具有增强单分子定序特性的工程化DNA聚合酶的制作方法

本发明涉及一种工程化dna聚合酶，且涉及一种具有增强的单分子定序特性的工程化dna聚合酶。

背景技术：

1、dna聚合酶在许多应用中发挥重要作用，例如核酸定序、核酸扩增、选殖、蛋白质工程、诊断、分子医学和许多其他技术。在单分子定序应用中，对良好dna聚合酶的要求包括：对核苷酸类似物具有高亲和力、降低核酸外切酶活性、提高持续合成能力(增强dna结合稳定性)、蛋白质热稳定性、准确性、序列读取长度等。dna聚合酶复制生物体的基因组。除了在生物学中发挥此核心作用外，dna聚合酶也是生物技术中无所不在的工具。

2、近年来，已发现dna聚合酶突变体具有多种有用的特性。需要额外的修饰聚合酶，例如显示出可用于单分子定序(sms)和其他聚合酶应用(例如dna扩增、定序、标记、检测、选殖等)的改进特性的修饰聚合酶。

技术实现思路

1、本发明提供了一种工程化dna聚合酶，其与野生型dna聚合酶相比具有增强的单分子定序特性，其包括突变位点和功能域的组合，其中突变位点和功能域的组合包含热稳定性突变位点、低kd突变位点、核酸外切酶缺陷位点和dna结合域。

2、在本发明的一实施例中，工程化dna聚合酶包括工程化phi29 dna聚合酶。

3、在本发明的一实施例中，工程化phi29 dna聚合酶包括突变y224k、e239g、v250i、l253a、e375y、a437g、a484e、e508r、d510k、k512y、e515q和d570m。

4、在本发明的一实施例中，热稳定性突变位点包括m8r、v51a、m97t、g197d和e221k。

5、在本发明的一实施例中，低kd突变位点包括e375突变为a或s或e379突变为s。

6、在本发明的一实施例中，核酸外切酶缺陷位点包括k143突变为d、a或s，或y148突变为l。

7、在本发明的一实施例中，dna结合域包括10his-sso7d或hhh2。

8、基于上述，本发明通过组合dna结合域和与较低的核酸外切酶活性、对修饰的dntp的较高亲和力及热稳定性相关的突变位点，提供了具有增强的单分子定序特性的工程化dna聚合酶。在本发明的一实施例中，修饰的dn a聚合酶(phi29_y224k_e239g_v250i_l253a_e375y_a437g_a484e_e508r_d510k_k512y_e515q_d570m+m 0his-sso7d)具有更高的准确度和更长的序列读取长度。

9、为使上述内容更清楚易懂，以下结合附图以多个实施例进行详细说明。

技术特征：

1.一种工程化dna聚合酶，其特征在于，与野生型dna聚合酶相比，具有增强的单分子定序特性，包括突变位点和功能域的组合，其中所述突变位点和所述功能域的组合包括热稳定突变位点、低kd突变位点、核酸外切酶缺陷位点及dna结合域。

2.根据权利要求1所述的工程化dna聚合酶，其特征在于，所述工程化dna聚合酶包括工程化phi29 dna聚合酶。

3.根据权利要求2所述的工程化dna聚合酶，其特征在于，所述工程化phi29 dna聚合酶包括突变y224k、e239g、v250i、l253a、e375y、a437g、a484e、e508r、d510k、k512y、e515q及d570m。

4.根据权利要求3所述的工程化dna聚合酶，其特征在于，所述热稳定突变位点包括m8r、v51a、m97t、g197d和e221k。

5.根据权利要求3所述的工程化dna聚合酶，其特征在于，所述低kd突变位点包括突变为a或s的e375或突变为s的e379。

6.根据权利要求3所述的工程化dna聚合酶，其特征在于，所述核酸外切酶缺陷位点包括k143突变为d、a或s，或y148突变为l。

7.根据权利要求3所述的工程化dna聚合酶，其特征在于，所述dna结合域包括10his-sso7d或hhh2。

技术总结
本发明提供一种具有增强单分子定序特性的工程化DNA聚合酶，与野生型DNA聚合酶相比，具有增强的单分子定序特性，包括突变位点和功能域的组合，其中突变位点和功能域的组合包含热稳定突变位点、低Kd突变位点、核酸外切酶缺陷位点及DNA结合域。

技术研发人员：陈道田,陈雅辰,林钰璇,周奕婷,蔡廷岳,颜畿府,潘诏智
受保护的技术使用者：体学生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23