一种均匀、稳定的细胞蜡块质控品及其制备方法与流程

本发明属于生物医药领域、临床诊断领域，具体地，提供了一种均匀、稳定的细胞蜡块质控品及其制备方法，以及提供了所述细胞蜡块质控品的使用方法及应用。

背景技术：

1、随着生物学技术的发展，基因检测技术逐渐走向临床，特别是癌症治疗方面，大多数靶向药物都与特定的基因突变类型相关，因此在临床诊断、靶向用药及基因检测产品中都需要质控品保证检测结果的有效性。根据不同的检测方法，质控品可以是不同基因、特定基因不同突变及不同突变频率的物质，用来评价诊断试剂盒或ngs测序检测结果的敏感性、准确性、特异性，也可以是特定蛋白表达强度的物质，对免疫组化过程进行质控。临床检测结果的准确性对于有效治疗至关重要，而实验过程中的操作误差不可避免会对诊断结果造成影响，导致误诊的发生，为病人和医院带来了沉重的负担和医疗压力。临床目前常用病理质控品一般为其他病人的组织，但不同病人，或同一病人不同层切片组织均存在异质性，且组织量有限，不利于作为统一的质控品大量应用于临床。肿瘤移植组织由于其操作的复杂性及高成本，限制了其应用。获取一种统一、稳定、准确、低成本的质控产品迫在眉睫。本质控品的出现为解决此难题找到了突破口。

2、细胞多为无色透明，细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别；并且，细胞离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，需要对细胞进行处理才能长时间保存且便于辨认其形态结构。ffpe(formalin-fixed paraffin-embedding，福尔马林固定石蜡包埋)指的是为维持细胞核蛋白结构，先用福尔马林固定然后固体石蜡包埋，以便使用超薄切片机切成薄片的细胞样品，制作过程包括固定、脱水、透明、包埋、切片、染色等一系列步骤。ffpe样本在众多的样本类型中能最大程度的接近真实临床样本，不但可以进行正常组织细胞形态学方面的观察，在病理学、免疫学、细胞原位核酸分子杂交、高通量测序、形态计量领域方面也有广泛的应用。

3、但是，传统制作方法得到的细胞蜡块形状不规则、细胞分布不均，细胞重叠影响病理结果的判读。另外，传统制作方法制备得到的细胞蜡块、细胞蜡片还存在不耐储存、性能不稳定的缺点，不能满足临床检测定性和定量评估的要求，无法作为常规质控品应用于临床。

技术实现思路

1、为解决以上质控品来源受限、细胞蜡块中细胞分布不均、性能不稳定等技术问题，本发明提供一种均匀度高、性能稳定的细胞蜡块/蜡片质控品及其制备方法，该制备方法可以制备出形状规则、耐储存的细胞蜡块/蜡片。

2、并且，本方法制备的细胞蜡块对细胞结构和后续分子靶标检测无任何影响。经he染色和免疫组织化学方法验证，细胞石蜡切片中细胞形态完整、分布均匀，蛋白表达恒定。

3、具体地，本发明提供了以下技术方案：

4、第一方面，本发明提供了一种制备细胞蜡块的方法，所述方法包括以下步骤：

5、步骤1、取材固定：收集细胞，加入固定剂固定后，使用凝结剂凝结制成类圆柱形固体；

6、步骤2、依次进行以下处理：70％乙醇处理2h，80％乙醇处理2h，90％乙醇处理2h，95％乙醇处理2h，无水乙醇处理1h，无水乙醇处理1h，乙醇：二甲苯(1：1)，处理30min，二甲苯i处理30min，二甲苯ii处理30min，石蜡i高温处理1h，石蜡ii高温处理1h，石蜡iii高温处理1h；

7、步骤3、包埋机包埋。

8、具体地，所述步骤2中的二甲苯i、二甲苯ii各自可选的是二甲苯；石蜡i、石蜡ii、石蜡iii各自可选的是石蜡。

9、可选的，所述步骤2中二甲苯还可以替换为乙醇、正丁醇、甲醇、异丙醇、丙酮、苯甲酸-2-乙基己酯、棕榈酸-2-乙基己酯、椰油酸-2-乙基己酯、硬脂酸-2-乙基己酯、乙酸-2-乙基己酯、苯甲酸苄酯、聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、四羟丙基乙二胺溶液、柠檬烯中的任意一种或多种的组合物。

10、优选地，所述高温可以是40-70℃，具体包括40℃、50℃、60℃、70℃。

11、最优选地，所述高温是60℃。

12、优选地，本发明所收集的细胞是经过消化的细胞，所述消化细胞的方法是本领域技术人员所常规熟知的。

13、优选地，本发明所述细胞的培养方法是本领域技术人员所常规熟知的，具体的可选用本发明具体实施例中记载的培养用于制备质控品的细胞系的方法。

14、具体地，所述消化所使用的试剂包括蛋白酶k、胰蛋白酶、胶原酶a、脱氧核糖核酸酶、透明质酸酶、链霉蛋白酶中的一种或其组合。最优选地，本发明具体实施例中使用胰蛋白酶-edta消化液进行消化。

15、优选地，所述步骤1后需在4℃下存放一定时长，具体例如3-10小时，优选6小时。

16、本领域所公知的，固定剂的主要作用为固定细胞结构，维持细胞dna和蛋白质完整性，为使固定剂扩散进入组织样品并尽可能使其与活组织结构接近，需要将细胞浸没在大量固定剂中，所述固定剂体积至少是细胞的至少5、10、20倍或更多。

17、合适的固定剂不损害抗原性，还可以保持组织、细胞的结构以及允许大分子进入细胞内与抗原结合。根据作用机制分类的主要固定剂组包括醛、醇、氧化剂、汞剂以及苦味酸盐，所述醛包括c1-c6链烷基或c1-c8亚烷基二醛，所述醇包括乙二醇、丙二醇、甘油、山梨醇和甘露醇。

18、在一种具体地实施例中，所述固定剂是甲醛，优选10％中性缓冲的福尔马林(nbf)。

19、在另一种具体的实施例中，所述固定剂是多聚甲醛(paraformaldehyde)；所述多聚甲醛是甲醛的聚合形式，其在加热时解聚以提供福尔马林。

20、在另一种具体的实施例中，所述固定剂还可以是戊二醛、乙醇、faa固定液、carnoy固定液、布安氏液(bouin’s)、锌-福尔马林、酸性福尔马林(afa)、zamboni’s(stefanini’s)、二氧六环等。

21、本发明所述固定剂可以使用以下缓冲液配制：磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、苹果酸盐缓冲液、卡可基酸盐缓冲液、以及佛罗那缓冲液(gelatin-veronal buffe)。

22、优选地，所述固定步骤在变化的温度或恒定温度下进行。

23、优选地，所述变化的温度是指对试剂进行冷热交替的处理，具体例如先在<15℃的低温处理再经过>20℃的高温处理。低温环境中固定剂易于渗透到细胞中，高温可增加交联动力学。

24、优选地，所述恒定温度的温度范围是-20℃-37℃；

25、优选地，在常温下进行固定时，所述固定处理的时长可以是12-48小时，优选约24小时。

26、优选地，所述凝结剂包括黄原胶、藻蛋白酸钠、果胶、藻蛋白酸丙二醋、羚甲基纤维素、阿拉伯树胶、瓜尔豆胶、多糖、凝胶中的一种多种。

27、优选地，所述多糖是琼脂糖(如本发明具体实施例所用)。

28、优选地，本发明所提供的方法适用于任何细胞。具体包括细胞系或分离自癌症患者样品的细胞。

29、具体地，所述样品包括：外周血、血液、血清、血浆、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、淋巴、胞液、腹水、胸膜积液、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液或组织(包括临床组织)。

30、具体地，所述细胞系可以是癌症细胞系，可以是自行制备的具有特定基因型的癌症细胞系。

31、本发明所述癌症包括血液癌：急性白血病(如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病以及成髓细胞白血病、前髓细胞白血病、骨髓单核细胞白血病、单核细胞白血病和红白血病)、慢性白血病(如慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性骨髓性白血病、和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症(polycythemia vera)、淋巴瘤、霍奇金氏(hodgkin′s)病、非霍奇金氏淋巴瘤；实体癌：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤(osteogenic sarcoma)、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤(ewing′s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性(lymphoid malignancy)、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝瘤(hepatoma)、胆管癌、绒毛膜癌(choriocarcinoma)、维尔姆斯氏肿瘤(wilms′tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌和cns肿瘤(如胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤(craniopharyogioma))、室鼓膜瘤(ependymoma)、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

32、本发明所述癌症细胞系示例性地包括：乳腺癌：4t1(小鼠乳腺癌细胞)、zr-75-1(人乳腺癌细胞)、zr-75-30(人乳腺癌细胞)、bcap-37(人乳腺癌细胞)、bc-009(人乳腺癌细胞)、bc-019(人乳腺癌细胞)、bc-020(人乳腺癌细胞)、bc-021(人乳腺癌细胞)、bc-022(人乳腺癌细胞)、ma-891(小鼠乳腺癌高转移细胞)；肺癌：95-d(人高转移肺癌细胞)、pla-801d(人高转移肺癌细胞)、a-427(人肺癌细胞)、calu-1(人肺癌细胞)、calu-3(人肺腺癌细胞(胸水))、h1395(人肺腺癌细胞)、h1975(人肺腺癌细胞)、h460(人大细胞肺癌细胞)、h661(人大细胞肺癌细胞)、la795(小鼠肺腺癌细胞)、hcc827(人非小细胞肺癌细胞)、h157(人非小细胞肺腺癌细胞)；肝癌：bel-7402(人肝癌细胞)、bel-7404(人肝癌细胞)、h-4-ii-e-c3(大鼠肝癌细胞)、hb611(人肝癌细胞)、hep b1.2(人肝癌细胞)、hhcc(人肝癌细胞)、h-97(人高转移肝癌细胞)、hcclm3(人高转移肝癌细胞)、hccc-9810(人胆管细胞型肝癌细胞)、hep 3b2.1-7(人肝癌细胞)、bel-7405(人肝癌细胞)；血液癌：6t-cem(人t细胞白血病细胞)、tf-1(人血液白血病细胞)、thp-1(人单核细胞白血病)、l6565(小鼠白血病克隆细胞系)；肾癌：os-rc-2(人肾癌细胞)、a-498(人肾癌细胞)、g-401(人肾癌wilms细胞)、sw839(人肾癌细胞)；卵巢癌：a2780(人卵巢癌细胞)、anglne(人卵巢癌细胞)、caov-3(人乳突状卵巢腺癌细胞)、coc1(人卵巢癌细胞)、coc1/ddp(人卵巢癌细胞coc1顺铂耐药亚株)、es-2(人卵巢透明细胞癌细胞)；5637(人膀胱癌细胞)；22rv1(人前列腺癌细胞)；a-431(人表皮癌细胞)；acc-2(人涎腺腺样囊性癌细胞)。具体实施例中以mcf-7细胞系(普诺赛)、skbr-3细胞系(普诺赛)为示例进行验证。

33、具体地，本领域技术人员可以根据具体的使用目的确定本发明中收集的细胞数量。优选地，1-10×107(1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、10×107)的细胞数量都是合适的。最优选地，本发明具体实施例中收集的细胞数量约为4-5×107。

34、优选地，所述脱水可以在加压环境或正常大气压环境进行。

35、优选地，所述制备细胞蜡块中的模具可以是任意形状，本领域常用的模具包括正方体、长方体。

36、另一方面，本发明提供了制备细胞蜡片的方法，所述方法包括上述方法制备细胞蜡块的步骤，还包括冷冻蜡块后切成合适厚度蜡片的步骤。

37、优选地，所述切片所得到的第1-1500片中任意一片上的细胞都结构完整且分布均匀，可作为质控品细胞蜡片用于鉴定诊断产品质量、作为质控品使用。

38、另一方面，本发明提供了前述制备细胞蜡块的方法制备得到的细胞蜡块或制备细胞蜡片的方法制备得到的细胞蜡片(细胞切片)。

39、另一方面，本发明还提供了包含以上细胞蜡块或细胞蜡片(切片)的试剂盒。

40、在所述试剂盒中本发明所提供的细胞蜡块或细胞蜡片(切片)由于易于保存、稳定性高的特性，可以作为质控品使用。

41、另一方面，本发明提供了以上细胞蜡块、细胞蜡片在鉴定诊断产品质量中的应用。

42、优选地，所述诊断产品是基于基因检测、ihc、fish检测方法的诊断产品，或者，所述诊断产品是测序平台等检测设备。

43、优选地，所述诊断产品包括定性或定量地检测基因表达水平、基因突变位点的产品。

44、优选地，所述诊断产品适用于本发明前述的任意一种癌症或多种的组合。

45、以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

技术特征：

1.一种制备细胞蜡块的方法，所述方法包括以下步骤：

2.如权利要求1所述方法，所述收集细胞所收集的细胞数量是1-10×107；

3.如权利要求1所述方法，所述固定剂是中性福尔马林或乙醇、甲醛、戊二醛、乙醇、faa固定液、carnoy固定液、布安氏液、锌-福尔马林、酸性福尔马林(afa)、zamboni’s(stefanini’s)、二氧六环等；

4.如权利要求1所述方法，所述高温是40-70℃；

5.如权利要求1所述方法，所述固定步骤在变化的温度或恒定温度下进行；

6.如权利要求1所述方法，所述收集细胞包括细胞系或分离自癌症患者样品的细胞；

7.一种制备细胞蜡片的方法，所述方法包括权利要求1所述制备细胞蜡块的方法的步骤，所述方法还包括冷冻蜡块后切片的步骤；

8.一种产品，所述产品是权利要求1所述制备细胞蜡块的方法制备得到的细胞蜡块，或，权利要求7所述制备细胞蜡片的方法制备得到的细胞蜡片。

9.包含权利要求8所述产品的载玻片或试剂盒。

10.权利要求7所述产品或权利要求8所述载玻片或试剂盒在鉴定诊断产品质量中的应用；

技术总结
本发明属于生物医药领域、临床诊断领域，具体地，提供了一种均匀、稳定的细胞蜡块质控品及其制备方法，以及提供了所述细胞蜡块质控品的使用方法及应用。具体地，所述方法包括以下步骤：步骤1、取材固定：收集细胞，加入固定剂固定后，使用凝胶凝结制成类圆柱形固体；步骤2、依次进行以下处理：70％乙醇处理2h，80％乙醇处理2h，90％乙醇处理2h，95％乙醇处理2h，无水乙醇处理1h，无水乙醇处理1h，乙醇：二甲苯(1：1)，处理30min，二甲苯I处理30min，二甲苯II处理30min，石蜡I高温处理1h，石蜡II高温处理1h，石蜡III高温处理1h；步骤3、包埋机包埋。

技术研发人员：杨承刚,董东,陈丽媛,孟庆迎
受保护的技术使用者：固安博健生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23