一种肺结核疫苗及其制备方法和应用与流程
本发明涉及疫苗，具体涉及一种肺结核疫苗及其制备方法和应用重组腺病毒载体肺结核疫苗及其制备方法和应用，更具体而言，涉及一种黏膜给药的重组腺病毒载体肺结核疫苗的制备方法及其应用。
背景技术：
1、结核病(tuberculosis or tb)是由结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis，结核菌)引起的，全球范围内导致死亡最严重的细菌性感染病。结核病作为古老疾病，其大流行已经持续了近百年。全球约1/4的人口感染了结核，每年因结核病死亡人数逾150万。接种疫苗是控制结核病最为有效的低负担的防治措施。然而，自1921年卡介苗(bcg)后，过去100年内没有任何新的结核疫苗上市。卡介苗虽然廉价，安全，新生儿接种后能有效地预防儿童结核病，但是大量研究数据表明它针对结核病的保护力只能保持10年左右。随着年龄的增长，保护力持续下降，卡介苗不能防止成年人感染结核分枝杆菌及患上结核病。虽然全球实现了卡介苗的广泛接种，但是由于目前没有更优于卡介苗的替代疫苗产品出现，因而结核病一直持续的肆虐全球。一款可以预防结核感染和(或)防止潜伏性结核激活的疫苗，是全球公共卫生系统迫切需求的控制结核病最有效的手段。
技术实现思路
1、基于前期的研究基础，本发明开发一种免疫组合物，其可以有效的加强机体免疫反应，克服现有肺结核疫苗保护力和使用范围的不足，在感染部位及时清除结核菌，控制潜伏感染，并可实现预防感染的效果。本发明的免疫组合物包括结核分枝杆菌的多个抗原；多个抗原间不会影响表达，同时还具有互相促进提升各自产生的免疫反应的功能。可以高水平的有效激起机体的细胞免疫及黏膜免疫。
2、本发明术语，“tb75k”为免疫原性结核分枝杆菌抗原(mtb32a和mtb39a)
3、一种免疫原性组合物，包括结核分枝杆菌mtb32a抗原或其免疫原性片段，mtb39a抗原或其免疫原性片段和ag85a抗原或其免疫原性片段。
4、进一步的，mtb32a和mtb39a为融合抗原(tb75k)。
5、进一步的，mtb32a、mtb39a和ag85a为融合抗原。
6、进一步的，ag85a与mtb32a、mtb39a(tb75k)通过linker融合；优选地，为ag85a-linker-tb75k或tb75k-linker-ag85a。
7、示例性的，ag85a抗原的氨基酸序列为seq id no:1或具有至少75％的同源性序列；优选地，至少具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。
8、示例性的，mtb32a、mtb39a融合抗原(简称tb75k)的氨基酸序列为seq id no:2或具有至少75％的同源性序列；优选地，至少具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性；
9、示例性的，ag85a-linker-tb75k抗原的氨基酸序列为seq id no:3或具有至少75％的同源性序列；优选地，至少具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性；更优选地，其中linker序列可进行替换。
10、具体的，所述linker为柔性linker，其序列所述连接肽为ggggsggggsggggs(seqid no：6)连接肽、ggggs(seq id no：7)连接肽、gggggggg(seq id no：8)连接肽、gggggg(seq id no：9)连接肽、eaaakeaaak(seq id no：10)连接肽、eaaak(seq id no：11)连接肽、papap(seq id no：12)连接肽、apapapapapapapap(seq id no：13)连接肽、kesgsvsseqlaqfrsld(seq id no：14)连接肽、aeaaakeaaakeaaakeaaakaleaeaaakeaaakeaaak(seq id no：15)连接肽、eaaaka(seq id no：32)和/或eaaakeaaakeaaak(seq id no：5)连接肽；更优选地，所述linker如seq id no：5-15所示。
11、具体的，编码tb75k-linker-ag85a抗原的氨基酸序列为seq id no:4或具有至少75％的同源性序列；优选地，至少具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性；更优选地，其中linker序列可进行替换。
12、具体的，所述linker为柔性linker，其序列所述连接肽为ggggsggggsggggs(seqid no：6)连接肽、ggggs(seq id no：7)连接肽、gggggggg(seq id no：8)连接肽、gggggg(seq id no：9)连接肽、eaaakeaaak(seq id no：10)连接肽、eaaak(seq id no：11)连接肽、papap(seq id no：12)连接肽、apapapapapapapap(seq id no：13)连接肽、kesgsvsseqlaqfrsld(seq id no：14)连接肽、aeaaakeaaakeaaakeaaakaleaeaaakeaaakeaaak(seq id no：15)连接肽、eaaaka(seq id no：32)和/或eaaakeaaakeaaak(seq id no：5)连接肽；更优选地，所述linker如seq id no：5-15所示。
13、进一步的，所述免疫原性组合物包括信号肽；优选地，所述信号肽选自组织型纤溶酶原激活物(tpa)信号肽、ag85a野生型信号肽、生长激素信号肽、重组人肿瘤抑制素m(人osm)、水泡性口炎病毒融合性外壳g糖蛋白(vsv-g)、小鼠ig kappa、小鼠重链、基底膜蛋白40(bm40)、人糜蛋白酶原、人胰蛋白酶原-2、人白细胞介素-2(人il-2)、虫荧光素酶、人血白蛋白(hsa)、流感血凝素、人胰岛素、蚕纤维蛋白lc中的一种或多种，更优选地，所述编码信号肽的氨基酸序列如seq id no：16-30所示。具体的，上述免疫原性组合物用于制备预防和/或治疗疾病的药物；优选地，所述疾病为肺结核。
14、本发明的一个方面，提供一种免疫原性组合物在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用；优选地，所述疾病为肺结核。
15、本发明的另一个方面，进一步提供一种多核苷酸分子，包括编码上述ag85a抗原或免疫原性片段的核酸分子、编码mtb32a抗原或免疫原性片段的核酸分子、编码mtb39a抗原或免疫原性片段的核酸分子。
16、本发明的另一个方面，进一步提供上述多核苷酸分子在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用；优选地，所述疾病为肺结核。
17、本发明的另一个方面，提供一种含有上述多核苷酸分子的载体。
18、本发明的另一个方面，进一步提供上述载体在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用；优选地，所述疾病为肺结核。本发明的另一个方面，优选的，所述载体为复制缺陷重组腺病毒。所述腺病为人腺病毒或黑猩猩腺病毒；优选的，为人腺病毒选自血清1型～血清57型的人腺病毒中的一种或多种；更优选的，所述人腺病毒为血清5型、26型或35型人腺病毒。
19、本发明的另一个方面，提供一种制备重组腺病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
20、(1)构建含有所述编码肺结核抗原肽或结构蛋白的多核苷酸的穿梭质粒载体；
21、(2)将步骤(1)所述穿梭质粒载体与骨架质粒一起转染入宿主细胞；
22、(3)培养步骤(2)所述宿主细胞；
23、(4)收获从步骤(3)所述细胞中释放的人复制缺陷重组腺病毒；
24、(5)对步聚(4)中的重组腺病毒进行扩大培养；
25、(6)对步聚(5)中的培养产物进行纯化。
26、本发明的另一个方面，提供一种重组腺病毒载体肺结核疫苗制剂，含有所述多核苷酸的人复制缺陷重组腺病毒，所述重组腺病毒被制备为注射剂或黏膜给药制剂。
27、具体的，所述的制剂为黏膜给药制剂，优选地，包括鼻黏膜、口腔黏膜或肺粘膜。
28、具体的，所述制剂为吸入给药制剂，为鼻吸入或经口吸入，优选地，为滴鼻剂、喷雾剂、雾化吸入剂或干粉吸入剂；更优选地，所述吸入给药制剂为液体吸入制剂或干粉吸入制剂。
29、具体的，所述疫苗还包含药学上可接受的辅料，所述药学上可接受的辅料包括不限于：缓冲剂、保护剂、稳定剂、表面活性剂、渗透压调节剂中的一种或多种。
30、具体的，所述黏膜给药制剂选自：液体剂型、固体剂型、半固体剂型；优选地为气雾剂、喷雾剂、滴鼻剂、粉雾剂、粉末剂、凝胶剂、微球剂、脂质体、膜剂、混悬剂；更优选地，所述黏膜给药制剂为喷雾剂或雾化给药制剂。
31、具体的，所述制剂组合中重组病毒载体的含量为1×108～1×1012vp/ml。
32、具体的，所述药学上可接受的辅料包括但不限于：缓冲剂、保护剂、稳定剂、表面活性剂、渗透压调节剂、佐剂、防腐剂、灭活剂或人源白蛋白中的一种或多种；优选地，为人血白蛋白；所述缓冲剂包括但不限于hepes、his、tris、pb、琥珀酸、柠檬酸中的一种或多种；所述保护剂包括但不限于明胶、乙醇、二乙氨四乙酸(edta)、二乙氨四乙酸二钠(edta-2na)和氯化镁中的一种或者多种；所述稳定剂包括但不限于蔗糖、甘露醇、岩藻糖和麦芽糖中的一种或多种；所述表面活性剂包括但不限于吐温、司盘、甘油中的一种或者多种；所述渗透压调节剂包括但不限于氯化钠或省去；优选地，所述辅料组分包括甘露醇，蔗糖，氯化钠，氯化镁，hepes，聚山梨酯80，甘油。
33、具体的，所述剂型为雾化吸入剂，所述疫苗经雾化给药装置雾化后形成粒径10μm以下的颗粒；优选地，0.5～10μm,更优选地，5～10μm。
34、本发明的另一个方面，提供一种重组腺病毒载体肺结核疫苗制剂的制备方法，包括以下步骤：制备编码结核分枝杆菌抗原的重组腺病毒载体；加入药学上可接受的辅料。
35、具体的，制备编码结核分枝杆菌ag85a抗原的重组腺病毒载体，任选的，加入药学上可接受的辅料；
36、或，
37、制备编码结核分枝杆菌mtb32a和mtb39a抗原的重组腺病毒载体，任选的，加入药学上可接受的辅料；
38、或，
39、制备编码结核分枝杆菌mtb32a、mtb39a和ag85a抗原的重组腺病毒载体，任选的，加入药学上可接受的辅料；
40、或，
41、分别制备编码结核分枝杆菌ag85a抗原的重组腺病毒载体及编码结核分枝杆菌mtb32a和mtb39a抗原(tb75k)的重组腺病毒载体，混合，任选的，加入药学上可接受的辅料。
42、具体的，所述方法包括以下步骤：构建融合抗原序列；构建质粒；将所得重组腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒大部分基因组的骨架质粒共转染包装；
43、优选地，利用基因工程的方法,
44、构建ag85a抗原序列；
45、或，
46、构建mtb32a和mtb39a(tb75k)融合抗原序列；
47、或，将含mtb32a和mtb39a(tb75k)融合抗原序列和ag85a抗原序列使用连接肽(即linker)连接；
48、更优选地，构建成tb75k-linker-ag85a或ag85a-linker-tb75k融合抗原。
49、具体的，还包括以下步骤：将所述共转染包装后的原始毒株种子加入相应辅料，即得到该疫苗。
50、具体地，编码结核分枝杆菌tb75k、ag85a融合抗原蛋白的重组腺病毒载体的构建步骤包括：
51、(1)构建pdc316-tb75k-ag85a和pdc316-ag85a-tb75k质粒
52、将合成完毕的tb75k、ag85a融合蛋白基因片段，酶切，回收酶切片段。同时，将admax腺病毒系统的穿梭质粒载体进行酶切，回收载体。使用同源重组的方法将tb75k-ag85a片段连接于载体上，化转感受态，涂布平板。挑单克隆进行划线接种同时进行菌落pcr鉴定。随后取划线平板中的阳性克隆单克隆进行培养，提取质粒进行酶切鉴定。取10个酶切鉴定阳性克隆进行序列测定，将测序鉴定正确的载体记为pdc316-tb75k-ag85a。
53、(2)重组腺病毒ad5，tb75k、ag85a毒种包装
54、将穿梭质粒pdc316-tb75k-ag85a、pdc316-ag85a-tb75k和admax腺病毒系统的骨架质粒，通过共转染的方法进行ad5-tb75k-ag85a和ad5-ag85a-tb75k的包装。
55、具体地，本发明还提供一种多组分重组腺病毒载体新型肺结核疫苗制剂组合物的制备以及其在预防和/或治疗疾病中的应用；优选地，所述疾病为肺结核。
56、本发明的一个方面，提供一种重组腺病毒载体肺结核疫苗的制剂组合物在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用；优选地，所述疾病为肺结核。
57、术语“抗原或免疫原性片段”是指一种能够刺激免疫系统产生免疫应答的物质。
58、“融合抗原”是指具有至少两个异源性的抗原直接或通过氨基酸接头连接。融合抗原可以是任何顺序。
59、本发明相比现有技术的有益效果为：
60、本发明的免疫组合物通过结核分枝杆菌三抗原，解决了1)现有皮下注射的卡介苗和肌肉注射的结核病疫苗不能高水平诱导机体免疫反应的问题；2)在众多肺结核抗原中，筛选抗原组合，在不影响抗原表达的情况下，实现互相促进免疫反应，综合提高免疫效果。
61、本发明的另一个方面，提供了一种表达融合抗原的载体，在对机体进行免疫后，诱导产生高水平的抗原特异性抗体产生良好的细胞免疫应答。此外本发明的免疫组合物在肺部和系统都能产生高水平的细胞免疫应答。本发明提供的腺病毒载体重组肺结核疫苗具有良好的稳定性、安全高效。
62、本发明的一个方面，本发明疫苗制剂利用呼吸道黏膜递送的方式给药，较注射不仅具有顺应性，而且给药剂量更低，还可产生体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫的三重免疫效果。本发明提供的疫苗组合物可以用于基础免疫或加强免疫。
63、本发明的一个方面，本发明疫苗经适宜的设备雾化后，可产生3～10μm之间，优选地，5～10μm粒径均一度较佳的气溶胶颗粒。其经鼻腔或口腔吸入可到达肺部，从而产生对整个呼吸道，以及肺部的保护性免疫反应，增强疫苗的有效利用率，提高疫苗的效果。
技术特征：
1.一种免疫原性组合物，包括结核分枝杆菌mtb32a抗原或其免疫原性片段，mtb39a抗原或其免疫原性片段和ag85a抗原或其免疫原性片段。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述mtb32a和mtb39a为融合抗原(tb75k)。
3.根据权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其特征在于，mtb32a、mtb39a和ag85a为融合抗原。
4.根据权利要求3所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述ag85a与mtb32a、mtb39a(tb75k)通过linker融合；优选地，为ag85a-linker-tb75k或tb75k-linker-ag85a。
5.根据权利要求1-4中任一项所述免疫原性组合物在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用。
6.一种多核苷酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码ag85a抗原或其免疫原性片段的核酸分子、编码mtb32a抗原或其免疫原性片段的核酸分子、编码mtb39a抗原或其免疫原性片段的核酸分子。
7.根据权利要求6所述的多核苷酸分子，其特征在于，在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用。
8.一种含有权利要求6所述的多核苷酸分子的载体。
9.根据权利要求8所述的载体，其特征在于，所述载体为复制缺陷重组腺病毒；所述腺病为人腺病毒或黑猩猩腺病毒；优选的，为人腺病毒选自血清1型～血清57型的人腺病毒中的一种或多种；更优选的，所述人腺病毒为血清5型、26型或35型人腺病毒。
10.根据权利要求8或9所述的载体在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用。
11.一种制备权利要求9所述的重组腺病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
12.一种重组腺病毒载体肺结核疫苗制剂，其特征在于，含有权利要求11所述多核苷酸的人复制缺陷重组腺病毒，所述重组腺病毒被制备为注射剂或黏膜给药制剂。
13.根据权利要求12所述的重组腺病毒载体肺结核疫苗制剂，所述黏膜给药制剂，包括鼻黏膜、口腔黏膜或肺粘膜。
14.根据权利要求13所述的重组腺病毒载体肺结核疫苗制剂，所述黏膜给药制剂为吸入给药制剂，为鼻吸入或经口吸入，优选地，为滴鼻剂、喷雾剂、雾化吸入剂或干粉吸入剂；更优选地，所述吸入给药制剂为液体吸入制剂或干粉吸入制剂。
15.根据权利要求12-14任一项所述的重组腺病毒载体肺结核疫苗制剂，其特征在于，所述疫苗还包含药学上可接受的辅料，所述药学上可接受的辅料包括不限于：缓冲剂、保护剂、稳定剂、表面活性剂、渗透压调节剂中的一种或多种。
16.根据权利要求12-15任一项所述的重组腺病毒载体肺结核疫苗制剂，其特征在于，所述黏膜给药制剂选自：液体剂型、固体剂型、半固体剂型；优选地为气雾剂、喷雾剂、滴鼻剂、粉雾剂、粉末剂、凝胶剂、微球剂、脂质体、膜剂、混悬剂；更优选地，所述黏膜给药制剂为喷雾剂或雾化给药制剂。
17.根据权利要求12-16任一项所述的重组腺病毒载体肺结核疫苗制剂，其特征在于，所述药学上可接受的辅料包括但不限于：缓冲剂、保护剂、稳定剂、表面活性剂、渗透压调节剂、佐剂、防腐剂、灭活剂或人源白蛋白中的一种或多种；优选地，为人血白蛋白；所述缓冲剂包括但不限于hepes、his、tris、pb、琥珀酸、柠檬酸中的一种或多种；所述保护剂包括但不限于明胶、乙醇、二乙氨四乙酸(edta)、二乙氨四乙酸二钠(edta-2na)和氯化镁中的一种或者多种；所述稳定剂包括但不限于蔗糖、甘露醇、岩藻糖和麦芽糖中的一种或多种；所述表面活性剂包括但不限于吐温、司盘、甘油中的一种或者多种；所述渗透压调节剂包括但不限于氯化钠或省去；优选地，所述辅料组分包括甘露醇，蔗糖，氯化钠，氯化镁，hepes，聚山梨酯80，甘油。
18.根据权利要求12-17任一所述的重组腺病毒载体肺结核疫苗制剂，其特征在于，所述剂型为雾化吸入剂，所述疫苗经雾化给药装置雾化后形成粒径10μm以下的颗粒；优选地，0.5～10μm,更优选地，5～10μm。
19.一种权利要求12-18任一项所述的重组腺病毒载体肺结核疫苗制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：制备编码结核分枝杆菌抗原的重组腺病毒载体；加入药学上可接受的辅料。
20.根据权利要求19所述的重组腺病毒载体肺结核疫苗制剂的制备方法，其特征在于，制备编码结核分枝杆菌ag85a抗原的重组腺病毒载体，任选的，加入药学上可接受的辅料；
21.根据权利要求20所述重组腺病毒载体肺结核疫苗制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：构建融合抗原序列；构建质粒；将所得重组腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒大部分基因组的骨架质粒共转染包装。
22.根据权利要求17-21中任一项所述重组腺病毒载体肺结核疫苗制剂的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：将所述共转染包装后的原始毒株种子加入相应辅料，即得到该疫苗。
23.一种根据权利要求19-22中任一项所述的重组腺病毒载体肺结核疫苗制剂在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用；优选地，所述疾病为肺结核。
技术总结
本发明涉及一种免疫原性组合物，本发明免疫原性组合物包括一种或多种肺结核抗原。在对机体进行吸入黏膜免疫后，不仅可以同时在肺部和机体内产生针对结核分枝杆菌的高水平特异性抗体，还可以刺激产生很高的细胞免疫反应。
技术研发人员：徐方,朱涛,彭少丹,邵娟,苗伟,汤雪,赵晓龙,司伟雪
受保护的技术使用者：康希诺生物股份公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23