固体化自微乳疫苗的制备与应用

本发明属于生物医药领域，具体地，涉及吸入用脂质纳米凝胶的制备与应用，更具体地，涉及纳米载体、疫苗、制备纳米载体的方法、制备疫苗的方法、药物组合物以及药物组合物在制备药物中的用途。

背景技术：

1、疫苗最早主要用于预防感染性疾病。随着对疫苗研究的深入，疫苗被用来预防或治疗更多疾病，例如肿瘤。肿瘤疫苗可分为四类：细胞疫苗、多肽疫苗、病毒疫苗、核酸疫苗。肿瘤疫苗通过装载不同形式的肿瘤抗原进入体内激活病人的细胞免疫和体液免疫最终达到消灭肿瘤的目的。其中，多肽疫苗由肿瘤抗原表位和佐剂组成。抗原表位的免疫优势使多肽疫苗能够激活更专注的免疫应答。然而，目前多肽疫苗的研发大部分仍处于临床前和临床试验的阶段。多肽疫苗面临的主要挑战归纳为以下几方面：(1)疫苗在引流淋巴结中的回流少；(2)抗原提呈细胞对疫苗的摄取弱；(3)细胞内抗原交叉提呈差以及抗原表位和佐剂的选择。上述原因限制了肿瘤多肽疫苗的发展及应用。

2、现阶段大多数处于临床试验中的肿瘤多肽疫苗使用的佐剂为montanide。它是一种具有佐剂功能的抗原载体，可通过延长抗原释放时间、招募抗原提呈细胞以及淋巴细胞等途径增强免疫应答。然而，临床数据统计，使用montanide伴随着高频率的副作用，包括肌肉痛、发烧、头痛、胃肠道紊乱等。同时，montanide长时间停留在注射位点的特性诱导无效能t细胞从而削弱多肽肿瘤疫苗的治疗效果。

3、临床前研究也在不断地优化能够用于多肽肿瘤疫苗的递送载体。包括纳米盘和白蛋白结合载体。纳米盘是一种粒径在10nm左右可装载肿瘤抗原和佐剂的纳米材料，在小鼠体内能够诱导产生20～30％的抗原特异性t细胞。而使用montanide装载相同的肿瘤抗原和佐剂仅诱导产生2％左右的抗原特异性t细胞。白蛋白结合载体是一种基于白蛋白能够靶向到淋巴结的特质，用亲脂结构修饰抗原和佐剂进而结合体内白蛋白达到增强疫苗在淋巴结回流的目的。通过优化用于修饰抗原和佐剂的亲脂结构，最终在小鼠体内能够诱导20～30％的抗原特异性t细胞。然而，无论是纳米盘还是白蛋白，其固有的组成-结构关系决定了难以通过组分的改变对其表面性质进行连续调控，这在一定程度上制约了多肽疫苗的递送效率和可以激活的免疫应答的强度。

4、因此，本领域亟需设计一种新型多肽疫苗的递送系统，增强疫苗抗肿瘤效果，从而提高多肽疫苗投入市场应用的可能性。

技术实现思路

1、本技术是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

2、为了解决目前递送载体存在副作用高、抗原特异性t细胞激活效率低等问题，本技术通过开发新型的多肽疫苗递送系统，制备一种高效、低毒、便于制备和储存的肿瘤多肽疫苗。发明人基于固体化自乳化药物递送系统提供了一种表面性质连续可调的装载肿瘤抗原和免疫佐剂的纳米颗粒。通过体外实验证实了该疫苗制备技术能够形成稳定均一的粒径大小在20nm左右的递送载体。实现了通过简易方法制备一种高效，易储存的肿瘤多肽疫苗载体。

3、在本发明的第一方面，本发明提出了一种纳米载体。根据本发明的实施例，所述纳米载体包括：纳米球内核，所述纳米球内核包括角鲨烯；以及纳米球外壳，所述纳米球外壳包括：表面活性剂；所述纳米球内核与纳米球外壳通过疏水作用结合。根据本发明的实施例，采用纳米载体递送系统可以为佐剂的过早降解提供保护，并具有良好的稳定性。在包裹或包被抗原时，纳米载体还可以保护免疫原免于过早被蛋白酶水解。

4、根据本发明的实施例，上述纳米载体还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：

5、根据本发明的实施例，所述表面活性剂选自聚乙二醇琥珀酸酯、吐温80、丙二醇单月桂酸酯、聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯、丙二醇辛酸酯等非离子表面活性剂中的至少之一。

6、根据本发明的实施例，所述表面活性剂选自聚乙二醇琥珀酸酯和吐温80混合物。在本发明的实施例中，选择聚乙二醇琥珀酸酯和吐温80作为表面活性剂可以增强组织渗透和细胞吞噬效果。

7、根据本发明的实施例，所述聚乙二醇琥珀酸酯和吐温80混合物的质量比为1:6到6:1。

8、根据本发明的实施例，所述角鲨烯与表面活性剂质量比为1:3.5-1:10，优选1:7。发明人发现，所述角鲨烯与表面活性剂比例对体内组织分布和免疫应答有显著影响。在优选的比例范围内，在所述质量比条件下递送载体显著提高了疫苗在引流淋巴结中的蓄积，并诱导产生80％左右的抗原特异性t细胞，治愈肿瘤，且能预防肿瘤的复发。

9、在本发明的第二方面，本发明提出了一种疫苗。根据本发明的实施例，所述疫苗包括本发明第一方面所述的纳米载体、待负载抗原以及佐剂。

10、根据本发明的实施例，所述疫苗可以增强抗肿瘤t细胞免疫应答进而提高治疗效果。

11、根据本发明的实施例，上述疫苗还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：

12、根据本发明的实施例，所述待负载抗原预先经过磷脂修饰。发明人发现，经过磷脂修饰后的抗原可以避免过早被降解。经磷脂修饰后的抗原具有两亲性，能够插在纳米颗粒表面形成稳定的纳米结构。

13、根据本发明的实施例，所述待负载抗原与所述角鲨烯质量比不高于4μg:1mg。根据本发明的实施例，采用上述质量比可以保证纳米载体粒径在20nm范围。

14、根据本发明的实施例，所述磷脂选自dope、dmpe、dppe、dspe中的至少之一。

15、根据本发明的实施例，所述磷脂为dope。

16、根据本发明的实施例，所述抗原选自e7、trp1、trp2、m27、m30中的至少之一。

17、根据本发明的实施例，所述抗原为e7。

18、根据本发明的实施例，所述佐剂选自胆固醇修饰的cpg或poly ic、r837，mpla及其衍生物中的至少之一。采用本技术所述佐剂能够增强免疫原性，使得免疫细胞更容易识别和攻击病原体，从而提高疫苗的免疫效果。

19、根据本发明的实施例，所述佐剂为胆固醇修饰的cpg。根据本发明的实施例，采用胆固醇修饰的cpg佐剂可以诱发机体产生长期、高效的特异性免疫反应，提高机体保护能力，同时又能减少免疫物质的用量，降低疫苗的生产成本。

20、根据本发明的实施例，所述抗原与所述佐剂质量比为1:1。

21、在本发明的第三方面，本发明提出了一种制备纳米载体的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将角鲨烯、表面活性剂、助溶剂进行第一混合处理；将第一混合处理产物与甘露醇与进行第二混合处理；以及将第二混合处理产物与水进行第三混合处理，以便获得所述纳米载体。根据本发明的实施例，所述制备方法相对于其他t细胞疗法如car-t、tcr-t等疗法高昂的价格和严苛的生产流程，采用本方法制备的纳米载体抗原特异性t细胞产生效率高达80％，工艺简单且成本更低。

22、根据本发明的实施例，所述助溶剂选自乙醇、二甲基亚砜、丙酮中的至少之一。

23、根据本发明的实施例，所述助溶剂为乙醇。

24、根据本发明的实施例，上述制备纳米载体的方法还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：

25、根据本发明的实施例，所述第一混合处理是通过如下方式进行的：将所述表面活性剂与所述角鲨烯进行第四混合处理；将第四混合处理产物与乙醇进行第五混合处理。

26、根据本发明的实施例，所述第四混合处理是在50℃进行5～10分钟。采用前述时间与温度可以保证表面活性剂与角鲨烯充分混合。

27、根据本发明的实施例，所述第二混合处理之后、第三混合处理之前，进一步包括将所述第二混合处理产物进行蒸发处理。根据本发明的实施例，将乙醇进行蒸发处理可以防止其对动物模型实验的干扰。

28、根据本发明的实施例，所述蒸发处理是在40℃条件下进行4～6小时。根据本发明的实施例，采用上述蒸发温度与蒸发时间可以保证乙醇完全挥发而不影响其它物质的性质。

29、根据本发明的实施例，所述表面活性剂与所述角鲨烯质量比为1:3.5-1:10。发明人通过实验验证发现，获得稳定的20nm左右的载体，表面活性剂与所述角鲨烯质量比应在为1:3.5-1:10范围内。

30、根据本发明的实施例，所述表面活性剂与所述角鲨烯质量比为7:1。根据本发明的实施例，实验验证发现表面活性剂与角鲨烯质量比为7:1能够获得稳定的20nm左右粒径的纳米载体(图2)。

31、根据本发明的实施例，所述角鲨烯与所述乙醇的质量体积比为1mg:8μl。

32、根据本发明的实施例，所述乙醇和二甲基亚砜的混合液中，所述乙醇与所述二甲基亚砜体积比不低于4：1。实验验证二甲基亚砜的含量越低，对纳米载体的粒径影响越小。

33、根据本发明的实施例，所述甘露醇与所述乙醇质量体积比不低于1.5mg:1μl。

34、在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备疫苗的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将待负载抗原、表面活性剂、角鲨烯、助溶剂进行第一混合处理；将第一混合处理产物与甘露醇与进行第二混合处理；以及将第二混合处理产物与含佐剂的水溶液进行第三混合处理，以便获得所述疫苗。

35、根据本发明的实施例，上述制备纳米载体以及疫苗的方法还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：

36、根据本发明的实施例，所述表面活性剂选自聚乙二醇琥珀酸酯、吐温80、丙二醇单月桂酸酯、聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯、丙二醇辛酸酯等非离子表面活性剂中的至少之一。

37、根据本发明的实施例，所述表面活性剂选自聚乙二醇琥珀酸酯和吐温80混合物。

38、根据本发明的实施例，所述助溶剂选自乙醇、二甲基亚砜、丙酮中的至少之一。

39、根据本发明的实施例，所述助溶剂为乙醇和二甲基亚砜(dmso)混合液。

40、根据本发明的实施例，所述甘露醇的粒径为200微米。根据本发明的实施例，采用粒径为200微米的甘露醇可以很好的吸附上述纳米载体。

41、根据本发明的实施例，所述佐剂选自胆固醇修饰的cpg或poly ic、r837，mpla及其衍生物中的至少之一。根据本发明的实施例，上述佐剂在抗感染和肿瘤辅助治疗方面具有良好的疗效。

42、根据本发明的实施例，所述佐剂为胆固醇修饰的cpg。根据本发明的实施例，采用胆固醇修饰的cpg佐剂可以诱发机体产生长期、高效的特异性免疫反应，提高机体保护能力，同时又能减少免疫物质的用量，降低疫苗的生产成本。

43、根据本发明的实施例，所述佐剂与所述甘露醇的质量比为1ug:3mg-1ug:20mg，优选1ug:3.6mg。

44、根据本发明的实施例，上述制备纳米载体以及疫苗的方法还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：

45、根据本发明的实施例，所述方法进一步包括将第三混合处理产物进行透析以及浓缩处理，以便获得所述纳米载体或疫苗。

46、根据本发明的实施例，所述透析处理包括将经过均匀处理的第三混合处理产物在透析缓冲液中进行透析处理。

47、根据本发明的实施例，所述透析缓冲液选自pbs缓冲液或0.9％的nacl溶液或10％的蔗糖溶液中的至少之一。

48、根据本发明的实施例，所述透析缓冲液为pbs溶液的ph为7.2～7.4；所述pbs浓度为0.01mol/l。

49、根据本发明的实施例，所述透析处理的温度为4℃。根据本发明的实施例，采用4℃透析可以最大限度地保持生物大分子的活性。

50、根据本发明的实施例，所述透析处理的时间为3～5小时。

51、根据本发明的实施例，上述制备疫苗的方法还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：

52、根据本发明的实施例，所述待负载抗原与所述角鲨烯质量比不高于4μg:1mg。根据本发明的实施例，当负载抗原为e7时，抗原与所述角鲨烯质量比不高于4μg:1mg才能够制备20nm左右的肿瘤抗原疫苗。

53、根据本发明的实施例，所述待负载抗原预先经过磷脂修饰。磷脂修饰后的负载抗原具有两亲性能够插在纳米载体表面形成稳定的纳米结构。

54、根据本发明的实施例，所述磷脂选自dope、dmpe、dppe、dspe中的至少之一。

55、根据本发明的实施例，所述磷脂为dope。

56、根据本发明的实施例，所述抗原选自e7、trp1、trp2、m27、m30中的至少之一。

57、根据本发明的实施例，所述抗原为e7。

58、在本发明的第五方面，本发明提出了一种疫苗。根据本发明的实施例，所述疫苗由本发明第四方面所述的方法获得。发明人发现，通过本发明所述方法制备的疫苗能够显著激活强效的抗原特异性cd8+t细胞应答。

59、在本发明的第六方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括本发明第五方面所述的疫苗。发明人发现，所述药物组合物在给药后在体内能够引起刺激其相应的信号传导，增强抗肿瘤t细胞免疫应答进而提高治疗效果，且具有较高的安全性。

60、根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括：药学上可接受的载体或辅料。

61、在本发明的第七方面，本发明提出了第五方面所述疫苗或第六方面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防疾病。

62、本发明所述的疫苗或药物组合物制备的药物可以通过改变组分对其表面性质进行连续调控，通过调整表面活性剂(聚乙二醇琥珀酸酯(tpgs)和吐温80(tw80))、油相(角鲨烯)、助溶剂(二甲基亚砜和乙醇)的配比，可以提高不同类型的抗原和佐剂的递送效率，增强激活的免疫应答的强度。

63、据本发明的实施例，所述疾病包括癌症和感染性疾病。

64、根据本发明的实施例，所述癌症包括黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌。

65、根据本发明的实施例，所述感染性疾病包括人乳头状病毒hpv引起的肿瘤、冠状病毒引起的呼吸道感染性疾病。

66、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

技术特征：

1.一种纳米载体，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述表面活性剂选自聚乙二醇琥珀酸酯、吐温80、丙二醇单月桂酸酯、聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯、丙二醇辛酸酯等非离子表面活性剂中的至少之一；

3.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述角鲨烯与表面活性剂的质量比为1:3.5-1:10，优选1:7。

4.一种疫苗，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的纳米载体、待负载抗原以及佐剂。

5.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述待负载抗原预先经过磷脂修饰；

6.一种制备纳米载体的方法，其特征在于，包括：将角鲨烯、表面活性剂、助溶剂进行第一混合处理；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一混合处理是通过如下方式进行的：

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂与所述角鲨烯质量比为1:3.5-1:10；

9.一种制备疫苗的方法，其特征在于，包括：将待负载抗原、表面活性剂、角鲨烯、助溶剂进行第一混合处理；

10.根据权利要求6或9所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂选自聚乙二醇琥珀酸酯、吐温80、丙二醇单月桂酸酯、聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯、丙二醇辛酸酯等非离子表面活性剂中的至少之一；

11.根据权利要求6或9所述的方法，其特征在于，进一步包括将第三混合处理产物进行透析以及浓缩处理，以便获得所述纳米载体或疫苗；

12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述待负载抗原与所述角鲨烯质量比不高于4μg:1mg；

13.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗由权利要求9～12任一项所述的方法获得。

14.一种药物组合物，其特征在于，包括：权利要求13所述的疫苗；

15.权利要求13所述的疫苗或权利要求14所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防疾病。

16.根据权利要求15所述的用途，其特征在于，所述疾病包括癌症和感染性疾病；

技术总结
本发明提出了一种纳米载体，所述纳米载体包括：纳米球内核，所述纳米球内核包括角鲨烯；以及纳米球外壳，所述纳米球外壳包括：表面活性剂；所述纳米球内核与纳米球外壳通过疏水作用结合。本发明制备的纳米载体表面性质可进行连续调控，由其制备的疫苗具有高效、低毒、便于制备和储存等优点。克服了传统抗原载体抗原特异性T细胞诱导效率低等弊端。

技术研发人员：蒯锐,沈雪莹,何嘉
受保护的技术使用者：清华大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23