感染性心内膜炎相关病原体的多重检测及试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物学检测，涉及一种病原体的检测方法，特别涉及一种感染性心内膜炎相关病原体的检测方法及试剂盒。

背景技术：

1、感染性心内膜炎(infectious endocarditis，ie)是由细菌、真菌、病毒等其他微生物直接感染心内膜、瓣膜、腱索及心内植入物等部位而引起的严重感染性疾病。ie感染后的特征性表现是瓣膜处赘生物形成，赘生物脱落后可进一步导致、重要器官栓塞、感染转移或脓毒血症等。ie临床上可表现为急性、亚急性或慢性。其中急性ie进展迅速，表现为突然高热、寒颤、败血症等全身并发症，且与脓毒血症难以鉴别，但出现新发的心脏杂音时，应诊断为急性ie。而亚急性ie诊断颇为困难。患者在数周至数月内可出现疲劳、呼吸困难或体重减轻等非特异性症状，并不都出现发热症状，且出现心脏杂音的不足半数。

2、近年来，各大医疗机构通过回顾性研究发现感染性心内膜炎在流行病学上随着时代的变迁而不断地发生变化，再次引起重视，并不断更新指南，但效果不甚理想。一方面是由于临床上诊断感染性心内膜炎的技术灵敏度不断提高，包括血培养，病理检查及超声心动图。另一方面是由于人们人生活水平提高，抗生素滥用的情况加剧，加快致病菌的变种及耐药性的进程，加之透析、人工瓣膜置换及心血管介入手术等侵入性有创的操作增多，大大增加感染几率。因此，开发一种可用于临床上感染性心内膜炎相关病原的检测方法研究对于ie的正确用药，以及合理的治疗方案制定具有十分重要的意义。

3、目前临床上针对ie的检测方法，主要有实验室检查，影像学检测，以及微生物学诊断。胆红素、肌酐、血小板计数和肌酐清除率可作为实验室检查中，用于ie患者风险分层的相关指标；超声心动图是诊断感染性心内膜炎及并发症的最重要的影像学检查方法，但由于经胸超声心动图诊断心内脓肿的灵敏度很低，所以在所有疑似脓肿的病例中，都应进行经食管超声心动图，且脓肿引起的心内膜炎必须经手术治疗；临床上的诊断根据改良的duke标准，致病菌的测定是最重要的，这使得临床医生能对目标病原体进行特定的治疗，并有助于确定感染源。血培养应在抗生素治疗前，至少要从3个不同的静脉穿刺部位采集血液，每次静脉穿刺应至少需要20毫升的血液，因为血培养的阳性率与所培养血液体积呈正相关。但是，由于抽取血培养前已经使用抗菌药物、不适当的微生物培养技术、苛氧菌或常规培养技术难以发现的特殊致病菌等因素，造成血培养的阳性率较低。

4、与上述临床上ie的诊断方法不同，宏基因组二代测序(metagenomicsnext-generationsequencing，mngs)不依赖于目标微生物的分类或繁殖，检测微生物的范围更广泛。mngs相比一代测序大幅降低了成本，保持了较高的准确性，并且大幅缩短了测序时间(只需48～72h)，与血培养及赘生物培养的检测时间相比也明显缩短(尤其对于苛养以及慢生长病原体的检测)，对于术前血培养阴性患者可根据赘生物mngs结果早期进行抗感染治疗。且mngs结果不受患者是否使用抗生素治疗的影响。有研究显示，相对于血培养和赘生物培养，mngs对于ie微生物的检出率更高。但是mngs的临床应用也存在一定的限制性，首先，其不能判断病原微生物的药敏情况，只能为诊断提供依据；其次，由于目前病原体的参考序列数据库尚未完善，分类方法也不统一，dna在环境中的广泛存在，以及所用试剂的多样性，使得mngs鉴定病原体变得更加复杂。值得注意的是，当mngs应用于临床诊断时，为确保结果的准确性、可重复性和可比性，对样本采集、核酸提取和数据分析等过程需进行标准化操作，实验流程复杂，且要求相对苛刻；因此，迫切需要一种高检出率、准确、快速、敏感的ie的检测方法，以便在患者出现临床症状前的早期确定感染性心内膜炎感染病例，实现感染性心内膜炎患者术后个体化、精准化的抗感染治疗。

5、

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种快速、便捷且灵敏度高的，可用于ie相关病原体检测方法的专用引物。

2、本发明所提供的用于ie相关病原体检测的专用引物，是选取各个病原种间特异、种内保守的基因或区域作为ie相关病原体检测的靶基因(包括gyrb基因，gro基因，nuc基因，及ddl基因)，选取能准确检测ie相关病原体(包括血链球菌、缓症链球菌、口腔链球菌、戈登链球菌、唾液链球菌、咽峡炎链球菌、变异链球菌、解没食子酸链球菌没食子酸亚种、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、头状葡萄球菌、溶血葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、缺陷乏养菌、毗邻颗粒链菌)，以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌相关耐药位点检测的目标序列，同时选择β珠蛋白基因(hemoglobin beta gene,hbb)作为内对照用于监测样本核酸提取情况。genbank数据库((https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中下载ie相关病原体作为参考序列的代表株基因序列，将参考序列与ncbi的nr数据库进行核酸序列blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)，下载比对得到的结果，获取更多检测靶基因序列。使用引物设计软件针对上述分析得到的靶基因保守区域序列设计特异性的扩增引物与探针。经过多次尝试，最终获得能准确检测ie相关病原体的最佳引物与探针。使用ncbi提供的在线引物验证工具primer-blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer blast/)对试剂进行评价，验证引物的特异性。

3、为此，本发明提供用于检测ie相关病原体的专用引物和探针，其特征在于，选自21套引物组与21个探针组成的组中的一组或多组，其中，所述21组引物组与21个探针的核苷酸序列为seq id no.1-seq id no.63所示；所述21套引物组与21个探针组成的组中每一组包括一对引物组和探针，一对引物组由两条引物组成，一条为正向引物，一条为反向引物。

4、其中，所述每一组包括一对引物组和探针，选自，seq id no.1-3；seq id no.4-6；seq id no.7-9；seq id no.10-12；seq id no.13-15；seq id no.16-18；seq id no.19-21；seq id no.22-24；seq id no.25-27；seq id no.28-30；seq id no.31-33；seq idno.34-36；seq id no.37-39；seq id no.40-42；seq id no.43-45；seq id no.46-48；seqid no.49-51；seq id no.52-54；seq id no.55-57；seq id no.58-60；seq id no.61-63中的一组或多组。

5、其中，seq id no.1-3中，seq id no.1为正向引物，seq id no.2为反向引物，seqid no.3为探针；seq id no.4-6中，seq id no.4为正向引物，seq id no.5为反向引物，seqid no.6为探针；seq id no.7-9中，seq id no.7为正向引物，seq id no.8为反向引物，seqid no.9为探针；seq id no.10-12中，seq id no.10为正向引物，seq id no.11为反向引物，seq id no.12为探针；seq id no.13-15中，seq id no.13为正向引物，seq id no.14为反向引物，seq id no.15为探针；seq id no.16-18中，seq id no.16为正向引物，seq idno.17为反向引物，seq id no.18为探针；seq id no.19-21中，seq id no.19为正向引物，seq id no.20为反向引物，seq id no.21为探针；seq id no.22-24中，seq id no.22为正向引物，seq id no.23为反向引物，seq id no.24为探针；seq id no.25-27中，seq idno.25为正向引物，seq id no.26为反向引物，seq id no.27为探针；seq id no.28-30中，seq id no.28为正向引物，seq id no.29为反向引物，seq id no.30为探针；seq idno.31-33中，seq id no.31为正向引物，seq id no.32为反向引物，seq id no.33为探针；seq id no.34-36中，seq id no.34为正向引物，seq id no.35为反向引物，seq id no.36为探针；seq id no.37-39中，seq id no.37为正向引物，seq id no.38为反向引物，seq idno.39为探针；seq id no.40-42中，seq id no.40为正向引物，seq id no.41为反向引物，seq id no.42为探针；seq id no.43-45中，seq id no.43为正向引物，seq id no.44为反向引物，seq id no.45为探针；seq id no.46-48中，seq id no.46为正向引物，seq idno.47为反向引物，seq id no.48为探针；seq id no.49-51中，seq id no.49为正向引物，seq id no.50为反向引物，seq id no.51为探针；seq id no.52-54中，seq id no.52为正向引物，seq id no.53为反向引物，seq id no.54为探针；seq id no.55-57中，seq idno.55为正向引物，seq id no.56反向引物，seq id no.57为探针；seq id no.58-60中，seqid no.58为正向引物，seq id no.59为反向引物，seq id no.60为探针；seq id no.61-63中，seq id no.61为正向引物，seq id no.62为反向引物，seq id no.63为探针。

6、其中，用于检测血链球菌的专用引物与探针，为seq id no.1-seq id no.3所示。

7、其中，用于检测缓症链球菌的专用引物与探针，为seq id no.4-seq id no.6所示。

8、其中，用于检测口腔链球菌的专用引物与探针，为seq id no.7-seq id no.9所示。

9、其中，用于检测戈登链球菌的专用引物与探针，为seq id no.10-seq id no.12所示。

10、其中，用于检测唾液链球菌的专用引物与探针，为seq id no.13-seq id no.15所示。

11、其中，用于检测咽峡链球菌的专用引物与探针，为seq id no.16-seq id no.18所示。

12、其中，用于检测变异链球菌的专用引物与探针，为seq id no.19-seq id no.21所示。

13、其中，用于检测解没食子酸链球菌没食子酸亚种的专用引物与探针，为seq idno.22-seq id no.24所示。

14、其中，用于检测金黄色葡萄球菌的专用引物与探针，为seq id no.25-seq idno.27所示。

15、其中，用于检测表皮葡萄球菌的专用引物与探针，为seq id no.28-seq id no.30所示。

16、其中，用于检测头状葡萄球菌的专用引物与探针，为seq id no.31-seq id no.33所示。

17、其中，用于检测溶血葡萄球菌的专用引物与探针，为seq id no.34-seq id no.36所示。

18、其中，用于检测粪肠球菌的专用引物与探针，为seq id no.37-seq id no.39所示。

19、其中，用于检测屎肠球菌的专用引物与探针，为seq id no.40-seq id no.42所示。

20、其中，用于检测铜绿假单胞菌的专用引物与探针，为seq id no.43-seq id no.45所示。

21、其中，用于检测缺陷乏养菌的专用引物与探针，为seq id no.46-seq id no.48所示。

22、其中，用于检测毗邻颗粒链菌的专用引物与探针，为seq id no.49-seq id no.51所示。

23、其中，用于检测β珠蛋白基因的专用引物与探针，为seq id no.52-seq id no.54所示。

24、其中，用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌相关耐药基因的专用引物与探针，为seqid no.55-seq id no.63所示。

25、ie相关病原体检测方法的专用引物，所述引物为21个目标序列的特征性引物组与探针。一套引物组，两条引物组成，一条为正向引物，一条为反向引物。共有21套引物组与探针，分别针对21个目标序列实现多重检测反应，引物和探针的序列信息见表1。

26、表1引物与探针序列信息

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32、表2检测靶标的初始及阳性荷质比

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35、本发明进一步提供一种用于检测ie相关病原体的试剂盒，包括前述所述专用引物组和探针组成的组中的任何一组或多组。其中，所述专用引物组和探针组成的组中的任何一组或多组选自seq id no.1-seq id no.63专用引物组和探针组成的组中的任何一组或多组。

36、本发明所述的试剂盒，其中还包括多重pcr反应组分，虾碱性磷酸酶反应组分，单碱基延伸反应组分，阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为各检测靶点的野生型或突变型阳性样本，所述阴性对照为ddh2o。

37、本发明进一步包括所述的专用引物和探针在制备检测ie相关病原体的试剂盒中的应用。

38、本发明进一步包括所述的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

39、(1)使用商品化的dna提取试剂盒完成测试样本核苷酸的提取；

40、(2)以待测样本的核苷酸为模板，在上述专用引物组与探针的引导下配制多重pcr扩增反应体系，进行各检测反应孔特异性扩增，使用axima核酸质谱仪器进行结果检测；

41、(3)结果判读：若检测结果为阳性，则会在相应靶基因的阳性产物荷质比处出现特异的产物峰；若检测结果为阴性，则会在相应靶基因的初始荷质比处出现特异的产物峰。综合各个靶标的阳性特异产物峰的检测情况，判定样本的ie相关病原体检出情况。

42、其中，所述的检测样本来源于血液、赘生物、唾液样本。

43、其中，所述引物与探针的最终浓度为50μm，各个探针的终浓度为250μm。

44、所述多重pcr反应，方法如下：使用以上步骤获得的病原体dna样本作为模板，加入10μl多重pcr反应体系包括：2.6μl的各个引物最佳扩增浓度的混合体系，5μl的2×reaction mix,0.4μl taq mix，样本模板2μl。扩增反应的条件为：94℃孵育2分后，94℃变性15秒，56.5℃退火30秒，68℃延伸1分钟，共进行45个循环扩增反应结束后，68℃补充延伸5分钟后，低温保存至4℃。收集上述反应产物，加入2μl sap反应体系：1μlsap buffer与1μlsap酶。按照如下反应条件进行：37℃sap酶作用15分钟，85℃作用5分钟，使sap酶失去活性。收集上述反应产物，加入2μl单碱基延伸反应体系：0.4μl的单碱基延伸反应buffer,0.94μl的探针混合物，0.041μl的单碱基延伸反应酶。扩增反应条件：95℃预变性30秒后，94℃反应5秒，52℃反应5秒，80℃反应5秒，上述2个反应循环5次，上述3个反应共进行45个扩增循环反应结束后，72℃孵育3分钟。11μl的无核酸水与上述反应体系混合，将适量树脂转移至上述反应体系，均匀吹吸数次后，置于翻转摇床上，80rpm翻转30分钟，使树脂与反应也充分接触，吸附反应液中的阳离子。

45、反应产物点样：核酸质谱点样的基质配制：使用乙腈溶液将3-羟基-2-吡啶甲酸(3-hydroxypicolinic acid，3hpa)配制成50mg/ml；柠檬酸氢二胺(ammonium citratedibasic,acd)配制成终浓度250mm/ml；最后，3hpa：acd按照10:1的体积比配制为最终使用的核酸质谱点样基质溶液。基质包被：将约1μl基质溶液包被在质谱检测靶板中央，室温静置约2分钟。核酸样本点样：将1μl反应产物，点样至已包被基质的靶板，室温静置约2分钟后，准备使用质谱仪进行检测。

46、质谱检测：使用axima质谱仪检测上述反应产物，maldi-ms软件分析检测结果。

47、结果判读：检测结果的判定。若检测结果为阳性，则会在相应靶基因的阳性产物荷质比处出现特异的产物峰(阳性产物荷质比见表2)；若检测结果为阴性，则会在相应靶基因的初始荷质比处出现特异的产物峰(初始产物荷质比见表2)。综合各个靶标的阳性特异产物峰的检测情况，判定样本的ie相关病原体检出情况。

48、本发明所述的检测，用于非诊断疾病的目的。

49、本发明的另一个目的还在于，提供一种用于ie相关病原体检测试剂的设计方法，包括以下步骤：

50、(1)检测靶点的选择：选取种间特异、种内保守的基因或区域作为ie相关病原体的靶基因，选择能准确将ie相关病原鉴定的区域作为检测靶标，同时选择hbb基因作为对照用于监测样本核酸提取情况。

51、(2)引物及探针设计：使用引物设计软件针对上述分析得到的靶基因保守区域序列设计特异性的扩增引物与探针，设计结果必须满足每一个靶基因，检测试剂各项标准的罚分不能够超过软件设定界值的条件。如果不满足该条件，需要根据软件提示，重新对设计不理想靶基因的保守区进行选择。经过多次尝试，最终获得能准确检测ie相关病原体的最佳引物与探针。

52、(3)多重检测引物组及探针的确定：使用ncbi提供的在线引物验证工具primer-blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer blast/)对试剂进行评价，验证引物的特异性。选择能准确鉴定ie相关病原体，区分ie相关病原体的最佳引物对与探针组合，形成最终的单孔21重的质谱分析体系。

53、本发明进一步提供一种可用于ie病原体质谱检测结果可视化分析的平台，所述平台兼顾质谱结果包含ie相关病原体标注的同时，对样本的鉴定结果进行判读(图2)。所述可用于ie病原体质谱检测结果可视化分析的平台http://mgc.ac.cn/zhousy/daojin.html。

54、本发明进一步提供一种用于ie患者血液、心脏赘生物，以及唾液样本中ie相关病原体检测的方法。

55、本发明方法，能够快速、特异和灵敏地从临床样本中检测ie相关病原，提供了一种用于ie相关病原体检测试剂设计的检测方法与试剂。与此同时，提供了一个可用于ie相关病原体质谱检测结果更为便捷、直观展示的分析平台，为样本检测与分析带来了便利。

56、对于文中出现的术语，在此作进一步的解释和说明：

57、引物：涉及引物均使用page方法进行制备。使用加油m尿素的16％的聚丙酰胺凝胶进行电泳。跑胶后，用荧光tlc板在紫外灯下检测带型，在主带下没有条带，说明纯度良好。

58、探针：涉及的探针通常使用hplc法制备和纯化。

59、rpm：转速

60、pcr:聚合酶链式反应

61、sap:虾碱性磷酸酶

62、reaction mix：反应预混液

63、qiaamp dna mini kit：dna提取试剂盒

64、taq mix：聚合酶

65、dntp：一步法扩增反应的寡核苷酸

66、单碱基延伸buffer：单碱基延伸反应使用缓冲液

67、本发明相对于现有技术，优点如下：

68、1、基于核酸质谱建立了一种可用ie相关病原体检测的快速，便捷的检测方法，该方法无需依赖细菌培养，可直接用于临床样本检测；

69、2、该方法覆盖了包含细菌和病毒病原在内的近二十余种病原检测，且在一孔中完成，显著的提高了检测效率，降低了检测成本，缓解了患者的疾病负担。

技术特征：

1.用于检测ie相关病原体的专用引物和探针，其特征在于，选自21套引物组与21个探针组成的组中的一组或多组，其中，所述21组引物组与21个探针的核苷酸序列为seq idno.1-seq id no.63所示；所述21套引物组与21个探针组成的组中每一组包括一对引物组和探针，一对引物组由两条引物组成，一条为正向引物，一条为反向引物。

2.根据权利要求1所述的专用引物和探针，其特征在于，其中，所述每一组包括一对引物组和探针，选自，seq id no.1-3；seq id no.4-6；seq id no.7-9；seq id no.10-12；seqid no.13-15；seq id no.16-18；seq id no.19-21；seq id no.22-24；seq id no.25-27；seq id no.28-30；seq id no.31-33；seq id no.34-36；seq id no.37-39；seq id no.40-42；seq id no.43-45；seq id no.46-48；seq id no.49-51；seq id no.52-54；seq idno.55-57；seq id no.58-60；seq id no.61-63中的一组或多组。

3.根据权利要求2所述的专用引物和探针，其特征在于，其中，seq id no.1-3中，seqid no.1为正向引物，seq id no.2为反向引物，seq id no.3为探针；seq id no.4-6中，seqid no.4为正向引物，seq id no.5为反向引物，seq id no.6为探针；seq id no.7-9中，seqid no.7为正向引物，seqid no.8为反向引物，seq id no.9为探针；seq id no.10-12中，seq idno.10为正向引物，seq id no.11为反向引物，seq id no.12为探针；seqid no.13-15中，seq id no.13为正向引物，seq id no.14为反向引物，seqid no.15为探针；seq idno.16-18中，seq id no.16为正向引物，seq idno.17为反向引物，seq id no.18为探针；seq id no.19-21中，seq idno.19为正向引物，seq id no.20为反向引物，seq id no.21为探针；seqid no.22-24中，seq id no.22为正向引物，seq id no.23为反向引物，seqidno.24为探针；seq id no.25-27中，seq id no.25为正向引物，seq idno.26为反向引物，seq id no.27为探针；seq id no.28-30中，seq idno.28为正向引物，seq id no.29为反向引物，seq id no.30为探针；seqid no.31-33中，seq id no.31为正向引物，seq id no.32为反向引物，seqid no.33为探针；seq id no.34-36中，seq id no.34为正向引物，seqidno.35为反向引物，seq id no.36为探针；seq id no.37-39中，seq idno.37为正向引物，seq id no.38为反向引物，seq id no.39为探针；seqid no.40-42中，seq id no.40为正向引物，seq id no.41为反向引物，seqid no.42为探针；seq id no.43-45中，seq id no.43为正向引物，seq idno.44为反向引物，seq id no.45为探针；seq id no.46-48中，seqidno.46为正向引物，seq id no.47为反向引物，seq id no.48为探针；seqid no.49-51中，seq id no.49为正向引物，seq id no.50为反向引物，seqid no.51为探针；seq id no.52-54中，seq id no.52为正向引物，seq idno.53为反向引物，seq id no.54为探针；seq idno.55-57中，seq idno.55为正向引物，seq id no.56反向引物，seq id no.57为探针；seqidno.58-60中，seq id no.58为正向引物，seq id no.59为反向引物，seq idno.60为探针；seq id no.61-63中，seq id no.61为正向引物，seq idno.62为反向引物，seq id no.63为探针。

4.一种用于检测ie相关病原体的试剂盒，包括权利要求1所述专用引物组和探针组成的组中的任何一组或多组。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述权利要求1所述专用引物组和探针组成的组中的任何一组或多组选自seq id no.1-seq id no.63专用引物组和探针组成的组中的任何一组或多组。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，所述权利要求1所述专用引物组和探针组成的组中的任何一组或多组选自权利要求2所述专用引物组和探针组成的组中的任何一组或多组。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，所述权利要求1所述专用引物组和探针组成的组中的任何一组或多组选自权利要求3所述专用引物组和探针组成的组中的任何一组或多组。

8.根据权利要求4所述的试剂盒，其中还包括多重pcr反应组分，虾碱性磷酸酶反应组分，单碱基延伸反应组分，阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为各检测靶点的野生型或突变型阳性样本，所述阴性对照为ddh2o。

9.权利要求1所述的专用引物和探针在制备检测ie相关病原体的试剂盒中的应用。

10.权利要求4所述的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

11.一种可用于ie病原体质谱检测结果可视化分析的平台http://mgc.ac.cn/zhousy/daojin.html，兼顾质谱结果包含ie相关病原体标注的同时，对样本的鉴定结果进行判读。

12.一种用于ie患者血液、心脏赘生物，以及唾液样本中ie相关病原体检测的方法。

技术总结
本申请涉及感染性心内膜炎相关病原体的多重检测及试剂盒，所述检测采用SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.63所示的专用引物和探针，本申请在兼顾IE相关病原体检测方法的同时，提供了一种可用于质谱结果便捷、直观判读的分析平台。此外，本申请还提供了一种引物组和探针，和包含病原体检测的试剂盒，所述的引物组、探针与试剂盒均可用于实施本发明的方法。

技术研发人员：彭俊平,李晓东,孙立莹,雷雅娟
受保护的技术使用者：岛津企业管理（中国）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23