可卡因酯酶多位点突变体及其应用

本申请属于水解酶类医药制品，特别是可卡因酯酶多位点突变体及其应用。

背景技术：

1、可卡因滥用成瘾是重要的医学和社会问题。可卡因的使用导致肾上腺素、去甲肾上腺素、血清素和多巴胺等神经递质释放的异常变化，通过作用于相应的受体引发一系列分子事件，进而造成急性毒性和成瘾。在人体内，可卡因的半衰期仅为1小时至2小时，很快被代谢为其他有强烈生理效应的化合物，例如苯甲酰芽子碱(benzoylecgonine，bze)。bze比可卡因的体内半衰期更长，约7小时，其是造成可卡因长期毒性的主要物质。因此，可卡因毒性的理想疗法不仅应使可卡因本身解毒，还应解除其长期代谢产物bze的毒性。

2、现有技术使用的成瘾治疗药理学方法，包括所有目前可用的成瘾疗法，存在影响大脑受体/转运蛋白的正常功能或不能防止复发的问题，至今并没有获得任何成功。bresler等人公布了从rhodococcus sp.(strain mb1 bresler)中克隆到与内源性丁酰胆碱酯酶(butyrylcholinesterase，bche)作用类似的可卡因酯酶(cocaine esterase,coce)，coce水解可卡因产生芽子碱甲酯和安息香酸。同时，因coce可以用原核细胞表达系统经济高效地表达，其改造成本低且验证周期较短，使得以其为代表的长效酶方法成为一种有前途的新型疗法。

3、针对coce的低热稳定性，公开号：cn101583374b，名称：抗可卡因组合物和治疗，其公开了热稳定化的coce突变体，例如t172r/g173q的突变体。针对coce的低催化效率，本申请的申请人在先的发明专利，公开号：cn113481182b，名称：可卡因酯酶突变体及其应用，该申请公开了可卡因酯酶突变体为t172r/g173q/l196c/i301c，或者再增加v116k点突变，或者再增加a51位点突变为l、y、v、f或w。该发明筛选到的可卡因酯酶突变体对可卡因及可卡因有毒代谢物苯甲酰芽子碱的催化效率相对于野生型酶大大提高。

4、但可卡因酯酶突变体治疗可卡因中毒的实际临床应用中还存在一个潜在问题，如图1所示，可卡因、bze和内源性神经递质乙酰胆碱(acetylcholine，ach)具有结构相似性(阳离子氮和反应性酯官能团)。乙酰胆碱是一种传出神经系统递质，假如乙酰胆碱系统异常，将产生多种疾病，甚至是致命的中毒反应。综上，可卡因彻底解毒的疗法在有效降低可卡因及苯甲酰芽子碱毒性的基础上，还应不影响人体内乙酰胆碱含量。进一步开发改造coce，使其在水解可卡因和bze方面表现出高催化特异性，对于可卡因彻底解毒治疗具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的技术问题，为此，本申请提出了新的可卡因酯酶多位点突变体。

2、第一方面，本申请提出的可卡因酯酶多位点突变体的氨基酸序列为如seq id no:1所示的氨基酸序列经t172r/g173q/l196c/i301c/v116k/a51k或t172r/g173q/l196c/i301c/v116k/a51r突变后的氨基酸序列。

3、第二方面，本申请提出的可卡因酯酶基因，所述可卡因酯酶基因编码如上所述的可卡因酯酶多位点突变体。

4、第三方面，本申请提出的含可卡因酯酶基因的表达载体，所述基因为上述的可卡因酯酶基因。

5、第四方面，本申请提出的含可卡因酯酶基因的细胞，所述细胞为含有上述的可卡因酯酶基因的重组表达细胞。

6、第五方面，本申请提出的可卡因酯酶多位点突变体的应用，上述的突变体用于制备能够水解可卡因和/或苯甲酰芽子碱的组合物。

7、特别的，所述组合物为治疗可卡因中毒的药物。

8、上述技术方案具有如下优点或有益效果：本申请在现有技术的基础上，将可卡因酯酶第51位的a(丙氨酸)突变成r(精氨酸)或者k(赖氨酸)后获得的a51r或a51k突变体对可卡因有毒代谢物苯甲酰芽子碱的催化效率相对于野生型酶大大提高，并且对ach催化效率大幅降低。突变体与现有技术的高活性水解酶v116k相比，催化苯甲酰芽子碱水解活性相似，且对ach水解活性明显降低，催化特异性大幅提高。

技术特征：

1. 可卡因酯酶多位点突变体，其特征在于：所述突变体的氨基酸序列为如seq id no:1所示的氨基酸序列经t172r/g173q/l196c/i301c/v116k/a51k或t172r/g173q/l196c/i301c/v116k/a51r突变后的氨基酸序列。

2.可卡因酯酶基因，其特征在于：所述可卡因酯酶基因编码如权利要求1所述的可卡因酯酶多位点突变体。

3.含可卡因酯酶基因的表达载体，其特征在于：所述基因为权利要求2所述的可卡因酯酶基因。

4.含可卡因酯酶基因的细胞，其特征在于：所述细胞为含有如权利要求2或3所述的可卡因酯酶基因的重组表达细胞。

5.可卡因酯酶多位点突变体的应用，其特征在于：如权利要求1所述的突变体用于制备能够水解可卡因和/或苯甲酰芽子碱的组合物。

6.根据权利要求5所述的可卡因酯酶多位点突变体的应用，其特征在于：所述组合物为治疗可卡因中毒的药物。

技术总结
本申请属于水解酶类医药制品技术领域，特别是可卡因酯酶多位点突变体及其应用，所述可卡因酯酶多位点突变体的氨基酸序列为野生型的序列经T172R/G173Q/L196C/I301C/V116K/A51K或T172R/G173Q/L196C/I301C/V116K/A51R突变后的氨基酸序列。本申请在现有技术的基础上，将可卡因酯酶第51位的丙氨酸突变为精氨酸或赖氨酸，所述两种突变体对可卡因有毒代谢物苯甲酰芽子碱的催化效率相对于野生型酶大大提高，并且对ACh催化效率大幅降低，催化特异性大幅提高。

技术研发人员：张云,邓荇予,陈侠斌,侯书荣,童骏森
受保护的技术使用者：杭州师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23