抗MUC17*CD3*CD28三特异性抗体的制作方法

本发明涉及抗体领域，具体地涉及一种抗muc17*cd3*cd28三特异性抗体。

背景技术：

1、据世界卫生组织iarc发布的《2020世界癌症报告》中数据显示，2020年全球新发癌症病例1929万例，仅中国新发癌症就有457万人，占全球23.7％，中国癌症新发人数远超世界其他国家。2020年，我国癌症病病种中，癌症病种最高的前10位分别是：肺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、食管癌、宫颈癌、甲状腺癌、子宫癌、前列腺癌。肺癌为患病率最高的癌症，结直肠癌和胃癌紧随其后，分别占比12.3％和10.5％。因此，寻找和探索胃肠道肿瘤相关治疗靶点用于开发更加有效的临床治疗药物，具有重大临床意义。

2、muc17是一种分子量较大的o-糖基化黏蛋白(mucins)，与其它几种黏蛋白(muc1、3、12、13和16)同属于sea家族的跨膜黏蛋白。临床癌症研究数据表明，muc17在多种消化道肿瘤(包括胃癌和结直肠癌)中高表达，这使muc17成为潜在的消化道肿瘤相关靶点。

3、双特异性t细胞衔接子(bispecific t-cell engagers，bites)是一种双特异型抗体，它由两类抗体的片段融合而成，分别可以结合t细胞表面的cd3分子以及肿瘤细胞表面抗原分子，从而诱导t细胞对肿瘤细胞的杀伤，此过程不受mhc限制。目前这一疗法在血液系统恶性肿瘤中效果较好，其中一种cd3×cd19的bite，blinatumomab，已经被fda批准用于b细胞恶性肿瘤的治疗。由于实体瘤存在的物理屏障以及免疫抑制微环境，bites在多种实体肿瘤的临床治疗中没有达到预期效果。

4、因此，本领域亟待提供一种能克服bites缺陷的新型t细胞衔接子，例如能够靶向肿瘤特异性抗原muc17的三特异性t细胞衔接子(trispecific t-cell engagers,trites)。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种抗muc17*cd3*cd28三特异性抗体。

2、本发明的目的在于提供一种三特异性t细胞衔接子(trites)，靶向的肿瘤特异性抗原为muc17，同时靶向t细胞表达的cd3和共刺激分子cd28。

3、在本发明的第一方面，提供了一种多特异性t细胞衔接子(t-cell engagers)，所述多特异性t细胞衔接子包含：

4、第一靶向结构域d1，所述d1与选自下组的靶蛋白结合：cd3、cd28、cd40、cd137；

5、任选的第二靶向结构域d2，所述d2与选自下组的靶蛋白结合：cd3、cd28、cd40、cd137；和

6、第三靶向结构域d3，所述d3包含一个或多个muc17抗原结合结构域。

7、在另一优选例中，所述d1、d2或d3各自独立地选自：单域抗体(sdab)、fab、fab'、f(ab')2、trifab、fv片段、片段可变(fv)异二聚体、单链fv(scfv)片段、双抗体(diabody)、双特异性t细胞接合器(bite)或单结构域片段，优选为单链fv(scfv)、fv片段或fab片段。

8、在另一优选例中，所述muc17抗原结合结构域包含第三重链可变区和第三轻链可变区，其中，所述第三重链可变区包含如下三个重链可变区cdr：

9、h-cdr1，其具有如seq id no:3所示的氨基酸序列；

10、h-cdr2，其具有如seq id no:4所示的氨基酸序列；和

11、h-cdr3，其具有如seq id no:5所示的氨基酸序列；以及

12、所述第三轻链可变区包含如下三个轻链可变区cdr：

13、l-cdr1，其具有如seq id no:6所示的氨基酸序列；

14、l-cdr2，其具有如seq id no:7所示的氨基酸序列；和

15、l-cdr3，其具有如seq id no:8所示的氨基酸序列。

16、在另一优选例中，所述muc17抗原结合结构域包含如seq id no:1或9所示的第三重链可变区，和如seq id no:2或10所示的第三轻链可变区。

17、在另一优选例中，所述muc17抗原结合结构域包含与如seq id no:1或9所示的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的第三重链可变区(其中cdr序列不变或基本不变)；和与如seq id no:2或10所示的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的第三轻链可变区(其中cdr序列不变或基本不变)。

18、在另一优选例中，所述第二靶向结构域选自下组：cd3抗原结合结构域、cd28抗原结合结构域、cd40抗原结合结构域、cd137抗原结合结构域、cd40l序列、或cd137l序列。

19、在另一优选例中，所述第三靶向结构域选自下组：cd3抗原结合结构域、cd28抗原结合结构域、cd40抗原结合结构域、cd137抗原结合结构域、cd40l序列、或cd137l序列。

20、在另一优选例中，所述多特异性t细胞衔接子还包含fc片段。

21、在另一优选例中，所述fc片段来源于igg1或igg4。

22、在另一优选例中，所述fc片段为来源于igg1的fc片段。

23、在另一优选例中，所述来源于igg1的fc片段具有选自下组的突变：

24、n297a；

25、l234f/l235e/p331s；

26、y349c/k370e/k409d/k439e；

27、s354c/d356k/e357k/d399k；

28、s354c/t366w；

29、s354c/t366w/h435r/y436f；

30、y349c/t366s/l368a/y407v；

31、l234f/l235e/p331s/y349c/k370e/k409d/k439e；

32、l234f/l235e/p331s/s354c/d356k/e357k/d399k；

33、l234f/l235e/p331s/s354c/t366w；

34、l234f/l235e/p331s/y349c/t366s/l368a/y407v；

35、n297a/y349c/k370e/k409d/k439e；

36、n297a/s354c/d356k/e357k/d399k；

37、n297a/s354c/t366w；

38、n297a/y349c/t366s/l368a/y407v；和/或

39、s267e；s267e/g236d；s267e/s239d；s267e/l328f。

40、在另一优选例中，所述来源于igg1的fc片段具有选自下组的突变：

41、l234a/l235a/g237a；

42、s354c/t366w；

43、s354c/t366w/h435r/y436f；

44、y349c/t366s/l368a/y407v。

45、在另一优选例中，所述多特异性t细胞衔接子为双/三特异性t细胞衔接子

46、在另一优选例中，所述多特异性t细胞衔接子为双特异性t细胞衔接子。

47、在另一优选例中，所述三特异性t细胞衔接子包含：

48、第一靶向结构域，所述第一靶向结构域为cd28抗原结合结构域；

49、第二靶向结构域，所述第二靶向结构域为cd3抗原结合结构域；和

50、第三靶向结构域，所述第三靶向结构域包含一个或多个muc17抗原结合结构域。

51、在另一优选例中，所述第一靶向结构域、第二靶向结构域和第三靶向结构域各包含一个或多个抗体可变区。

52、在另一优选例中，所述多特异性t细胞衔接子为三特异性t细胞衔接子。

53、在另一优选例中，所述多特异性t细胞衔接子为同源或异源二聚体。

54、在另一优选例中，所述三特异性t细胞衔接子为三特异性抗体。

55、在另一优选例中，所述三特异性抗体的结构对称或不对称。

56、在另一优选例中，所述三特异性抗体为二价、三价、四价或多价分子。

57、在另一优选例中，所述三特异性抗体为结构不对称的三价三特异性抗体。

58、在另一优选例中，所述cd3抗原结合结构域包含第二重链可变区和第二轻链可变区，其中，所述第二重链可变区包含如下三个重链可变区cdr：

59、h-cdr1，其具有如seq id no:17所示的氨基酸序列；

60、h-cdr2，其具有如seq id no:18所示的氨基酸序列；和

61、h-cdr3，其具有如seq id no:19所示的氨基酸序列；以及

62、所述第二轻链可变区包含如下三个轻链可变区cdr：

63、l-cdr1，其具有如seq id no:20所示的氨基酸序列；

64、l-cdr2，其具有如seq id no:21所示的氨基酸序列；和

65、l-cdr3，其具有如seq id no:22所示的氨基酸序列；或

66、所述第二重链可变区包含如下三个重链可变区cdr：

67、h-cdr1，其具有如seq id no:17所示的氨基酸序列；

68、h-cdr2，其具有如seq id no:18所示的氨基酸序列；和

69、h-cdr3，其具有如seq id no:51所示的氨基酸序列；以及

70、所述第二轻链可变区包含如下三个轻链可变区cdr：

71、l-cdr1，其具有如seq id no:20所示的氨基酸序列；

72、l-cdr2，其具有如seq id no:21所示的氨基酸序列；和

73、l-cdr3，其具有如seq id no:52所示的氨基酸序列。

74、在另一优选例中，所述cd3抗原结合结构域包含与如seq id no:15或23所示的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的第二重链可变区，和与如seq id no:16或24所示的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的第二轻链可变区。

75、在另一优选例中，所述cd3抗原结合结构域包含与如seq id no:15所示的第二重链可变区，和与如seq id no:16所示的第二轻链可变区；或如seq id no:23所示的第二重链可变区，和与如seq id no:24所示的第二轻链可变区。

76、在另一优选例中，所述cd28抗原结合结构域包含第一重链可变区和第一轻链可变区，其中所述第一重链可变区述包含如下三个重链可变区cdr：

77、h-cdr1，其具有如seq id no:30所示的氨基酸序列；

78、h-cdr2，其具有如seq id no:31或53所示的氨基酸序列；和

79、h-cdr3，其具有如seq id no:32所示的氨基酸序列；以及

80、所述第一轻链可变区包含如下三个轻链可变区cdr：

81、l-cdr1，其具有如seq id no:33所示的氨基酸序列；

82、l-cdr2，其具有如seq id no:34所示的氨基酸序列；和

83、l-cdr3，其具有如seq id no:35所示的氨基酸序列。

84、在另一优选例中，所述cd28抗原结合结构域包含与如seq id no:28或50所示的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的第一重链可变区，和与如seq id no:29所示的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的第一轻链可变区。

85、在另一优选例中，所述cd28抗原结合结构域包含与如seq id no:28或50所示的第一重链可变区，和与如seq id no:29所示的第一轻链可变区。

86、在另一优选例中，所述三特异性抗体为同源二聚体或异源二聚体。

87、在另一优选例中，所述第一靶向结构域和第二靶向结构域成异二聚体结构。

88、在另一优选例中，所述第一靶向结构域包含抗cd28 fv结构域、fab结构域或抗cd28 scfv结构域。

89、在另一优选例中，所述第二靶向结构域包含抗cd3 fv结构域、fab结构域或抗cd3scfv结构域。

90、在另一优选例中，所述第三靶向结构域包含抗muc17 fab结构域。

91、在另一优选例中，所述三特异性抗体从n端到c端包含如下所示的结构：

92、(a)第一链：vl1-l1-vh2-l2-vl2-l3-vh1-l4-fc1；

93、(b)第二链：vh3-ch1-fc2；和

94、(c)第三链：vl3-cl；

95、或所述三特异性抗体从n端到c端包含如下所示的结构：

96、(a)第一链：vl1-l1-vh1-l2-vl2-l3-vh2-l4-fc1；

97、(b)第二链：vh3-ch1-fc2；和

98、(c)第三链：vl3-cl；

99、其中，

100、vh1为第一重链可变区，vl1为第一轻链可变区；

101、vh2为第二重链可变区，vl2为第二轻链可变区；

102、vh3为第三重链可变区，vl3为第三轻链可变区；

103、cl为轻链恒定区，ch1为ch1结构域；

104、l1、l2、l3、l4各自独立地为无、键或接头；

105、fc1或fc2各自独立地为fc元件；

106、“-”代表肽键。

107、在另一优选例中，所述接头为刚性接头或柔性接头。

108、在另一优选例中，所述l1、l2、l3、l4各自独立地为无或(gs)n、(g3s)n、(g4s)n(n选自1-6)。

109、在另一优选例中，所述三特异性抗体与检查点抑制剂共同施用。

110、在另一优选例中，所述三特异性抗体与抗pd1和/或抗pdl1拮抗剂共同施用。

111、在另一优选例中，所述轻链恒定区为人kappa轻链恒定区。

112、在另一优选例中，所述vh1、vl1分别为cd28抗原结合结构域包含的第一重链可变区、第一轻链可变区。

113、在另一优选例中，所述vh2、vl2分别为cd3抗原结合结构域包含的第二重链可变区、第二轻链可变区。

114、在另一优选例中，所述vh3、vl3分别为muc17抗原结合结构域包含的第三重链可变区、第三轻链可变区。

115、在另一优选例中，所述vh1包含：氨基酸序列分别如seq id no:30、seq id no:31和seq id no:32所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；和所述vl1包含：氨基酸序列分别如seq idno:33、seq id no:34和seq id no:35所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或

116、所述vh1包含：氨基酸序列分别如seq id no:30、seq id no:53和seq id no:32所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；和所述vl1包含：氨基酸序列分别如seq id no:33、seq id no:34和seq id no:35所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3。

117、在另一优选例中，所述vh2包含：氨基酸序列分别如seq id no:17、seq id no:18和seq id no:19所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；和所述vl2包含：氨基酸序列分别如seq idno:20、seq id no:21和seq id no:22所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或

118、所述vh2包含：氨基酸序列分别如seq id no:17、seq id no:18和seq id no:51所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；和所述vl2包含：氨基酸序列分别如seq id no:20、seq id no:21和seq id no:52所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3。

119、在另一优选例中，所述vh3包含：氨基酸序列分别如seq id no:3、seq id no:4和seq id no:5所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；和所述vl3包含：氨基酸序列分别如seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3。

120、在另一优选例中，所述三特异性抗体中，

121、所述第一链的氨基酸序列如seq id no.38或42所示。

122、在另一优选例中，所述三特异性抗体中，

123、所述第二链的氨基酸序列如seq id no.40所示；和/或

124、所述第三链的氨基酸序列如seq id no.14所示。

125、在另一优选例中，所述三特异性抗体还包括所述三特异性抗体的活性片段和/或衍生物，所述抗体的衍生物具有与本发明的三特异性抗体至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。

126、在本发明的第二方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明的第一方面所述的多特异性t细胞衔接子。

127、在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明的第二方面所述的多核苷酸。

128、在另一优选例中，所述载体包括质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。

129、在本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的第三方面所述的载体或基因组中整合有本发明的第二方面所述的多核苷酸。

130、在另一优选例中，所述宿主细胞为真核细胞，优选地为哺乳动物细胞。

131、在本发明的第五方面，提供了一种制备如本发明的第一方面所述的多特异性t细胞衔接子的方法，包括步骤：

132、(i)在合适的条件下，培养本发明的第四方面所述的宿主细胞，获得含有如本发明的第一方面所述的多特异性t细胞衔接子的混合物；

133、(ii)对步骤(i)中得到的混合物进行纯化和/或分离，从而获得如本发明的第一方面所述的多特异性t细胞衔接子。

134、在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：

135、(i)如本发明的第一方面所述的多特异性t细胞衔接子；和

136、(ii)药学上可接受的载体。

137、在另一优选例中，所述药物组合物还包括其他的药学活性试剂。

138、在另一优选例中，所述其他的药学活性试剂包括一种或多种检查点调节剂或化疗剂。

139、在另一优选例中，所述检查点调节剂包括但不限于抗pd1和/或抗pdl1拮抗剂。

140、在另一优选例中，所述药物组合物为注射剂型。

141、在本发明的第七方面，提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包括：

142、(a)如本发明的第一方面所述的多特异性t细胞衔接子；和

143、(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。

144、在另一优选例中，所述偶联物部分选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如il-2等)、抗体、抗体fc片段、抗体scfv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒。

145、在本发明的第八方面，提供了如本发明的第一方面所述多特异性t细胞衔接子、如本发明的第六方面所述的药物组合物或如本发明的第七方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备(a)检测试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗癌症/肿瘤的药物。

146、在另一优选例中，所述癌症/肿瘤为muc17相关的癌症/肿瘤。

147、在另一优选例中，所述癌症/肿瘤包括实体瘤和血液肿瘤。

148、在另一优选例中，所述癌症/肿瘤为实体瘤。

149、在另一优选例中，所述癌症/肿瘤选自下组：胃癌、胃肠癌、结直肠癌、食管癌、胃食管癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、宫颈癌、甲状腺癌、子宫癌、前列腺癌或其组合。

150、在本发明的第九方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如本发明的第一方面所述的多特异性t细胞衔接子、如本发明的第二方面所述的多核苷酸、如本发明的第三方面所述的载体、如本发明的第四方面所述的宿主细胞、如本发明的第六方面所述的药物组合物或如本发明的第七方面所述的免疫偶联物。

151、在本发明的第十方面，提供了如本发明的第一方面所述的多特异性t细胞衔接子、如本发明的第二方面所述的多核苷酸、如本发明的第三方面所述的载体、如本发明的第四方面所述的宿主细胞、如本发明的第六方面所述的药物组合物或如本发明的第七方面所述的免疫偶联物在制备预防、治疗和/或检测癌症/肿瘤的药物中的用途。

152、在本发明的第十一方面，提供了一种预防、治疗和/或检测癌症/肿瘤的方法，向有需要的受试者施用安全有效量的如本发明的第一方面所述的多特异性t细胞衔接子、其药物组合物或其免疫偶联物。

153、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

技术特征：

1.一种多特异性t细胞衔接子(t-cell engagers)，其特征在于，所述多特异性t细胞衔接子包含：

2.如权利要求1所述的多特异性t细胞衔接子，其特征在于，所述muc17抗原结合结构域包含第三重链可变区和第三轻链可变区，其中，所述第三重链可变区包含如下三个重链可变区cdr：

3.如权利要求1所述的多特异性t细胞衔接子，其特征在于，所述多特异性t细胞衔接子为三特异性抗体，其从n端到c端包含如下所示的结构：

4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1-3任一所述的多特异性t细胞衔接子。

5.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求4所述的多核苷酸。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5所述的载体或基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。

7.一种制备如权利要求1-3任一所述的多特异性t细胞衔接子的方法，其特征在于，包括步骤：

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：

9.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物包括：

10.如权利要求1-3任一所述多特异性t细胞衔接子、如权利要求8所述的药物组合物或如权利要求9所述的免疫偶联物的用途，其特征在于，用于制备(a)检测试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗癌症/肿瘤的药物。

技术总结
本发明提供了一种抗MUC17*CD3*CD28三特异性抗体。具体地，本发明的三特异性抗体靶向肿瘤特异性抗原MUC17，同时靶向T细胞表达的CD3和共刺激分子CD28，能够为T细胞提供共刺激信号，从而激发更强更有效的杀伤活性，有望有效克服实体肿瘤对T细胞衔接子的耐药性。

技术研发人员：赵杰,蒋良丰,郑众,朱祯平,张昊,娄竞
受保护的技术使用者：三生国健药业（上海）股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23