新型光敏感离子通道蛋白ChRmine在视网膜神经退行性疾病中的应用的制作方法

本技术涉及眼睛疾病的治疗领域。具体而言，本技术涉及一种通过新型光敏感离子通道蛋白chrmine来治疗视网膜神经退行性疾病的方法。

背景技术：

1、视网膜神经退行性疾病，包括视网膜色素变性(rp)、年龄相关性黄斑变性(amd)等在内的致盲性眼病，都是由于视网膜关键细胞如感光细胞变性和死亡，进而导致视觉功能丧失甚至失明。视网膜神经退行性疾病这种发病机制严重损伤患者视力，目前在现有治疗手段下都摆脱不了不可逆性视觉功能丧失的结局。视网膜神经退行性疾病的发病机制往往由于感光细胞自身基因突变而发生凋亡反应或者失衡的视网膜微环境(如新生血管，视网膜色素上皮细胞的死亡等)加剧了感光细胞的凋亡。根据发病机制，治疗策略主要集中在：1)过表达或基因编辑修复相关突变基因，延缓感光细胞退化；2)抑制新生血管生成，减轻对感光细胞损伤；以及3)视网膜其它神经元(如双极细胞或节细胞)表达感光蛋白，行使感光功能。

2、其中利用视网膜其它神经元表达感光蛋白来恢复视力这一策略目前研究最为热门。感光蛋白包括内源性感光蛋白(例如opsin、rhodopsin、melanopsin等)和外源性感光蛋白。研究发现表达内源性感光蛋白或者各自与代谢型谷氨酸受体mglur的融合蛋白都可使失明小鼠恢复部分视力，该策略目前处于研发早期阶段。利用外源性感光蛋白，例如光敏感离子通道蛋白(例如chr2、chrimsonr、mco等)也实现了小鼠视力恢复，且已有相关产品走向临床，临床初步结果较为积极。

3、wo2007024391、wo2008022772或wo2009127705描述了来自植物和微生物的编码光敏感离子通道和离子泵(如二型通道视紫红质[chr2])的蛋白酶基因的用途，其被改造为在哺乳动物神经元中表达，并能够通过病毒载体在基因水平上植入特定的神经元。当暴露在具有适当波长的光中时，动作电位可以在表达光敏感蛋白的神经元中触发，从而使这些细胞具有光敏性。

4、wo2017187272a1公开了一种光敏感离子通道蛋白chrimsonr，患者在给药后，佩戴特殊眼镜辅助可以看到桌上物品。具体而言，发现chrimsonr与tdtomato(tdt)荧光蛋白或绿色荧光蛋白(gfp)融合后，比单独的chrimsonr蛋白能更有效地应答光刺激。

5、au2017372351b2公开了一种光敏感离子通道蛋白mco。在玻璃体下腔注射携带mco的腺相关病毒之后，mco报告蛋白在小鼠视网膜中有效且稳定地表达。还表明，mco在感光细胞变性模型小鼠的视网膜中表达可以实现行为学上的视力恢复。

6、本领域一直需要灵敏度和反应强度高、光毒性小的光敏感离子通道蛋白，以治疗各种视网膜神经退行性疾病。

技术实现思路

1、chrmine，来源于海洋微生物，首次发现于2019年，近几年一直作为光遗传学工具在脑中广泛应用。本发明人出人意料地发现，chrmine具备极强的光灵敏性，产生极大的光电流，且最佳吸收波长为安全性红移波长(580nm)，光毒性极小，优于目前市面上所有光敏感离子通道蛋白产品。这为治疗视网膜神经退行性疾病提供了新的策略，即利用视网膜其它神经元(如双极细胞或节细胞)表达具备感光功能的光敏感离子通道蛋白，使失明患者重新获得视力。

2、在一个方面，本发明提供了chrmine蛋白或其功能性衍生物，所述chrmine蛋白具有seq id no:1所示的氨基酸序列，或由所述序列组成。

3、在另一个方面，本发明提供了编码chrmine蛋白或其功能性衍生物的核酸。在一个实施方案中，所述核酸包含seq id no:2所示的核苷酸序列，或由所述序列组成。

4、在另一个方面，本发明提供了一种病毒载体，所述载体包含编码治疗剂的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述载体还包含衣壳蛋白。在一个实施方案中，所述衣壳蛋白是腺相关病毒(aav)衣壳蛋白，例如aav2、aav9或aav2/7m8衣壳蛋白。在一个实施方案中，所述治疗剂是chrmine蛋白或其功能性衍生物。

5、在另一个方面，本发明提供了一种aav病毒，所述病毒包含编码chrmine蛋白或其功能性衍生物的核酸。在一个实施方案中，所述aav病毒是血清型aav2、aav9或aav2/7m8。

6、在另一个方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含本文所述的核酸、病毒载体或aav病毒。

7、在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，所述组合物包含本文所述的核酸、病毒载体或aav病毒，以及药学上可接受的载剂。

8、在另一个方面，本发明提供了一种细胞，其通过本文所述的病毒载体转导或者包含所述病毒载体。在一个实施方案中，所述细胞为哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所述细胞为人细胞。在一个实施方案中，所述细胞为非人细胞。在一个实施方案中，所述细胞为视网膜细胞。在一个实施方案中，所述细胞为双极细胞或节细胞。在一个实施方案中，所述细胞为体外的。在一个实施方案中，所述细胞为体内的。

9、在另一个方面，本发明提供了一种治疗视网膜神经退行性疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者的眼睛施用治疗有效量的本文所述的核酸、病毒载体、aav病毒、药物组合物或细胞。在一个实施方案中，所述视网膜神经退行性疾病是视网膜色素变性(rp)或年龄相关性黄斑变性(amd)。在一个实施方案中，所述受试者是人。

10、在另一个方面，本发明提供了本文所述的核酸、病毒载体、aav病毒、药物组合物或细胞在制备用于治疗有需要的受试者的视网膜神经退行性疾病的药物中的用途。在一个实施方案中，所述视网膜神经退行性疾病是视网膜色素变性(rp)或年龄相关性黄斑变性(amd)。在一个实施方案中，所述受试者是人。

11、在另一个方面，本发明提供了本文所述的病毒载体在制备用于治疗有需要的受试者的视网膜神经退行性疾病的药物中的用途，其中所述病毒载体可转导至眼部视网膜细胞，以使得所转导的眼部视网膜细胞表达所述治疗剂。在一个实施方案中，所述眼部视网膜细胞为双极细胞或节细胞。在一个实施方案中，所述视网膜神经退行性疾病是视网膜色素变性(rp)或年龄相关性黄斑变性(amd)。在一个实施方案中，所述受试者是人。在一个实施方案中，所述治疗剂是chrmine蛋白或其功能性衍生物。在一个实施方案中，所述病毒载体是通过注射给药的，优选通过玻璃体下腔注射。

12、在根据本发明的一些实施方案中，治疗有效量的chrmine蛋白是长期表达的。在根据本发明的一些实施方案中，在注射后至少2个月，chrmine蛋白仍持续表达。在根据本发明的一些实施方案中，在注射后至少11个月，chrmine蛋白仍持续表达。

13、视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性等视网膜神经退行性疾病，最终以视网膜感光细胞退化凋亡告终，造成视力发生不可逆的受损。本发明人利用基因治疗，将一种新型光敏感离子通道蛋白chrmine递送于视网膜其它神经元，如双极细胞或节细胞，使这些细胞在保留自身应有生理功能的情况下，同时兼备了感受外源光线的能力。利用这一治疗策略，在感光细胞退化型失明c3h成年小鼠中表达chrmine后(>7周)，实现了眼睛部位视觉通路的改善，即检测到erg信号(视网膜电流图，a波+b波)，其中感光细胞特异性的a波非常小，而中间层双极细胞等特异性的b波相对较高，表明双极细胞或节细胞在获得光敏感离子通道蛋白后，代替且行使类感光细胞的感光能力，信息进一步整合，向下游视网膜神经细胞进行传递。此外，在视觉皮层也检测到vep(视觉诱发电位)神经冲动信号，表明信号进一步成功传递到大脑，即失明小鼠在表达chrmine后，可以实现眼睛-大脑整个视觉通路的修复。

技术特征：

1.光敏感离子通道蛋白chrmine或其功能性衍生物在制备用于治疗有需要的受试者的视网膜神经退行性疾病的药物中的用途。

2.病毒载体在制备用于治疗有需要的受试者的视网膜神经退行性疾病的药物中的用途，其中所述病毒载体包含编码chrmine蛋白或其功能性衍生物的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述病毒载体还包含腺相关病毒(aav)衣壳蛋白。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述衣壳蛋白是aav2、aav9或aav2/7m8衣壳蛋白。

5.根据权利要求2所述的用途，其中所述病毒载体是通过注射给药的，优选通过玻璃体下腔注射。

6.aav病毒在制备用于治疗有需要的受试者的视网膜神经退行性疾病的药物中的用途，其中所述病毒载体包含编码chrmine蛋白或其功能性衍生物的核苷酸序列。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述aav病毒是aav2、aav9或aav2/7m8衣壳蛋白。

8.根据权利要求6所述的用途，其中所述病毒载体是通过注射给药的，优选通过玻璃体下腔注射。

9.细胞在制备用于治疗有需要的受试者的视网膜神经退行性疾病的药物中的用途，其中所述细胞通过包含编码chrmine蛋白或其功能性衍生物的核苷酸序列的病毒载体转导或者包含所述病毒载体。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述病毒载体还包含腺相关病毒(aav)衣壳蛋白。

11.根据权利要求10所述的用途，其中所述衣壳蛋白是aav2、aav9或aav2/7m8衣壳蛋白。

12.根据权利要求9所述的用途，其中所述细胞为视网膜细胞。

13.根据权利要求9所述的用途，其中所述细胞为双极细胞或节细胞。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的用途，其中所述chrmine蛋白具有seq id no:1所示的氨基酸序列，或由所述序列组成。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的用途，其中所述视网膜神经退行性疾病是视网膜色素变性(rp)或年龄相关性黄斑变性(amd)。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的用途，其中所述受试者是人。

17.一种aav病毒，其中所述病毒包含编码chrmine蛋白或其功能性衍生物的核酸。

18.根据权利要求17所述的aav病毒，其中所述aav病毒是血清型aav2、aav9或aav2/7m8。

19.根据权利要求17所述的aav病毒，其中所述chrmine蛋白具有seq id no:1所示的氨基酸序列，或由所述序列组成。

技术总结
本申请涉及一种通过新型光敏感离子通道蛋白ChRmine来治疗视网膜神经退行性疾病的方法。在一些实施方案中，所述视网膜神经退行性疾病是视网膜色素变性(RP)或年龄相关性黄斑变性(AMD)。ChRmine蛋白具备极强的光灵敏性，产生极大的光电流，且最佳吸收波长为安全性红移波长(580nm)，光毒性极小，这为治疗视网膜神经退行性疾病提供了新的策略。

技术研发人员：未小虎,林浠,崔志平,刘晓华,孙思睫,谢程,张善中
受保护的技术使用者：苏州星明优健生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23