一种解朊金黄杆菌发酵生产蛋白质谷氨酰胺酶的方法
本发明涉及酶发酵，具体涉及蛋白质谷氨酰胺酶的发酵生产方法。
背景技术：
1、蛋白质谷氨酰胺酶(protein-glutaminase，pg)是一种新型的蛋白质脱酰胺酶。pg能够特异性地使蛋白质的谷氨酰胺残基的脱酰胺，将酰胺基团转化为羧基并释放出氨分子，可导致先前隐藏的疏水位点暴露，从而显著减少分子内/分子间的氢键并增强蛋白质分子之间的静电斥力，从而提高蛋白质的功能性质。该酶仅作用于蛋白质或短肽的谷氨酰胺基团，而对天冬酰胺残基或游离谷氨酰胺没有影响，不会导致蛋白质肽链的交联和水解，因此在食品行业有着广阔的应用前景。
2、搅拌是影响发酵过程的主要因素之一，组合不同类型搅拌桨、发挥其各自优势，势必能够优化搅拌性能、提高微生物发酵生产效率。不同类型的搅拌桨能够在发酵罐中产生不同的流体形态、剪切力分布、湍流强度、气含率分布等，进而影响微生物的菌体形态、生物量甚至产物量。搅拌桨主要分为径向流和轴向流，传统的径向流圆盘涡轮式搅拌桨湍流程度强，但存在着全罐混合差、桨叶区剪切力过强、能耗大等缺点。另一方面，轴向流搅拌桨能改善全罐混合效果，且剪切力分布较均匀，但对高黏度流体的混合效果较径向流桨差。圆盘六平叶搅拌桨和bt-6搅拌桨属于典型的径流式桨。圆盘六平叶搅拌桨结构简单，易于加工，应用较广泛，但在进行气液分散时会形成气穴，气穴的存在会降低桨叶的泵送能力和气液传质能力。bt-6搅拌桨的叶片采用上下不对称的抛物线结构，上方叶片长于下方，使得上升气流被长叶片盖住从而避免气体过早从叶轮区逃逸，使更多气体在通过时被分散，并能明显降低气穴的生成。因此，将不同类型桨叶进行组合，发挥它们各自的优势，势必改善搅拌效果。
3、由于蛋白质谷氨酰胺酶的发现时间较短，目前pg酶野生菌株类型有限、酶活低，其发酵水平过低，无法进行大规模工业化生产。现有技术中，为了提高pg酶的发酵酶活，一般通过菌种诱变、菌种筛选等方式筛选获得高产菌株，但由于这种方法耗时、耗力，且诱变或筛选效果不可预期，因此有较大局限性。
技术实现思路
1、针对现有技术发酵生产蛋白质谷氨酰胺酶酶活性低的问题，本发明提供一种新的发酵罐搅拌桨组合类型，提高蛋白质谷氨酰胺酶产量；本发明还提供一种无碳源的发酵培养基配方，降低pg酶的工业化生产成本。
2、本发明采用国家批准的蛋白质谷氨酰胺酶生产菌株解朊金黄杆菌，采用适合工业化的发酵培养基，该培养基无碳源，降低了生产成本；并优选了适合蛋白质谷氨酰酶发酵的搅拌桨组合，下层为圆盘六平叶搅拌桨，中层和上层均为bt-6搅拌桨，最终发酵上清液酶活为8.63u/ml，可以实现蛋白质谷氨酰胺酶的工业化生产。
3、本发明提供了一种解朊金黄杆菌(chryseobacteriumproteolyticum)发酵生产蛋白质谷氨酰胺酶(protein-glutaminase，pg)的方法，包括以下步骤：
4、s1：配制种子培养基，
5、所述培养基为液体培养基，每升培养基中，安琪蛋白胨5～20g、酵母粉1～5g、mgso4·7h2o 1～5g，种子液采用250ml三角瓶分装25ml；
6、s2：向灭菌后的种子培养基中接入解朊金黄杆菌，培养获得液体种子液；
7、s3：配制液体发酵培养基，
8、所述液体发酵培养基，每升培养基中，安琪蛋白胨5～40g、na2hpo4·12h2o0.1～1.0g、kh2po41～10g、mgso4·7h2o 1～5g、feso4·7h2o 0.01～0.5g，
9、所述液体发酵培养基还包括0.1～1g/l消泡剂；
10、s4：将不同的搅拌桨组合类型安装于10l发酵罐，将7l发酵培养基倒入发酵罐，密封后进行常规灭菌处理；
11、s5：将1％～10％液体种子液接入灭菌完冷却后的发酵罐中，在一定的培养条件下进行好氧发酵，培养14～24h后结束发酵；
12、s6：将发酵液采用常规方法离心后，收集上清液，即为粗酶液。
13、进一步地，所述菌株为解朊金黄杆菌chryseobacterium proteolyticum0326-509，该菌株于2022年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株保藏编号为cgmcc no.25600。
14、进一步地，所述s1中，所述培养基为液体培养基，每升培养基中，安琪蛋白胨10g、酵母粉2g、mgso4·7h2o 2.05g。
15、进一步地，所述s2中，菌种最适培养条件为转速200r/min、培养温度30℃、培养时间为8h。
16、进一步地，所述s3中，所述最优培养基成分为：每升培养基中，安琪蛋白胨20g、na2hpo4·12h2o 0.43g、kh2po44.89g、mgso4·7h2o 2.5g、feso4·7h2o0.05g，还包括0.5g消泡剂。
17、所述消泡剂为glt-606gpe型消泡剂，外观为透明粘稠液体，活性成分为三羟基聚环氧丙烷环氧乙烷丙三醇醚，耐高温性能较好，在常温～140℃范围内消泡抑泡作用良好。
18、进一步地，所述s4中，所述搅拌桨组合类型为下层均为圆盘六平叶搅拌桨，中层和上层均为相同的搅拌浆，具体有六平叶、六斜叶、六箭叶、bt-6、半弯管、三斜叶、四斜叶。
19、进一步地，所述s4中，所述最优搅拌桨组合类型为下层圆盘六平叶搅拌桨，中层和上层均为bt-6搅拌桨。
20、进一步地，所述s5为：将7％液体种子液接入灭菌完冷却后的发酵罐中，在一定的培养条件下进行好氧发酵，培养18h后结束发酵。
21、进一步地，所述s5中，菌种最适培养条件为ph6.0～8.0、培养温度28～32℃、搅拌转速100～600r/min、通气量0.5～2.0vvm、培养14～24h。
22、进一步地，所述s5中，菌种最适培养条件优选为ph7.0、培养温度30℃、搅拌转速400r/min、通气量1vvm。
23、本发明还提供了一种液体发酵培养基，所述培养基成分为：每升培养基中，安琪蛋白胨5～40g、na2hpo4·12h2o 0.1～1.0g、kh2po41～10g、mgso4·7h2o 1～5g、feso4·7h2o0.01～0.5g，0.1-1.0g消泡剂。
24、进一步地，所述最优培养基成分为：每升培养基中，安琪蛋白胨20g、na2hpo4·12h2o 0.43g、kh2po44.89g、mgso4·7h2o 2.5g、feso4·7h2o 0.05g，还包括0.5g消泡剂。
25、所述消泡剂为glt-606gpe型消泡剂，外观为透明粘稠液体，活性成分为三羟基聚环氧丙烷环氧乙烷丙三醇醚，耐高温性能较好，在常温～140℃范围内消泡抑泡作用良好。
26、本发明还提供了所述的液体发酵培养基在解朊金黄杆菌发酵生产蛋白质谷氨酰胺酶的方法中的应用。
27、本发明的有益效果在于：本发明发酵罐采用bt-6搅拌器，bt-6属于径流式桨，采用抛物线设计，能避免气体过早的从叶轮区上升逃逸，并能明显降低气穴的生成。本发明还优化了发酵罐中搅拌桨的组合，当下层为圆盘六平叶搅拌桨，中层和上层均为bt-6搅拌桨，转速为500r/min时，测定kla为170.46；采用这一组合搅拌桨时，蛋白质谷氨酰胺酶酶活为8.63u/ml，这为pg酶的大规模工业化生产奠定了基础，具有较好的实用价值和推广应用意义。通过优选的发酵培养基配方，本发明发现，采用无碳源的培养基配方，降低了pg酶的工业化生产成本。
技术特征：
1.一种解朊金黄杆菌发酵生产蛋白质谷氨酰胺酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌株为解朊金黄杆菌chryseobacteriumproteolyticum0326-509，该菌株于2022年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株保藏编号为cgmccno.25600。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述s2中，种子液培养条件为转速200r/min、培养温度30℃、培养时间为8h。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的s3中，所述培养基成分为：每升培养基中，安琪蛋白胨20g、na2hpo4·12h2o0.43g、kh2po44.89g、mgso4·7h2o2.5g、feso4·7h2o0.05g，还包括0.5g消泡剂。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述s4中，所述搅拌桨组合类型为下层均为圆盘六平叶搅拌桨，中层和上层均为相同的搅拌浆，具体有六平叶、六斜叶、六箭叶、bt-6、半弯管、三斜叶、四斜叶。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述搅拌桨组合类型为下层圆盘六平叶搅拌桨，中层和上层均为bt-6搅拌桨。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述s5中，所述菌种培养条件为ph6.0～8.0、培养温度28～32℃、搅拌转速100～600r/min、通气量0.5～2.0vvm、培养14～24h。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述s5中，所述菌种培养条件优选为ph7.0、培养温度30℃、搅拌转速400r/min、通气量1vvm。
9.一种液体发酵培养基，其特征在于，所述培养基成分为：每升培养基中，安琪蛋白胨5～40g、na2hpo4·12h2o0.1～1.0g、kh2po41～10g、mgso4·7h2o1～5g、feso4·7h2o0.01～0.5g，0.1-1g消泡剂。
10.如权利要求9所述的液体发酵培养基在解朊金黄杆菌发酵生产蛋白质谷氨酰胺酶的方法中的应用。
技术总结
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种解朊金黄杆菌发酵生产蛋白质谷氨酰胺酶的方法。所用的发酵培养基为，每升培养基中，安琪蛋白胨5～40g、Na2HPO4·12H2O0.1～1.0g、KH2PO41～10g、MgSO4·7H2O1～5g、FeSO4·7H2O0.01～0.5g、消泡剂0.1～1.0g。本发明所述发酵罐中采用最优搅拌桨组合类型为下层圆盘六平叶搅拌桨，中层和上层均为BT‑6搅拌桨。本发明所述菌种最适培养条件优选为pH7.0、培养温度30℃、搅拌转速400r/min、通气量1vvm，发酵18h后，发酵上清液酶活为8.63U/mL。应用本发明的方法，可以实现蛋白质谷氨酰胺酶的工业化生产。
技术研发人员：高红亮,李桢,黄大亭,蒋德明,邹春静,贾彩凤,常忠义
受保护的技术使用者：华东师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23