基于微载体培养间充质干细胞的方法与流程
本发明属于细胞培养，具体地，本发明涉及一种基于微载体培养间充质干细胞的方法。
背景技术：
1、间充质干细胞(mscs)是目前备受关注的一类具有自我更新能力和多向分化潜能的组织干细胞，可以从脐带、脂肪、胎儿血液、骨髓、肝脏等组织获得。mscs虽来源于中胚层，但在特定条件下，可分化为各胚层的多种细胞或组织，如骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、神经样细胞、内皮细胞以及肝细胞等，这为临床应用间充质干细胞治疗多种疾病提供了一个广阔的前景。但在mscs质量研究及临床前研究上，细胞数的需求量较大，需要建立适宜的培养条件进行体外扩增。
2、微载体培养技术是目前公认的最有发展前途的用于动物细胞大规模培养的技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，容易放大，条件可控。
3、因此，采用微载体技术使间充质干细胞高效稳定的大规模扩增培养还有待研究。
技术实现思路
1、本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
2、需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：
3、目前，间充质干细胞所使用的培养基一般为平面通用型培养基，而微载体培养虽然也是让间充质干细胞贴附其表面生长，但是培养基在细胞培养过程中的贴附阶段存在搅拌与静止两个状态。其中，培养基在细胞生长和增殖阶段处于搅拌状态，在收获阶段间还需加入消化液处理一段较长时间，发明人发现在上述过程中培养基的剪切力和消化液的化学反应会对间充质干细胞造成一定的物理和化学损伤，导致间充质干细胞在微载体培养时的贴附、生长和增殖效率低下。
4、在搅拌过程中，生物反应器搅拌速率一般为全阶段匀速搅拌或贴附阶段间歇匀速搅拌，生长增殖阶段匀速搅拌，这些搅拌模式会导致间充质干细胞在贴附阶段容易出现贴附效率低下和贴附不均匀，在生长增殖阶段容易发生微载体聚集从而导致被包裹的间充质干细胞无法吸收营养物质，使其因缺少养分而发生凋亡或分化；而且聚集的微载体表面也无法被间充质干细胞贴附，造成微载体有效表面积的损失。
5、因此，发明人经过不断试验，研发了一种间充质干细胞微载体大规模扩增培养专用培养基：本发明所用的间充质干细胞微载体大规模扩增培养专用培养基(下文简称：专用培养基)比平面通用型培养基增加了细胞保护因子和促进生长因子，能够较大幅度的降低间充质干细胞在微载体大规模扩增培养中的物理和化学损伤，从而提高间充质干细胞在微载体培养时的贴附、生长和增殖效率。
6、此外，发明人还对生物反应器搅拌速率的规律进行了一定的研究，本发明所用的动态搅拌规律能有效提高微载体培养的间充质干细胞在贴附阶段的贴附效率和贴附均一度，在生长增殖阶段降低微载体聚集。
7、因此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种培养基。根据本发明的实施例，所述培养基包括基础培养基以及营养因子，所述营养因子包括胎牛血清、谷氨酰胺、碱性成纤维生长因子、内表皮生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子-β1、纤维蛋白和人血白蛋白。发明人经过不断试验发现，所述培养基中的碱性成纤维生长因子、内表皮生长因子、胰岛素样生长因子和转化生长因子-β1能够促进间充质干细胞的增殖和防止间充质干细胞老化；纤维蛋白和人血白蛋白能够增强间充质干细胞贴附效果、降低间充质干细胞在培养和收获过程中所受的物理和化学损伤。
8、根据本发明的实施例，所述培养基还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
9、根据本发明的实施例，所述基础培养基为dmem/f12培养基。
10、根据本发明的实施例，所述胎牛血清的体积分数为0.5～1.5％，所述谷氨酰胺的质量体积分数为1～5mg/ml，所述碱性成纤维生长因子的质量体积分数为5～15ng/ml，所述内表皮生长因子的质量体积分数为5～15ng/ml，所述胰岛素样生长因子的质量体积分数为5～15ng/ml，所述转化生长因子-β1的质量体积分数为5～15ng/ml，所述纤维蛋白的质量体积分数为0.5～1.5mg/ml，所述人血白蛋白的质量体积分数为4～8mg/ml。发明人发现采用此浓度范围内的营养因子制备而成的培养基能够降低间充质干细胞在微载体大规模培养过程中的物理和化学损伤，从而提高间充质干细胞在微载体培养时的贴附、生长和增殖效率。
11、根据本发明的实施例，所述胎牛血清的体积分数为1％，所述谷氨酰胺的质量体积分数为2.5mg/ml，所述碱性成纤维生长因子的质量体积分数为10ng/ml，所述内表皮生长因子的质量体积分数为10ng/ml，所述胰岛素样生长因子的质量体积分数为10ng/ml，所述转化生长因子-β1的质量体积分数为10ng/ml，所述纤维蛋白的质量体积分数为1mg/ml1％，所述人血白蛋白的质量体积分数为6mg/ml。发明人发现采用此浓度范围内的营养因子制备而成的培养基能够降低间充质干细胞在微载体大规模培养过程中的物理和化学损伤，从而提高间充质干细胞在微载体培养时的贴附、生长和增殖效率。
12、在本发明的另一个方面，本发明提出了前面所述培养基在微载体培养间充质干细胞中的用途。采用本发明的培养基能够有效提高间充质干细胞在微载体培养贴附阶段的贴附效率和贴附均一度，降低在生长增殖阶段微载体的聚集和在培养及收获过程中间充质干细胞所受到的物理和化学损伤，直接或间接地提高了间充质干细胞在微载体培养时的贴附、生长和增殖效率，从而减少了微载体和培养基等资源的消耗。
13、在本发明的又一个方面，本发明提出了一种培养间充质干细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将接种有间充质干细胞的微载体在前面所述培养基中进行培养处理。采用本发明所述的方法，能够有效提高间充质干细胞在微载体培养贴附阶段的贴附效率和贴附均一度，降低在生长增殖阶段微载体的聚集和在培养及收获过程中间充质干细胞所受到的物理和化学损伤。
14、根据本发明的实施例，所述培养间充质干细胞的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
15、根据本发明的实施例，所述微载体预先经过浸润处理。
16、根据本发明的具体实施例，所述浸润处理是通过如下方式进行的：将所述微载体在前面所述培养基中进行搅拌、完全浸润处理2～8小时。因此，能够使所述培养基完全浸润微载体，提高所述培养基的使用效率。
17、根据本发明的实施例，所述浸润处理是在搅拌悬浮培养反应器中进行的。因此，能够保证微载体与所述培养基充分接触。
18、根据本发明的实施例，所述微载体经过浸润处理前，进一步包括将所述微载体进行洗涤处理。
19、根据本发明的具体实施例，所述洗涤处理是通过如下方式进行的：将所述微载体进行灭菌处理；将灭菌处理的所述微载体在pbs中进行第一重悬处理和第一离心处理，任选地，所述第一重悬处理中，所述pbs与所述微载体的体积质量比为100ml:280mg；将第一离心处理底物在前面所述培养基中进行第二重悬处理和第二离心处理，任选地，所述第二重悬处理中，所述培养基与所述微载体的体积质量比为100ml：280mg。
20、根据本发明的实施例，所述第一离心处理和第二离心处理的转速为500×g，时间为5min。
21、根据本发明的实施例，所述培养处理是在如下表所示的条件下以及温度为37℃、co2浓度为5％的条件下进行的：
22、
23、。采用表中所示的条件，能够保证间充质干细胞和营养物质在培养初期和中期均分的前提下降低搅拌的剪切力，从而促进间充质干细胞增殖；此外，能够在培养后期以产生较小的剪切力的前提下降低间充质干细胞微载体粘连聚集。
24、根据本发明的实施例，所述培养处理是在搅拌悬浮培养反应器中进行的。因此，能够保证间充质干细胞与所述培养基充分接触，及时带走细胞产生的有害代谢物保证氧气的充分供应。
25、根据本发明的实施例，所述培养处理的循环步骤2之后，循环步骤3之前，进一步包括补充所述培养基处理。因此，不仅能够及时补充营养物质，满足细胞生长的需要，而且能增大微载体的空间距离降低间充质干细胞微载体粘连聚集。
26、根据本发明的具体实施例，补充所述培养基的体积为所述浸润处理中培养基体积的一半。
27、根据本发明的实施例，进一步包括对培养处理后的间充质干细胞进行检测和收集处理。
28、根据本发明的实施例，所述检测处理是通过如下方式进行的：对培养处理产物进行第三离心处理；将第三离心处理底物进行ao/pi染色；将染色后的间充质干细胞进行细胞计数，获得活细胞数量；以及基于所述活细胞数量，获得间充质干活细胞在微载体上的汇合度。
29、根据本发明的实施例，所述收集处理是通过如下方式进行的：对培养处理产物进行第三离心处理；将第三离心处理底物进行第三重悬和裂解处理，任选地，所述裂解处理中，所述重悬液与裂解液的体积比为100：(1.0～1.1)；将裂解处理产物在所述培养处理的循环步骤3的转速和时间条件下进行一次循环搅拌处理；将一次循环搅拌处理产物进行第四离心处理，以收集所述充质干细胞活细胞。
30、根据本发明的实施例，所述第三离心处理的转速为500×g，时间为5min。
31、本发明的有益效果：
32、本发明提供的培养基能够有效提高间充质干细胞在微载体大规模扩增培养中贴附阶段的贴附效率和贴附均一度，降低在生长增殖阶段微载体的聚集和在培养及收获过程中间充质干细胞所受到的物理和化学损伤，直接或间接地提高了间充质干细胞在微载体培养时的贴附、生长和增殖效率，从而减少了微载体和培养基等资源的消耗。
33、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
技术特征：
1.一种培养基，其特征在于，包括基础培养基以及营养因子，所述营养因子包括胎牛血清、谷氨酰胺、碱性成纤维生长因子、内表皮生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子-β1、纤维蛋白和人血白蛋白。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基为dmem/f12培养基。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述胎牛血清的体积分数为0.5～1.5％，所述谷氨酰胺的质量体积分数为1～5mg/ml，所述碱性成纤维生长因子的质量体积分数为5～15ng/ml，所述内表皮生长因子的质量体积分数为5～15ng/ml，所述胰岛素样生长因子的质量体积分数为5～15ng/ml，所述转化生长因子-β1的质量体积分数为5～15ng/ml，所述纤维蛋白的质量体积分数为0.5～1.5mg/ml，所述人血白蛋白的质量体积分数为4～8mg/ml。
4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述胎牛血清的体积分数为1％，所述谷氨酰胺的质量体积分数为2.5mg/ml，所述碱性成纤维生长因子的质量体积分数为10ng/ml，所述内表皮生长因子的质量体积分数为10ng/ml，所述胰岛素样生长因子的质量体积分数为10ng/ml，所述转化生长因子-β1的质量体积分数为10ng/ml，所述纤维蛋白的质量体积分数为1mg/ml，所述人血白蛋白的质量体积分数为6mg/ml。
5.权利要求1～4任意一项所述培养基在微载体培养间充质干细胞中的用途。
6.一种培养间充质干细胞的方法，其特征在于，包括：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述微载体预先经过浸润处理；
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述培养处理是在如下表所示的条件下以及温度为37℃、co2浓度为5％的条件下进行的：
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述培养处理的循环步骤2之后，循环步骤3之前，进一步包括补充所述培养基处理；
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，进一步包括对培养处理后的间充质干细胞进行检测和收集处理。
技术总结
本发明提出了基于微载体培养间充质干细胞的培养基和方法。所述培养基包括基础培养基以及营养因子，所述营养因子包括胎牛血清、谷氨酰胺、碱性成纤维生长因子、内表皮生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子‑β1、纤维蛋白和人血白蛋白。其中，碱性成纤维生长因子、内表皮生长因子、胰岛素样生长因子和转化生长因子‑β1能够促进间充质干细胞的增殖和防止间充质干细胞老化；纤维蛋白和人血白蛋白能够增强间充质干细胞贴附效果、降低间充质干细胞在培养和收获过程中所受的物理和化学损伤，因此能够提高间充质干细胞的活细胞率。
技术研发人员：方建彬,万桦,王魁星,徐凤萍
受保护的技术使用者：深圳华大基因细胞科技有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23