一种用于修复石油污染土壤的微生物菌剂及制备方法

本发明涉及生物工程，具体为一种用于修复石油污染土壤的微生物菌剂及制备方法。

背景技术：

1、石油是一种主要由烷烃、烯烃和芳香烃等碳氢化合物组成的具有重要意义的化石燃料，号称“工业之血”。它的外观呈褐色粘稠状，密度为0.8~1.0g/cm3，其凝固点的范围为30~60℃，沸点在500℃以上，是各种经济和社会领域使用的重要燃料和化学原料。随着经济的快速发展导致了石油产品消费的持续扩张，在石油勘探、开发、运输、贮藏以及加工过程中，各个环节所产生的原油及其产品进入到环境中，严重破坏土壤生态系统功能。土壤中含有大量的生物和有机及无机胶体，石油进入土壤中会改变其理化性质，堵塞土壤孔道，使得植物生长受阻，甚至会产生毒性作用，植物富集一些石油污染物中的有毒有害物质，被生物食用后，污染物质就会进入食物链，最终威胁人类健康，而且石油污染物进入土壤之后会进一步通过扩散、迁移以及雨水冲刷等因素增加污染范围，引起严重的二次污染，增加了石油污染土壤的修复难度。

2、目前常用的石油污染土壤修复方法有物理修复法、化学修复法和生物修复法，微生物修复是生物修复法中最重要的一种修复方式，自然界中已知的对土壤中石油有降解作用的微生物大约有70多种属，目前被广泛应用于石油降解的微生物种类包括细菌、真菌和放线菌等。由于微生物修复法具有易于操作、成本较低、无二次污染、处理场合多样等众多优势，其在石油污染的环境修复过程中起着重要作用。但是目前石油污染土壤的生物修复技术主要集中于筛选高活性菌株以及开发菌剂的强化使用方法，忽视了生物修复过程中石油污染物迁移扩散过程引起的二次污染问题；而且现有的微生物菌剂制备方式和条件繁琐复杂，成本高，对土壤的修复效果差，因此，提供一种用于修复石油污染土壤的微生物菌剂及制备方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种用于修复石油污染土壤的微生物菌剂及制备方法，以解决上述背景技术提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于修复石油污染土壤的微生物菌剂，所述微生物菌剂为放线菌东方拟无枝酸菌zel-1（ amycolatopsis orientaliszel-1），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2023年12月07日，保藏编号为cctccno: m 20232480，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。

3、一种用于修复石油污染土壤的微生物菌剂的制备方法，具体步骤如下：

4、s1、制备培养基；

5、高氏一号液体培养基：可溶性淀粉20g/l，氯化钠0.5g/l，三水合磷酸氢二甲0.5g/l，硝酸钾1g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，七水合硫酸亚铁0.01g/l；

6、高氏一号固体培养基：可溶性淀粉20g/l，氯化钠0.5g/l，三水合磷酸氢二甲0.5g/l，硝酸钾1g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，七水合硫酸亚铁0.01g/l，琼脂20g/l；

7、s2、培养菌悬液；

8、取-80℃超低温冰箱冷藏的东方拟无枝酸菌zel-1菌液，接种于100ml 高氏一号液体培养基中，锥形瓶中加入6mm玻璃珠平铺瓶底，震荡培养2d；将培养后的菌液涂布接种于高氏一号固体培养基的平板上，于37℃恒温培养箱培养3~4d得到单菌落；从平板上挑取单菌落接种于100ml 高氏一号液体培养基中，震荡培养2d；将菌液按照1%（v/v）的接种量转接至100ml 高氏一号液体培养基中，震荡培养至od600约为2.0；取全部 amycolatopsis  orientalis zel-1菌液于50ml离心管中，离心，弃上清，用无碳源培养基重复洗涤3次，调整其od600约为2.0。

9、作为本发明的一种优选技术方案，步骤s2中的接种量为1%（v/v），震荡培养条件为37℃，180rpm/min；离心为4℃、6000rpm/min、下离心10min。

10、本发明的有益效果是：本发明中采用的菌株东方拟无枝酸菌zel-1，为本实验室前期从残留有农用地膜的土壤中分离筛选得到的一株放线菌，培养条件简单，相较于其他放线菌，能有效降解聚乙烯及石油烃等烷烃类物质，改善土壤生态环境。

11、本发明提供了一种用于修复石油污染土壤的微生物菌剂的制备方法，与现有方案相比较，该制备方法具有操作流程简便的特点，制备的菌剂具有菌体活力和菌体浓度相近的优点，可较好的排除实验误差。

技术特征：

1.一种用于修复石油污染土壤的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂为放线菌东方拟无枝酸菌zel-1（amycolatopsis orientalis zel-1），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2023年12月07日，保藏编号为cctcc no: m 20232480，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。

2.一种如权利要求1所述的用于修复石油污染土壤的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

3.根据权利要求2所述的用于修复石油污染土壤的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：步骤s2中的接种量为1%（v/v），震荡培养条件为37℃，180rpm/min；离心为4℃、6000rpm/min、下离心10min。

技术总结
本发明公开了一种用于修复石油污染土壤的微生物菌剂及制备方法，涉及生物工程技术领域，所述微生物菌剂为放线菌东方拟无枝酸菌ZEL‑1（Amycolatopsis orientalis ZEL‑1），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2023年12月07日，保藏编号为CCTCC NO:M 20232480，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。本发明中采用的菌株东方拟无枝酸菌ZEL‑1，为本实验室前期从残留有农用地膜的土壤中分离筛选得到的一株放线菌，培养条件简单，相较于其他放线菌，能有效降解聚乙烯及石油烃等烷烃类物质，改善土壤生态环境。本发明提供的制备方法与现有方案相比较，该制备方法具有操作流程简便的特点，制备的菌剂具有菌体活力和菌体浓度相近的优点，可较好的排除实验误差。

技术研发人员：邵欢欢,李维,陶向,何欣怡,雍彬
受保护的技术使用者：四川师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23