一种新型水稻抗病相关基因的应用

本发明涉及生物，具体涉及一种新型水稻抗病相关基因的应用。

背景技术：

1、水杨酸(salicylic acid,sa)是一种重要的植物激素，具有重要的生物学功能，调控植物的生物和非生物反应，如种子萌发，呼吸和产热等，也可介导植物对病原体的防御反应，在抗病中发挥作用。在植物中，水杨酸的合成有两条途径，即异分支酸合成酶(isochorismate synthase，ics)途径和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase，pal)途径。在不同的植物物种中，两个途径对水杨酸合成的贡献是有所不同的。在模式植物拟南芥中，其水杨酸的合成途径研究得较为清楚，其中它90％的合成来自于ics途径，是主要的途径，剩余的10％来自pal途径。大麦中的基础sa是由pal途径产生的。这两种途径的贡献也可能相等，例如大豆。

2、水稻作为世界主粮作物之一，对水杨酸合成途径的研究尚不清晰，而且与拟南芥等双子叶植物相比，水稻体内含有较高的sa水平。ics途径起始于分支酸，在ics酶的催化作用下形成异分支酸，最终生成sa。osics1作为水稻ics途径中一个关键的合成酶，对水杨酸合成有什么样的影响，这个问题有待于研究，从而更有利于我们去了解水稻中水杨酸的生物合成。

3、另外，纯合致死突变在植物遗传改良和育种中也有重要意义。比如将其应用于植物遗传改良工作，可以作为重要的指示基因；应用于杂交水稻制种，可方便检测杂交后代的纯度；应用于常规水稻制种，由于其纯合致死特点，可有效防止留种以保护品种拥有者的知识产权等。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种新型水稻抗病相关基因的应用。

2、第一方面，本发明要求保护用于敲除水稻基因组中osics1基因的载体在制备水稻osics1基因敲除纯合致死突变体中的应用。

3、其中，所述用于敲除水稻基因组中osics1基因的载体为crispr-cas9系统。

4、进一步地，所述crispr-cas9系统针对的靶序列是根据pam位点ngg或nag设计的。

5、更进一步地，根据pam位点ngg设计的所述靶序列为seq id no.1。在本发明的具体实施方式中，所述crispr-cas9系统具体为将seq id no.1所示片段插入到phue411载体的酶切位点bsai处后所得的重组质粒。

6、更进一步地，根据pam位点nag设计的所述靶序列为seq id no.4或seq id no.7。在本发明的具体实施方式中，所述crispr-cas9系统具体为将seq id no.4或seq id no.7所示片段插入到phue411载体的酶切位点bsai处后所得的重组质粒。

7、第二方面，本发明要求保护一种制备水稻osics1基因敲除纯合致死突变体的方法。

8、本发明要求保护的制备水稻osics1基因敲除纯合致死突变体的方法，可包括如下步骤：

9、(a1)将crispr-cas9系统导入受体水稻，得到转基因水稻；所述crispr-cas9系统用于敲除osics1基因，针对的靶序列为seq id no.1；

10、(a2)从(a1)所得转基因水稻中筛选osics1基因敲除纯合株系，即得水稻osics1基因敲除纯合致死突变体。

11、在本发明的具体实施方式中，利用该技术方案所得到的所述水稻osics1基因敲除纯合致死突变体与所述受体水稻相比，具体是：所述受体水稻基因组中osics1基因的靶标处序列为cgccgtggggcagctca--gggagg，所述纯合致死突变体的对应序列为cgccgtgggg------------agg，表现为10bp的缺失，或者为cgccgtggggcagctcatagggagg，表现为2bp的插入。

12、第三方面，本发明要求保护一种制备水稻osics1基因敲除纯合致死突变体的方法。

13、本发明要求保护的制备水稻osics1基因敲除纯合致死突变体的方法，可包括如下步骤：

14、(b1)将crispr-cas9系统导入受体水稻，得到转基因水稻；所述crispr-cas9系统用于敲除osics1基因，针对的靶序列为seq id no.4或seq id no.7；

15、(b2)从(b1)所得转基因水稻中筛选osics1基因敲除杂合株系，所述杂合株系自交，从自交后代中获得水稻osics1基因敲除纯合致死突变体。

16、在本发明的具体实施方式中，利用该技术方案所得到的所述水稻osics1基因敲除纯合致死突变体与所述受体水稻相比，具体是：针对靶序列为seq id no.4，所述受体水稻基因组中osics1基因的靶标处序列为atcagtgggcaatcccttggaag，所述纯合致死突变体的对应序列为atcagtgggcaatccc-tggaag，表现为1bp的缺失。针对靶序列为seq id no.7，所述受体水稻基因组中osics1基因的靶标处序列为cttcggaaacttccaagagtaca，所述纯合致死突变体的对应序列为cttcgga----tccaagagtac，表现为4bp的缺失。

17、第四方面，本发明要求保护用于检测水稻osics1基因是否发生纯合敲除的引物在鉴定待测水稻是否为水稻osics1基因敲除纯合致死突变体中的应用；

18、所述待测水稻为萌发后20天以内的水稻。

19、进一步地，所述用于检测水稻osics1基因是否发生纯合敲除的引物为针对水稻基因组上osics1基因设计的检测引物。

20、在本发明的具体实施方式中，所述检测引物为由seq id no.2和seq id no.3所示两条单链dna组成的引物对(对应前文靶序列1)，或者为由seq id no.5和seq id no.6所示两条单链dna组成的引物对(对应前文靶序列2)，或者为由seq id no.8和seq id no.9所示两条单链dna组成的引物对(对应前文靶序列3)。

21、第五方面，本发明要求保护一种鉴定待测水稻是否为水稻osics1基因敲除纯合致死突变体的方法。

22、本发明要求保护的鉴定待测水稻是否为水稻osics1基因敲除纯合致死突变体的方法，可包括如下步骤：用前文第四方面中所述的物质检测待测水稻的osics1基因是否发生纯合敲除，如果所述待测水稻的osics1基因发生了纯合敲除，则所述待测水稻为水稻osics1基因敲除纯合致死突变体；

23、所述待测水稻为萌发后20天以内的水稻。

24、第六方面，本发明要求保护水稻osics1基因在如下任一中的应用：

25、(c1)作为指示基因用于水稻遗传改良；

26、(c2)在杂交水稻制种中用于检测杂交后代纯度；

27、(c3)在常规水稻制种中用于防止留种。

28、第七方面，本发明要求保护一种调控水稻水杨酸含量的方法。

29、本发明所要求保护的调控水稻水杨酸含量的方法不通过调控ics途径实现。

30、进一步地，所述方法可通过调控pal途径实现。

31、本发明通过crispr-cas9系统构建水稻osics1基因敲除株系，结果发现水稻osics1基因被敲除后具有纯合致死表型(植株矮小，叶片变黄，在萌发后20天左右死亡)。将其应用于植物遗传改良工作，可以作为重要的指示基因；应用于杂交水稻制种，可方便检测杂交后代的纯度；应用于常规水稻制种，由于其纯合致死特点，可有效防止留种以保护品种拥有者的知识产权等。另外，研究还发现水稻osics1基因敲除纯合突变体水杨酸的含量与野生型相比没有显著差异，没有观察到水杨酸含量的变化，这表明水稻体内水杨酸的生物合成不依赖于ics途径，可能主要来源于pal途径。本发明获得了有价值的突变体材料，丰富了水稻的种质资源，对于水稻重要功能基因的开发以及在农业生产上遗传改良，制种具有重要意义。

技术特征：

1.用于敲除水稻基因组中osics1基因的载体在制备水稻osics1基因敲除纯合致死突变体中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述用于敲除水稻基因组中osics1基因的载体为crispr-cas9系统。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述crispr-cas9系统针对的靶序列是根据pam位点ngg或nag设计的；

4.一种制备水稻osics1基因敲除纯合致死突变体的方法，包括如下步骤：

5.一种制备水稻osics1基因敲除纯合致死突变体的方法，包括如下步骤：

6.用于检测水稻osics1基因是否发生纯合敲除的引物在鉴定待测水稻是否为水稻osics1基因敲除纯合致死突变体中的应用；

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述用于检测水稻osics1基因是否发生纯合敲除的引物为针对水稻基因组上osics1基因设计的检测引物；

8.一种鉴定待测水稻是否为水稻osics1基因敲除纯合致死突变体的方法，包括如下步骤：用权利要求6或7中所述的引物检测待测水稻的osics1基因是否发生纯合敲除，如果所述待测水稻的osics1基因发生了纯合敲除，则所述待测水稻为水稻osics1基因敲除纯合致死突变体；

9.水稻osics1基因在如下任一中的应用：

10.一种调控水稻水杨酸含量的方法，其特征在于：所述方法不通过调控ics途径实现；

技术总结
本发明公开了一种新型水稻抗病相关基因的应用。本发明提供了用于敲除水稻基因组中OsICS1基因的载体在制备水稻OsICS1基因敲除纯合致死突变体中的应用。本发明发现水稻OsICS1基因被敲除后具有纯合致死表型，将其应用于植物遗传改良工作，可作为重要的指示基因；应用于杂交水稻制种，可方便检测杂交后代的纯度；应用于常规水稻制种，由于其纯合致死特点，可有效防止留种以保护品种拥有者的知识产权。本发明获得了有价值的突变体材料，丰富了水稻的种质资源，对于水稻重要功能基因的开发以及在农业生产上遗传改良，制种具有重要意义。

技术研发人员：高晋兰,邱金龙,杨贵清,王曾茜
受保护的技术使用者：中国科学院微生物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23