用于多重基因分型的通用组合物和方法
本技术涉及遗传变异多靶标检测，具体涉及通过核酸杂交检测遗传变异的引物和探针以及方法。本技术还涉及诊断、预后和药品/治疗效率监测的领域。
背景技术：
1、多重rt-pcr的成本低且易使用性高，其通常通过引入几对扩增引物和检测报告探针实现(参见文献r.j.dikdan,s.a.e.marras,a.p.field,a.brownlee,a.cironi,d.a.hill,s.tyagi,multiplex pcr assays for identifying all major severe acuterespiratory syndrome coronavirus 2variants,j.mol.diagnostics.24(2022)309-319.https://doi.org/10.1016/j.jmoldx.2022.01.004)。常规rt-pcr的每个反应的测试通量是关键问题，因为pcr热循环仪的荧光通道限制在5至6个。作为可选方案，结合了基于探针的熔解曲线分析的pcr扩增解决了通量问题，因为可以通过设计具有不同熔解温度和不同荧光修饰的探针来提高测试容量(参见文献d.hur,m.s.kim,m.song,j.jung,h.park,detection of genetic variation using dual-labeled peptide nucleic acid(pna)probe-based melting point analysis,biol.proced.online.17(2015)1-12.https://doi.org/10.1186/s12575-015-0027-5)。然而，rt-pcr仍然存在局限性，包括系统复杂性增加、修饰成本以及对探针设计的高要求。此外，可以使用微阵列技术进行高通量基因分型分析(参见文献g.feng,w.han,j.shi,r.xia,j.xu,analysis of the application of agene chip method for detecting mycobacterium tuberculosis drug resistance inclinical specimens:a retrospective study,sci.rep.11(2021)1-11.https://doi.org/10.1038/s41598-021-97559-y)，其中将数百至数千种不同的探针固定在基因芯片上并进行荧光标记。这种寡核苷酸探针杂交方法涉及使用合理设计的序列以查询特定突变位点，并且荧光读数可以确定样品中存在哪些突变。这项技术需要专业设备和软件以处理来自基因芯片的原始荧光数据，并且芯片的制造成本很高(参见文献g.russo,c.zegar,a.giordano,advantages and limitations of microarray technology in humancancer,oncogene.22(2003)6497-6507.https://doi.org/10.1038/sj.onc.1206865)。当前的策略已转向基于测序的技术(参见文献m.gulilat,t.lamb,w.a.teft,j.wang,j.s.dron,j.f.robinson,r.g.tirona,r.a.hegele,r.b.kim,u.i.schwarz,targeted nextgeneration sequencing as a tool for precision medicine,bmc med.genomics.12(2019)1-17.https://doi.org/10.1186/s12920-019-0527-2)，这是由于该技术具有更强的通用性。理论上，dna测序可用于鉴定整个基因组中的突变，而无需为每一组待测试的突变提供定制芯片。还可以引入反转录步骤以确定通过rna测序的基因表达谱(参见文献m.hong,s.tao,l.zhang,l.t.diao,x.huang,s.huang,s.j.xie,z.d.xiao,h.zhang,rnasequencing:new technologies and applications in cancer research,j.hematol.oncol.13(2020)1-16.https://doi.org/10.1186/s13045-020-01005-x)。然而，这些强大的技术应用于遗传疾病筛查是昂贵、费时又费力的。通常，只有当受试者在一级筛查中呈阳性时，才将会进行二级确证试验。一级筛查方法必须便宜、快速且具有高度多重性，因为主要目标是从大量样品中标记被怀疑罹患遗传疾病的受试者。因此，合理设计的基于寡核苷酸探针的检测方法是适合用于此目的的候选方法。
2、目前用于多重基因分型的黄金标准方法是在一个闭合管反应中的实时聚合酶链反应(pcr)(参见文献h.wang,j.a.miller,m.verghese,m.sibai,d.solis,k.o.mfuh,b.jiang,n.iwai,m.mar,c.h.huang,f.yamamoto,m.k.sahoo,j.zehnder,b.a.pinsky,multiplex sars-cov-2genotyping reverse transcriptase pcr for population-levelvariant screening and epidemiologic surveillance,j.clin.microbiol.59(2021).https://doi.org/10.1128/jcm.00859-21)。通过taqman(roche molecular systems,inc.，布兰斯堡，新泽西州，美国)水解探针的多重pcr分析已广泛应用于不同核酸试样的检测(参见文献r.j.dikdan,s.a.e.marras,a.p.field,a.brownlee,a.cironi,d.a.hill,s.tyagi,multiplex pcr assays for identifying all major severe acuterespiratory syndrome coronavirus 2variants,j.mol.diagnostics.24(2022)309-319.https://doi.org/10.1016/j.jmoldx.2022.01.004)，但是一个反应中的测试容量受到限制，因为一个taqman探针只能区分一个靶标，并且市售qpcr仪器通常仅支持5个至6个荧光团通道。相反，基于探针的高分辨率熔解(hrm)曲线分析(参见文献a.vaupel,b.hommel,l.beule,high-resolution melting(hrm)curve analysis as a potentialtool for the identification of earthworm species and haplotypes,peerj.10(2022).https://doi.org/10.7717/peerj.13661)由于其高通量成为鉴定基因突变或多个核酸序列的有力工具，其能够在相差仅仅只有一个碱基对的pcr扩增子之间进行区分。通常通过在至多6个荧光通道中设计具有不同熔解温度(tm)的不同长度的探针从而扩大测试容量。双头标记taqman探针(参见文献q.huang,z.liu,y.liao,x.chen,y.zhang,q.li,multiplex fluorescence melting curve analysis for mutation detection withdual-labeled,self-quenched probes,plos one.6(2011).https://doi.org/10.1371/journal.pone.0019206)是当前熔解曲线分析的市售试剂盒中最常用的报告系统。通过不对称pcr产生单链扩增子后，荧光团和猝灭剂标记的探针能够检测至多15个呼吸道病原体(参见文献s.liao,l.wang,x.ji,j.chen,q.li,l.ma,simultaneous detection of15respiratory pathogens with a fluorescenceprobe melting curve analysis-basedmultiplex real-time pcr assay.,int.j.mol.epidemiol.genet.10(2019)29-37.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31149327％0ahttp://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi？artid＝pmc6526376)。然而，多重熔解曲线法检测过程仍存在一些局限性。由于一个靶序列需要一个taqman探针(参见文献w.yu,j.yao,z.zhang,simultaneous detection of three genotypes of gene methylenetetrahydrofolate reductase and methionine synthase reductase based onmultiplex asymmetric real-time pcr-hrm biosensing,(2022).https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c02096)，报告探针的设计仍然非常耗时，并且荧光和猝灭剂修饰的成本很高。此外，所需荧光探针的增加将导致荧光背景的增加和测试灵敏度的降低(参见文献x.zhuang,x.lu,h.l.l.yu,i.-m.hsing,unique barcoded primer-assisted sample-specific pooled testing(uni-pool)for large-scale screening of viralpathogens,anal.chem.(2022)acs.analchem.1c05204.https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c
3、05204)。
4、因此，需要适用于检测多个变异基因座或多个核酸样品的通用组合物和方法以解决上述问题。
技术实现思路
1、本技术涉及遗传变异的检测。本技术提供了通过核酸杂交检测遗传变异的引物和探针以及方法，特别是当与靶核苷酸序列结合且存在猝灭剂标记的探针时、以及当由靶核苷酸序列释放且不存在猝灭剂标记的探针时，通过测定荧光团标记的探针的荧光检测遗传变异的引物和探针以及方法。
2、在某些实施方案中，本技术的方法可用于检测传染性介质(例如，细菌或病毒)中的遗传变异、或可检测的可引起疾病或与疾病相关的遗传变异，包括由单核苷酸多态性(snp)指示的疾病。
3、本技术还涉及这些引物和探针，还涉及药物组合物，涉及生物组合物，涉及检测试剂盒，并且涉及诊断试剂盒。
技术特征：
1.一种用于靶核苷酸序列的多重基因分型的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述m1寡核苷酸的长度为约25个至约60个碱基，所述m1寡核苷酸的与所述猝灭剂标记的通用型寡核苷酸互补的核苷酸序列的长度为约5个至约50个碱基，并且所述m1寡核苷酸的与所述靶核苷酸序列互补的核苷酸序列的长度为约5个至约50个碱基。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述m1寡核苷酸的与所述靶核苷酸序列互补的核苷酸序列为与所述靶核苷酸序列的约40％至100％互补。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述m2寡核苷酸的长度为约25个至约60个碱基，所述m2寡核苷酸的与所述荧光团标记的通用型寡核苷酸互补的核苷酸序列的长度为约5个至约50个碱基，并且所述m2寡核苷酸的与所述靶核苷酸序列互补的核苷酸序列的长度为约5个至约50个碱基。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述m2寡核苷酸的与所述靶核苷酸序列互补的核苷酸序列为与所述靶核苷酸序列的约40％至100％互补。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述荧光团标记的通用型寡核苷酸的长度为约15个至约35个碱基，并且所述猝灭剂标记的通用型寡核苷酸的长度为约15个至约35个碱基。
7.根据权利要求1所述的方法，其中各m1寡核苷酸和各m2寡核苷酸的熔解温度在约30℃至约80℃之间。
8.根据权利要求1所述的方法，包括：
9.根据权利要求8所述的方法，其中各m1寡核苷酸和各m2寡核苷酸的熔解温度在约30℃至约80℃之间。
10.一种用于靶核苷酸序列的多重基因分型的方法，所述方法包括：
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述m1'寡核苷酸的长度为约25个至约60个碱基，所述m1'寡核苷酸的与所述猝灭剂标记的通用型寡核苷酸互补的核苷酸序列的长度为约5个至约50个碱基，并且所述m1'寡核苷酸的与所述靶核苷酸序列互补的核苷酸序列的长度为约5个至约50个碱基。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述m1'寡核苷酸的与所述靶核苷酸序列互补的核苷酸序列为与所述靶核苷酸序列的约40％至100％互补。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述荧光团标记的通用型寡核苷酸的长度为约15个至约35个碱基，并且所述猝灭剂标记的通用型寡核苷酸的长度为约15个至约35个碱基。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述m1'寡核苷酸的熔解温度在约30℃至约80℃之间。
15.根据权利要求10所述的方法，包括：
16.根据权利要求15所述的方法，其中各m1'寡核苷酸的熔解温度在约30℃至约80℃之间。
17.一种用于靶核苷酸序列的多重基因分型的方法，所述方法包括：
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述m1寡核苷酸的长度为约25个至约60个碱基，所述m1寡核苷酸的与所述荧光团标记的通用型寡核苷酸互补的核苷酸序列的长度为约5个至约50个碱基，并且所述m1寡核苷酸的与所述靶核苷酸序列互补的核苷酸序列的长度为约5个至约50个碱基。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述m1寡核苷酸的与所述靶核苷酸序列互补的核苷酸序列为与所述靶核苷酸序列的约40％至100％互补。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述荧光团标记的通用型寡核苷酸的长度为约15个至约35个碱基，并且所述猝灭剂标记的通用型寡核苷酸的长度为约15个至约35个碱基，并且所述猝灭剂标记的通用型寡核苷酸的与所述靶核苷酸序列互补的核苷酸序列的长度为约5个至约50个碱基。
21.根据权利要求17所述的方法，其中所述m1寡核苷酸和所述猝灭剂标记的通用型寡核苷酸的熔解温度在约30℃至约80℃之间。
22.根据权利要求17所述的方法，包括：
23.根据权利要求17所述的方法，其中各m1寡核苷酸和所述猝灭剂标记的通用型寡核苷酸的熔解温度在约30℃至约80℃之间。
技术总结
本申请涉及核酸分子的多重检测。本申请提供了用荧光团和猝灭剂标记的通用型寡核苷酸，以及具有与多个变异基因座或多个核酸样品的检测普遍相匹配的靶结合区的寡核苷酸。此外，本公开还描述了通过不对称标记的扩增标记检测靶并区分靶序列的方法。
技术研发人员：邢怡铭,庄鑫宇
受保护的技术使用者：香港科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23