已商品化的或人工表达的各类水溶性酶，选自脂肪酶，甲酸脱氢酶，过氧化氢酶，葡萄糖氧化酶，细胞色素c，辣根过氧化物酶，脲酶，胃蛋白酶，碱性蛋白酶，漆酶，淀粉酶，纤维素酶，溶菌酶及其他水溶性酶中的任一种及其任意组合。

5、本发明中，所述酶在一定浓度下，与mofs载体颗粒的质量比达到可打破mofs自身的可逆金属-配体的配位平衡时，具有可引发及调控金属-有机框架材料配体解离及交换的能力。

6、另一方面，本发明提供了一种酶@金属-有机框架生物复合材料的合成方法，其特征在于，本发明所述的制备方法为：将合成的mofs载体颗粒浸泡在具有可引发及调控其配体解离及交换浓度的酶的溶液一定时间后，金属-有机框架材料通过自发缺陷产生对酶进行固定化，分离并洗涤即可获得固定化后的酶@mofs型固定化酶制剂。

7、本发明中，所述金属-有机框架材料是含有金属配位的多孔框架材料，或者可以转变为金属-有机框架材料的其他材料，例如所述金属-有机框架材料是文献中已报道的含有不同金属配位的各类金属-有机框架，选自uio-66，hkust-1，zif-8，mof-808，zpf-2，zif-90，mof-801，mil-101，mil-100(fe)及其他金属-有机框架中的任一种及其任意组合。

8、本发明中，所述酶为水溶性酶，选自蛋白水解酶、氧化还原酶、转移酶、异构酶、裂解酶或合成酶，例如所述酶是已商品化的或人工表达的各类水溶性酶，选自脂肪酶，甲酸脱氢酶，过氧化氢酶，葡萄糖氧化酶，细胞色素c，辣根过氧化物酶，脲酶，胃蛋白酶，碱性蛋白酶，漆酶，淀粉酶，纤维素酶，溶菌酶及其他水溶性酶中的任一种及其任意组合。

9、本发明中，所述酶在一定浓度下，与mofs载体颗粒的质量比达到可打破mofs自身的可逆金属-配体的配位平衡时，具有可引发及调控金属-有机框架材料配体解离及交换的能力。

10、本发明中，所述酶的溶液为酶溶解于水中，或溶解于其他缓冲液中形成的，例如所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液，醋酸-醋酸钠缓冲液，醋酸-醋酸铵缓冲液，三羟甲基氨基甲烷缓冲液，碳酸氢盐缓冲液，2-吗啉乙磺酸缓冲液，4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，硼酸盐缓冲液及其他缓冲液中的任一种及其任意组合。

11、本发明中，所述缓冲液的浓度为0.001-1mol/l，优选为0.01-0.1mol/l。

12、本发明中，所述酶溶液的浓度为0.01-100mg/ml，优选为1-10mg/ml。

13、本发明中，所述酶与mofs载体颗粒的质量比为0.01-100，优选为0.1-1。

14、本发明中，所述的浸泡时间为1min-24h，优选为10min-1h。

15、本发明中，反应温度为4℃-100℃，优选为20℃-37℃。

16、传统的各类固定化酶方法通用性差，并均存在着多种缺陷。本发明中，所述方法只需简单的将mofs载体颗粒浸泡在酶的溶液中，该酶具有可引发及调控其配体解离及交换的能力及浓度。根据mofs载体自身的特性，调控酶溶液的浓度，当酶与mofs载体颗粒的质量比达到可打破mofs自身的可逆金属-配体的配位平衡时，酶分子所含的丰富的氨基酸官能团会与mofs的配体产生竞争性配位作用，从而引发酶分子与mofs配体的交换，使mofs载体产生部分的自发降解，并释放配体和金属离子形成缺陷，酶分子进入缺陷并与mofs载体颗粒重新配位结合，从而达到固定化效果。该方法有别于传统的mofs表面的酶物理吸附法，方法简单有效，合成条件温和绿色，所述原理通用性很强，极大地扩展了酶与mofs材料的适用范围。

17、本发明中，所述方法还具有酶分子促进mofs产生缺陷、酶分子特异性结合剥离mofs的金属原子、酶分子折叠并部分进入mofs孔道、酶分子与mofs配体官能团形成强相互作用、酶分子与mofs絮凝聚沉等其他固定化原理。

18、另一方面，本发明提供一种所述生物复合材料的用途，其特征在于，利用金属-有机框架材料通过配体交换导致自发缺陷产生对酶进行固定化得到的酶@mofs复合催化材料保持酶分子的催化活性，可作为一种非均相催化剂高效应用于多种反应的催化，该催化剂具有良好的催化活性、稳定性和循环利用性。

19、本发明中，所述催化反应包括但不限于基于脂肪酶的水解反应、酯交换反应和手性拆分反应、基于甲酸脱氢酶的脱氢反应、基于过氧化氢酶的分解反应、基于葡萄糖氧化酶的氧化反应、基于漆酶的氧化反应、基于淀粉酶和纤维素酶的水解反应。

20、优选的，所述基于脂肪酶的水解反应包括但不限于对4-硝基苯基乙酸酯和乙酰水杨酸甲酯的水解。

21、优选的，所述基于脂肪酶的手性催化反应包括但不限于对苯乙醇的手性拆分。

22、优选的，所述催化剂良好的催化活性包括但不限于对4-硝基苯基乙酸酯和乙酰水杨酸甲酯的水解反应活性可达到游离酶的85％以上。

23、优选的，所述基于甲酸脱氢酶的脱氢反应包括但不限于对甲酸盐的脱氢。

24、优选的，所述催化剂良好的催化活性包括但不限于对甲酸盐的脱氢反应活性可达到游离酶的50％以上。

25、优选的，所述基于过氧化氢酶的分解反应包括但不限于对过氧化氢的分解。

26、优选的，所述催化剂良好的催化活性包括但不限于对过氧化氢的分解反应活性可达到游离酶的30％以上。

27、优选的，所述催化剂良好的稳定性包括但不限于在有机溶剂、高温、酸、碱、胰蛋白酶、尿素、十六烷基磺酸钠(sds)中的稳定性以及存储稳定性。

28、优选的，所述催化剂良好的循环利用性包括但不限于脂肪酶@uio-66，脂肪酶@zif-8和脂肪酶@mof-808对4-硝基苯基乙酸酯水解反应、乙酰水杨酸甲酯水解反应和对苯乙醇的手性拆分反应。

29、进一步，脂肪酶@uio-66，脂肪酶@zif-8和脂肪酶@mof-808水解4-硝基苯基乙酸酯和乙酰水杨酸甲酯反应在经过5轮循环后还保持90％以上的活性。

30、进一步，脂肪酶@uio-66，脂肪酶@zif-8和脂肪酶@mof-808手性拆分苯乙醇反应在经过5轮循环后还保持80％以上的活性，ee值保持99％以上。

31、优选的，所述催化剂良好的循环利用性包括但不限于甲酸脱氢酶@uio-66，甲酸脱氢酶@zif-8和甲酸脱氢酶@mof-808对甲酸盐的脱氢反应。

32、进一步，甲酸脱氢酶@uio-66，甲酸脱氢酶@zif-8和甲酸脱氢酶@mof-808对甲酸盐的脱氢反应在经过5轮循环后还保持80％以上的活性。

33、优选的，所述催化剂良好的循环利用性包括但不限于过氧化氢酶@uio-66，过氧化氢酶@zif-8和过氧化氢酶@mof-808对过氧化氢的分解反应。

34、进一步，过氧化氢酶@uio-66，过氧化氢酶@zif-8和过氧化氢酶@mof-808对过氧化氢的分解反应在经过5轮循环后还保持80％以上的活性。

35、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

36、(1)本发明无需使用有机溶剂、强酸碱调节剂和高温高压处理，仅在常温常压下，用缓冲液或者水作为溶剂即可完成全部制备过程。整个制备过程不涉及有机溶剂和高温高压设备的使用，在环境保护和降低能耗方面具有显著优势。

37、(2)本发明载体材料和酶的适用范围很广，通用性很强，绝大多数mofs材料和酶均可以使用本发明的原理进行固定化，达到固定化酶效果。

38、(3)本发明对固定化酶的酶学性质进行了考察，发现其在稳定性等方面有着明显的提高。mofs材料的三维结构为酶提供了刚性屏蔽环境从而有效地减小外界不利环境对酶活力的影响，提高了其热稳定性、耐酸碱性、储藏稳定性、重复利用稳定性等特性。

39、(4)本发明根据所封装生物酶的催化功能的差异，所得复合材料固定化酶适用基于酶催化的绝大多数过程场景，行业包括工业生物催化、分析诊断、传感测试等。例如脂肪酶@uio-66可以应用于利用脂肪酶催化的水解或酯化反应的相关过程，该催化过程即可以是平台化学品的生产(如生物柴油的制备、手性化合物的拆分)，也可以是对特定催化产物的检测(该产物可以是某种指标分子)。

技术特征：

1.一种金属有机框架材料用于固定化酶的生物复合材料的制备方法，其特征在于，通过如下步骤进行制备：

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中酶溶液的溶剂为水或缓冲溶液。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲液，醋酸一醋酸钠缓冲液，醋酸一醋酸铵缓冲液，三羟甲基氨基甲烷缓冲液，碳酸氢盐缓冲液，2-吗啉乙磺酸缓冲液，4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，硼酸盐缓冲液中的任一种及其任意组合。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶溶液的浓度为0.01-100mg/ml，优选为1-10mg/ml。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶选自蛋白水解酶、氧化还原酶、转移酶、异构酶、裂解酶或合成酶，脂肪酶，甲酸脱氢酶，过氧化氢酶，葡萄糖氧化酶，细胞色素c，辣根过氧化物酶，脲酶，胃蛋白酶，碱性蛋白酶，漆酶，淀粉酶，纤维素酶，溶菌酶及其他水溶性酶中的任一种及其任意组合。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述金属有机框架材料选自uio-66，hkust-1，zif-8，mof-808，zpf-2，zif-90，mof-801，mil-101，mil-100(fe)中的任一种及其任意组合。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)的浸泡时间为1min-24h，优选为10min-1h。

8.如权利要求1-7的方法制备得到的生物复合材料。

9.如权利要求1-7的方法制备得到的生物复合材料的用途，其用于非均相催化反应。

10.如权利要求9的用途，所述费军饷催化反应选自基于脂肪酶的水解反应、酯交换反应和手性拆分反应、基于甲酸脱氢酶的脱氢反应、基于过氧化氢酶的分解反应、基于葡萄糖氧化酶的氧化反应、基于漆酶的氧化反应、基于淀粉酶和纤维素酶的水解反应的任意一种。

技术总结
本发明公开了一种基于金属‑有机框架材料的生物复合材料、其制备方法及应用，具体涉及利用金属‑有机框架材料的配体交换，用于固定化酶，构建新型复合催化体系，从而得到一类高效稳定的非均相催化剂。本发明还提供了一种生物复合材料的合成方法，将MOFs载体颗粒浸泡在具有可引发及调控其配体解离及交换浓度的酶的溶液一定时间后，金属‑有机框架材料通过配体交换对酶进行固定化，即可获得酶@MOFs型固定化酶制剂。本发明还提供一种生物复合材料的用途，其可以保持酶分子的催化活性，可作为一种非均相催化剂高效应用于多种反应的催化，该催化剂具有良好的催化活性、稳定性和循环利用性。

技术研发人员：陈瑶,张振杰,杨铭方,于江悦
受保护的技术使用者：南开大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23