一种弗氏柠檬酸杆菌酪氨酸酚裂解酶的突变体及其应用的制作方法
本发明属于生物，涉及一种来源于弗氏柠檬酸杆菌(citrobacterfreundii)的酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol-lyase,tpl)突变体和编码基因及其在催化合成左旋多巴(l-dopa)中的应用。
背景技术：
1、帕金森综合征是一种常见的中老年慢性神经系统退行性疾病，以黑质致密部多巴胺能神经元丢失、纹状体多巴胺减少为特征，临床特征有休息性震颤、肌强直、动作迟缓和姿势平衡障碍等运动症状，以及嗅觉减退、便秘、睡眠行为异常和抑郁等非运动症状。随着病程进展，患者临床症状逐渐加重，疾病中后期会出现平衡障碍、吞咽困难和语言障碍等症状，使患者生活无法自理，生活质量严重下降。
2、帕金森病的治疗手段首选是药物治疗，通过提高中枢神经系统多巴胺的浓度是其中的一种重要思路，但多巴胺无法穿过血脑屏障，这就需要左旋多巴来发挥作用。左旋多巴是多巴胺的前体物质，本身无药理活性，可通过血脑屏障进入中枢，经多巴脱羧酶作用转化成多巴胺而发挥药理作用，因此在抗帕金森病的药物中是一种重要的成分。
3、左旋多巴可以从天然植物中提取，如蚕豆和毛豆，但往往需要多步提取，原材料来源也受到天气和季节等的影响，难以实现大量生产，和市场需求差距较大。化学合成法市面上多以不对称合成为主，步骤繁琐，且对环境不友好，在工业生产上应用也受到限制。生物催化反应条件温和，从起始底物到左旋多巴一步即可完成转化，生产工艺简单可控，可操作性强，很少有副产物生成，产物的纯度和对映选择性强。
4、目前生物催化法主要包括酶催化法和代谢调控法，后者以葡萄糖、甘油为碳源，通过代谢工程改造菌株，调控其碳源代谢途径以积累大量的l-酪氨酸前体，实现了左旋多巴的从头合成，目前最高产量达到了57g/l。酶催化法的生物催化剂主要有：酪氨酸酶、氨基酰化酶、4-羟基苯乙酸3-羟化酶、酪氨酸酚裂解酶等。酪氨酸酶路线产量较低，且有副产物多巴醌；氨基酰化酶路线由于需要溴化氢进行取代反应，会有溴甲烷生成，不利于安全的生产工艺控制。4-羟基苯乙酸3-羟化酶路线需昂贵的辅因子nadh参与反应，生产成本高。酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol-lyase,tpl)路线以邻苯二酚、丙酮酸钠和铵盐为底物，反应速度快，转化效率高，没有有毒气体和液体生成，适用于工业上的生产应用。
5、tpl的天然底物为苯酚，丙酮酸钠和铵盐，当苯酚替换成邻苯二酚时，可专一性合成左旋多巴，而对于非天然的底物，活性会有所下降。
6、酪氨酸酚裂解酶合成左旋多巴的方法研究重点在于对高产左旋多巴菌株的发现和基因工程的改造。近几年用tpl催化左旋多巴合成的专利中，江南大学申请的专利通过理性设计获得了弗氏柠檬酸菌(citrobacter freundii)来源的tpl突变体e313m，其活性相比对照菌株提高了142.9％，于2019年申请专利保护突变体的序列(公开号：cn 109897845b)；浙江工业大学申请的专利通过随机突变获得了具核梭杆菌(f.nucleatum)来源的tpl突变体，与野生型相比左旋多巴产量提高了17％-25％，于2016年申请专利保护突变体的序列(公开号：cn106754846b)；浙江工业大学申请的专利通过随机突变获得了克吕沃尔氏菌(kluyvera intermedia)来源的tpl突变体，与野生型相比左旋多巴产量提高了30％，于2019年申请专利保护突变体的序列(公开号：cn 110331153 b)；另外还有南通大学申请的专利发现的脱硫细菌(desulfitobacterium hafniense)来源的tpl于2019年申请了专利(公开号：cn 110791536a)。
7、这些专利中获得的tpl催化活性较野生型有所提高，但催化反应进行尚不完全，且tpl的热稳定性都不高，反应工艺需要控制在15-20℃甚至更低，增加了左旋多巴的生产成本。因此，开发高活性和具有耐热性和的tpl对实现左旋多巴的工业化生产具有十分重要的意义。
技术实现思路
1、来源于弗氏柠檬酸杆菌的酪氨酸酚裂解酶的天然底物为苯酚，对非天然底物邻苯二酚转化效率低，野生型的转化率只有59％，且热稳定性较差。本发明应用定向进化手段对来源于弗氏柠檬酸杆菌的酪氨酸酚裂解酶进行改造，通过分子对接结果结合热稳定性设计改造，设计了29个位点的饱和突变体库，通过高通量筛选和迭代突变，获得了44个单点突变体，其中31个经过液相检测验证活性高于野生型，经过迭代突变后获得了一系列双突变体，其中转化率大于90％的双突变体有16个，活性最高的突变体较野生型增长了40％。本发明获得的对邻苯二酚活性提高的一系列突变体，可应用于左旋多巴的生物催化合成中。
2、本发明的第一个目的是保护cftpl的一系列突变体。
3、所述cftpl的野生型基因如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq id no.2所示。
4、所述cftpl突变体是将seq id no.2的第43位、第110位、第141位、第276位、第186位、第207位、第230位和454位的氨基酸残基中至少一个氨基酸残基进行突变后得到的突变体。
5、进一步地，所述cftpl的突变体包括如下至少一种突变：将cftpl的氨基酸序列的第43位由异亮氨酸突变为或丙氨酸或甘氨酸或缬氨酸、将cftpl的氨基酸序列的第110位由丙氨酸突变为蛋氨酸或丝氨酸或半胱氨酸或组氨酸、将cftpl的氨基酸序列的第141位由缬氨酸突变为亮氨酸或丙氨酸或异亮氨酸、将cftpl的氨基酸序列的第276位由丝氨酸突变为谷氨酸或天冬氨酸或苏氨酸、将cftpl的氨基酸序列的第186位由亮氨酸突变为蛋氨酸或甘氨酸或丝氨酸、将cftpl的氨基酸序列的第207位由组氨酸突变为酪氨酸或苏氨酸、将cftpl的氨基酸序列的第230位由谷氨酰胺突变为谷氨酸、将cftpl的氨基酸序列的第454位由天冬氨酸突变为谷氨酸。
6、编码上述cftpl的突变体的核酸序列也属于本发明的保护范围。
7、本发明的第二个目的是保护cftpl突变体的基因工程菌。
8、在本发明的一种实施方式中，以大肠杆菌为宿主，以pet系列载体为表达载体。
9、本发明的第三个目的是提供一种左旋多巴的全细胞转化制备方法，是以上述基因工程菌为全细胞催化剂，以丙酮酸钠、邻苯二酚、乙酸铵为底物，进行全细胞转化。所述方法具体包括以下步骤：
10、种子液先在37℃下培养6-8h，再加入诱导剂0.2mm的iptg并降温至20-25℃，继续发酵12-20h。培养液高速离心收集湿菌体，湿菌体用反应液重悬，反应液中湿菌体的终浓度为20-60g/l，重悬液含有丙酮酸钠18g/l，邻苯二酚11g/l，乙酸铵30g/l，na2so3 4g/l，edta2g/l，5-磷酸吡哆醛30μm，氨水调节ph为8.0；反应条件为25-45℃，180-500rpm，反应需避光，反应4h后，向反应液中按20％体积量加入0.1m盐酸，经重悬后12000rpm离心2-4min，上清液中即含有产物左旋多巴。
技术特征：
1.一种酪氨酸酚裂解酶突变体，其特征在于，所述突变体是将seq id no.2的第43位、第110位、第141位、第276位、第186位、第207位、第230位和454位的氨基酸残基中至少一个氨基酸残基进行突变后得到。
2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体存在如下至少一种突变：将cftpl的氨基酸序列的第43位由异亮氨酸突变为或丙氨酸或甘氨酸或缬氨酸、将cftpl的氨基酸序列的第110位由丙氨酸突变为蛋氨酸或丝氨酸或半胱氨酸或组氨酸、将cftpl的氨基酸序列的第141位由缬氨酸突变为亮氨酸或丙氨酸或异亮氨酸、将cftpl的氨基酸序列的第276位由丝氨酸突变为谷氨酸或天冬氨酸或苏氨酸、将cftpl的氨基酸序列的第186位由亮氨酸突变为蛋氨酸或甘氨酸或丝氨酸、将cftpl的氨基酸序列的第207位由组氨酸突变为酪氨酸或苏氨酸、将cftpl的氨基酸序列的第230位由谷氨酰胺突变为谷氨酸、将cftpl的氨基酸序列的第454位由天冬氨酸突变为谷氨酸。
3.如权利要求1或2所述的突变体的编码核酸。
4.含有如权利要求3所述的编码核酸表达载体，优选地，出发载体为pet系列载体。
5.含有如权利要求4所述的表达载体的基因工程菌，所述的基因工程菌，其特征在于，其出发菌为大肠杆菌或枯草芽孢杆菌或毕赤酵母。
6.如权利要求1或2所述的突变体在制备左旋多巴中的应用。
7.一种左旋多巴的生物合成方法，其特征在于，以权利要求5所述的基因工程菌全细胞或粗酶液或纯酶作为催化剂，以丙酮酸钠、邻苯二酚、乙酸铵为底物，催化底物转化生成左旋多巴。
8.权利要求7所述的生物合成方法，其特征在于，具体包括以下步骤：发酵培养所述基因工程菌，得到的培养液高速离心收集湿菌体，湿菌体用反应液重悬以用于全细胞转化。
9.如权利要求7所述的生物合成方法，其特征在于，反应液含有18 g/l丙酮酸钠，11 g/l邻苯二酚，30g/l乙酸铵，4g/l na2so3，2g/l edta，30μm5-磷酸吡哆醛，氨水调节ph为8.0-8.5；反应条件为25-45℃，180-500rpm，反应避光进行0.5-4 h。
技术总结
本发明应用定向进化策略，构建了来源于弗氏柠檬酸杆菌的酪氨酸酚裂解酶的单点饱和突变体库，在此基础上进行突变位点的迭代，最终获得了催化性能显著提高的突变体。本发明公开了这种弗氏柠檬酸杆菌来源的酪氨酸酚裂解酶的突变体基因序列和基因工程菌的构建方法，在合成左旋多巴的应用中，本发明提供的突变体相比于野生型，转化率得到提高，并且耐热增强，具有很好的生产应用价值。
技术研发人员：毕悦欣,张严匀,张晓立,李华珍,章家泉
受保护的技术使用者：百葵锐（深圳）生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23