一种聚苯乙烯亲和的纳米抗体及其筛选方法和应用

本发明属于生物，具体涉及一种聚苯乙烯亲和的纳米抗体及其筛选方法和应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(vhh)和两个常规的ch2与ch3区，但却不像人工改造的单链抗体片段(scfv)那样容易相互沾粘，甚至聚集成块。更重要的是单独克隆并表达出来的vhh结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是已知的可结合目标抗原的最小单位。vhh晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15kda，此也被称作纳米抗体(nanobody，nb)。相对于传统抗体而言，纳米抗体在亲和力方面与其相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及dna操作、文库构建和3d结构测定的容易性方面超越传统抗体。

3、纳米抗体文库根据来源不同，可分为天然库，免疫文库以及合成库。天然库采用的是未经过免疫的动物淋巴细胞，一般不具有抗原偏向性，其亲和力和特异性较低，且需要从足够数量的不同个体动物身上采集大量的血液样本(通常超过1l)，难度大，费时费力。一般而言，天然文库的库容量和多样性因为自身的局限性，往往不能达到研究者的期望；免疫文库是用特定抗原免疫动物，使动物产生免疫应答，抽取免疫动物血液，从中分离淋巴细胞，进而得到抗体基因片段，用于构建抗体文库。由于是经过特定抗原免疫后的抗体基因片段构建的免疫抗体库，因而比较容易从中筛选出特异性强、亲和力高的抗体，是目前最普遍的制备纳米抗体的方法。但是免疫文库不仅需要花费高昂的成本饲养和维护动物，尤其是多靶标抗原免疫所需动物数量更大。还会对动物受体产生永久性伤害，甚至出现致死情况。而且免疫周期长，风险高，抗原用量大。此外，具有动物毒性的抗原不适合进行体内免疫。为解决传统免疫过程中的诸多问题，产生了合成库。合成库最大的优点就是可控性强，可依照自身期望通过人工合成，是为解决天然库的不可控性而出现的。对于框架区域(frs)和抗原互补决定区(cdrs)可以进行人为的设计调整，使合成库的库容量及多样性更加符合人们的期望。

4、一些小分子由于吸附能力很弱，不能直接包被于固相材料如聚苯乙烯表面，用于酶联免疫吸附实验(elisa)和其它方面的研究。目前针对这种问题的主要应对方式有选择采用经过特殊处理的固相材料，可以适当提高小分子蛋白的吸附能力，但也会大幅度增加成本且包被效果并不十分理想。或者将小分子多肽与大分子蛋白如bsa、fc等偶联，再包被固相材料，用于检测和研究。这种方法不仅耗时，需要多步反应促使蛋白和材料结合，而且还存在生物分子在偶联过程中因空间构象改变而导致生物学活性丧失的情况。另外蛋白质在固相表面的非特异性吸附是无序的，没有方向性，部分蛋白会因构象改变或活性位点被遮蔽而失去功能从而严重影响检测或后续研究的灵敏度和准确性。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种聚苯乙烯亲和的纳米抗体及其筛选方法和应用。本发明中筛选得到了一种能与聚苯乙烯特异性结合的纳米抗体，包括其序列和其筛选表达方法以及应用该纳米抗体改善蛋白在聚苯乙烯载体表面的固定效果，从而提高酶联免疫检测性能的方法。

2、为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：

3、第一方面，本发明提供了一种聚苯乙烯亲和的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、第二方面，本发明提供了一种第一方面所述的聚苯乙烯亲和的纳米抗体的筛选方法，包括以下步骤：

5、以核酸序列如seq id no.4所示的2d5-pmes4作为模板，通过nnk随机法引入突变及三轮pcr反应扩增获得全长纳米抗体片段，将得到的纳米抗体片段进行pcr产物纯化；

6、将纯化后的pcr产物与pmes4质粒分别进行psti、bsteii双酶切，酶切后的pmes4质粒和pcr产物通过t4 dna连接酶连接，回收并纯化连接产物；

7、将连接产物加入tg1感受态细胞中，进行电转化，电转化后收集菌体，使用添加抗生素的新鲜培养基将菌体重悬后加入甘油得到甘油菌液；

8、甘油菌液中加入vcsm13静置感染，经噬菌体扩增、噬菌体展示、固相淘选和噬菌体elisa筛选阳性克隆后得到纳米抗体序列，在纳米抗体序列原始菌中提取纳米抗体重组质粒，转化细胞并诱导表达，得到所述聚苯乙烯亲和的纳米抗体。

9、第三方面，本发明提供了第一方面所述的的聚苯乙烯亲和的纳米抗体在制备融合抗体、融合蛋白、酶联免疫固相抗原中的应用。

10、第四方面，本发明提供了一种融合纳米抗体，所述融合纳米抗体为第一方面所述的聚苯乙烯亲和的纳米抗体与功能化纳米抗体连接的融合纳米抗体。

11、第五方面，本发明提供了一种第四方面所述的融合纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

12、将第一方面所述的聚苯乙烯亲和的纳米抗体进行pcr反应得到pcr产物聚苯乙烯亲和纳米抗体片段，功能化纳米抗体进行bst i单酶切得到酶切产物含功能纳米抗体序列载体，pcr产物和酶切产物通过无缝克隆试剂盒连接，连接体系全部转化于dh5α感受态细胞中，进一步培养得到菌液，进行测序；

13、将测序无误的菌液提取质粒，转化入bl21感受态细胞，经多次培养、离心、重悬后得到含周质提取物的上清液，过滤膜得到所述融合纳米抗体。

14、第六方面，本发明提供了第一方面所述聚苯乙烯亲和的纳米抗体和/或第四方面所述的融合纳米抗体在制备免疫产品中的应用。

15、上述本发明的一种或多种技术方案取得的有益效果如下：

16、本发明筛选得到的纳米抗体b2对聚苯乙烯材料有较强的亲和结合能力，能引导融合蛋白以统一有序的方式导向固定至聚苯乙烯表面，可避免抗体的结合位点与载体表面直接接触而导致构象改变或活性位点被遮盖，最大程度的保持抗体结合活性和正确的空间构象。

17、纳米抗体b2与其他功能化纳米抗体进行融合，可以实现吸附性能弱的纳米抗体在聚苯乙烯表面的亲和结合，进行酶联免疫吸附实验和其他研究。

18、纳米抗体b2可应用于以聚苯乙烯为固定载体的酶联免疫、生物学及细胞学检测，以及生物传感器及微阵列芯片等诊断检验技术，提高检测灵敏度。

技术特征：

1.一种聚苯乙烯亲和的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如seq idno.1所示。

2.如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的编码核酸序列如seq idno.2所示。

3.一种权利要求1或2所述的聚苯乙烯亲和的纳米抗体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.如权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，第一轮pcr反应中上游引物的核酸序列如seq id no.5所示，下游引物的核酸序列如seq id no.6所示；第二轮pcr反应中上游引物的核酸序列如seq id no.7所示，下游引物的核酸序列如seq id no.8所示；第三轮pcr反应中上游引物的核酸序列如seq idno.5所示，下游引物的核酸序列如seq id no.9所示。

5.如权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，电转化完成后，加入soc培养基混匀，复苏、离心倒掉上清收集菌体，2×ty培养基重悬菌体得到菌液，菌液涂于平板培养后加入2×ty培养基收集菌液，离心收集菌体，2×ty培养基重悬菌体重悬菌体后1:1加到40％甘油中得到甘油菌液。

6.如权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述细胞包括大肠杆菌细胞或293细胞中的一种或多种。

7.权利要求1或2所述的的聚苯乙烯亲和的纳米抗体在制备融合抗体、融合蛋白、酶联免疫固相抗原中的应用。

8.一种融合纳米抗体，其特征在于，所述融合纳米抗体为权利要求1或2所述的聚苯乙烯亲和的纳米抗体与功能化纳米抗体连接的融合纳米抗体。

9.一种权利要求7所述的融合纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

10.权利要求1或2所述聚苯乙烯亲和的纳米抗体和/或权利要求8所述的融合纳米抗体在制备免疫产品中的应用。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种聚苯乙烯亲和的纳米抗体及其筛选方法和应用。本发明提供了一种聚苯乙烯亲和的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明中筛选得到了一种能与聚苯乙烯特异性结合的纳米抗体，包括其序列和其筛选表达方法以及应用该纳米抗体改善蛋白在聚苯乙烯载体表面的固定效果，从而提高酶联免疫检测性能的方法。

技术研发人员：邓洋,刘文帅,年锐,古一,刘金燕
受保护的技术使用者：中国科学院青岛生物能源与过程研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23