一种酵母表面展示的重组狂犬病病毒糖蛋白抗原、动物狂犬病口服疫苗及应用

本发明涉及疫苗，特别涉及一种酵母表面展示的重组狂犬病病毒糖蛋白抗原、动物狂犬病口服疫苗及应用。

背景技术：

1、狂犬病是由嗜神经的狂犬病病毒(rabies virus，rabv)引起的致命性人兽共患传染病，病死率接近100％。犬、猫等家养和流浪动物是携带rabv的主要宿主，约99％的患者是被这些动物咬伤或抓伤后而患病。尽管目前针对狂犬病所研发使用的疫苗已经取得了很大的成功，但是针对世界范围内的野生动物及流浪猫狗的免疫仍是预防狂犬病的一大难题。流浪动物和野生动物很难进行集中的抓捕和免疫，因此，人们考虑了利用口服诱饵对其进行免疫的方法。那么研发出高效且成本低廉的口服疫苗则成为近年来狂犬病疫苗开发的热点。

2、口服疫苗是通过口服给药的途径将疫苗输送至动物机体内，使得动物对相应的病原体产生疫苗免疫反应的新型疫苗。因此，将狂犬病疫苗制备为口服剂并投放至野生动物生活的环境就有可能控制野生动物以及犬群体内流行的狂犬病毒。在上世纪，有多个国家实施了口服疫苗投放行动，效果显著，其中狂犬病毒sag2减毒疫苗帮助瑞士、芬兰、法国、意大利、爱沙尼亚等欧洲国家完成了消除狂犬病的目标(mahl p et al.twenty yearexperience of the oral rabies vaccine sag2 in wildlife:a global review[j].veterinary research.2014,45(1):77.)。还有一类狂犬病口服疫苗是表达狂犬病病毒era株糖蛋白的重组牛痘病毒，被成功应用于野生动物狂犬病的控制(slate d etal.status of oral rabies vaccination in wild carnivores in the united states[j].virus research,2005,111(1):68-76)。然而，口服狂犬病毒减毒活疫苗和重组痘病毒疫苗的安全性仍受质疑，因为世界各地报道了多起因人暴露于狂犬病毒口服疫苗后出现相关临床症状的案例(roess aaet al.national surveillance for human and petcontact with oral rabies vaccine baits,2001-2009[j].j am vet med assoc,2012,240(2):163-168.)，并且有的减毒活疫苗会在动物群体中水平传播，反而加重了狂犬病病毒的流行。

3、酵母菌是一种真菌，它对动物机体不会致病，安全性高，主要应用于人类的食品工业。目前，针对传染病的酵母口服疫苗给药系统主要采用了两种基本设计策略：第一种策略是在细胞表面展示多肽或蛋白质抗原，以便与免疫系统直接接触并引发免疫应答；第二种策略则是表达和分泌抗原，通过抗原的释放和机体摄取来激发免疫反应。其中，第一种策略是通过基因工程技术的改造，酵母菌可以将外源蛋白表达在酵母菌的表面，这种技术称为酵母表面展示技术。抗原蛋白直接呈现在酵母表面能够更有效地激活机体的免疫系统，产生更持久、更全面的免疫保护，是目前基于酵母平台口服疫苗的主流技术。酵母口服疫苗大多使用酿酒酵母中的α-凝集素aga1-aga2酵母表面展示(ysd)系统(zhang c.etal.saccharomyces cerevisiae cell surface display technology:strategies forimprovement and applications[j].frontiers in bioengineering andbiotechnology,2022,10:1056804)。将抗原蛋白与aga2蛋白融合表达，aga2蛋白在体内通过两个二硫键与细胞壁共价结合的aga1相连，从而将抗原蛋白展示在酵母表面。目前正在开发的基于酵母表面展示技术的候选口服疫苗越来越多，针对的病原包括h5n1甲型流感病毒、登革热病毒、非洲猪瘟病毒和sars-cov-2等(austriaco n.yeast oral vaccinesagainst infectious diseases[j].frontiers in microbiology,2023,14:1150412.)。有一项研究将狂犬病病毒的糖蛋白通过酿酒酵母进行分泌型表达制备口服疫苗的研究，但口服效果不是太理想，免疫小鼠的中和抗体效价未达到0.5iu/ml的保护水平(赵慧等.重组狂犬病病毒糖蛋白活酵母疫苗经小鼠口服给药后的免疫效果[j].中国生物工程杂志,2014,34(01):9-14.)。目前，暂无通过酵母表面展示技术将狂犬病病毒糖蛋白展示于酵母细胞表面作为口服疫苗的相关研究。

4、口服免疫最主要的是激活胃肠道黏膜免疫系统，主要是胃肠道相关的淋巴样组织(gut-associated lymphoid tissues，galts)，根据形态结构、分布及功能将galts分为淋巴滤泡和黏膜固有层中的弥散淋巴组织两部分，分别为免疫应答诱导部位和效应部位，二者共同发挥黏膜免疫屏障的作用(longet s.et al.targeted strategies for mucosalvaccination[j].bioconjugate chem,2018,29(3):613-623)。其中，诱导部位包括peyer氏结、m细胞(microfold cells)和树突状细胞等，主要负责对抗原进行捕获、处理和递呈，是免疫反应起始的部位。m细胞能够将肠腔内抗原输送至淋巴滤泡，进一步由抗原递呈细胞处理。在诱导黏膜免疫的过程中发挥重要作用，m细胞摄取抗原的多少直接关系到黏膜疫苗的免疫效力。利用靶向m细胞的特异性分子(配体)与抗原结合形成复合物可以增强抗原提呈能力，有效启动免疫反应，进而发挥黏膜免疫保护作用(azizi a.et al.enhancing oralvaccine potency by targeting intestinal m cells[j].plos pathog,2010,6(11):e1001147)。伊尔森氏鼠疫杆菌外膜蛋白h(outer membrane protein h，omph)β1α1螺旋区域通过与m细胞表面受体c5ar的结合，完成靶向m细胞的抗原递送(kim sh et al.m cellsexpressing the complement c5a receptor are efficient targets for mucosalvaccine delivery[j].eur j immunol,2011,41(11):3219-3229)。co1配体是通过噬菌体展示文库筛选出的具有m细胞靶向性的小肽，它能有效地将抗原递送到粘膜免疫诱导位点来诱导免疫反应(kim sh et al.the m cell-targeting ligand promotes antigendelivery and induces antigen-specific immune responses in mucosal vaccination[j].j immunol.2010,185(10):5787-5795)。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种酵母表面展示的重组狂犬病病毒糖蛋白(g)抗原。

2、本发明的另一目的在于提供一种动物狂犬病口服疫苗，该疫苗利用酵母表面展示技术制备得到，能以投喂的方式用于动物的口服免疫。

3、本发明的再一目的在于提供上述酵母表面展示的重组狂犬病病毒糖蛋白抗原和动物狂犬病口服疫苗的应用。

4、本发明的目的通过下述技术方案实现：

5、一种酵母表面展示的重组狂犬病病毒糖蛋白抗原，以去除信号肽的狂犬病病毒cvs-11标准毒株的糖蛋白胞外区序列作为抗原蛋白，其c端融合m细胞靶向配体omphβ1α1螺旋区域和co1中的至少一种；

6、所述的酵母表面展示的重组狂犬病病毒糖蛋白抗原，其氨基酸序列如seq idno.1或2所示；

7、编码上述酵母表面展示的重组狂犬病病毒糖蛋白抗原的基因，其核苷酸序列如seq id no.3或4所示；

8、一种与酵母表面展示的重组狂犬病病毒糖蛋白抗原相关的生物材料，为下述a1)至a3)中的任一种：

9、a1)含有编码酵母表面展示的重组狂犬病病毒糖蛋白抗原的基因的表达盒；

10、a2)含有编码酵母表面展示的重组狂犬病病毒糖蛋白抗原的基因的重组载体、或含有a1)所述表达盒的重组载体；

11、a3)含有编码酵母表面展示的重组狂犬病病毒糖蛋白抗原的基因的重组酵母菌、或含有a1)所述表达盒的重组酵母菌、或含有a2)所述重组载体的重组酵母菌；

12、所述的载体优选为pyd1载体，其信号肽为酵母转化酶信号肽ins；

13、一种表面展示的重组狂犬病病毒糖蛋白抗原的重组酵母菌，是将上述a3)中所述的重组酵母菌进行诱导表达得到；

14、所述的表面展示重组狂犬病病毒糖蛋白抗原的重组酵母菌的制备方法，包含如下步骤：

15、将上述a3)中所述的重组酵母菌在含质量分数为2％的半乳糖的ynb-caa培养基中培养至重组狂犬病病毒糖蛋白抗原在酵母表面展示；

16、所述的培养的条件优选为将重组酵母菌加入含质量分数为2％的半乳糖的ynb-caa培养基中，调整培养菌液od600＝0.5～1，然后30℃、225r/min振荡培养72h；

17、所述的酵母表面展示的重组狂犬病病毒糖蛋白抗原、编码酵母表面展示的重组狂犬病病毒糖蛋白抗原的基因、与酵母表面展示的重组狂犬病病毒糖蛋白抗原相关的生物材料或表面展示重组狂犬病病毒糖蛋白抗原的重组酵母菌在制备动物狂犬病口服疫苗中的应用；

18、一种动物狂犬病口服疫苗，包含上述表面展示重组狂犬病病毒糖蛋白抗原的重组酵母菌；

19、本发明的原理：

20、把经过诱导表达获得的酵母细胞应用于流浪犬等动物的口服免疫。

21、针对目前流浪动物、野生动物狂犬病疫苗免疫的难题，以及目前尚缺少安全有效的狂犬病口服疫苗等问题，本发明利用酵母表面展示技术，将狂犬病病毒糖蛋白的胞外抗原区(去除信号肽)连接至酿酒酵母aga2蛋白的c端，中间加gs柔性肽连接，并在狂犬病病毒糖蛋白抗原区的c端融合不同组合形式的肠道m细胞的靶向配体omphβ1α1螺旋区域和co1，用于增强免疫效果(图1)。将设计好的基因序列根据酿酒酵母的密码子偏好性进行优化，经合成后插入pyd1质粒上，然后将酿酒酵母eby100株作为载体，通过酿酒酵母eby100株进行诱导表达，在其表面展示狂犬病病毒糖蛋白的胞外抗原区。诱导表达后的重组酵母菌调整到一定浓度后可作为口服疫苗免疫小鼠，通过测定小鼠产出的病毒中和抗体水平及攻毒保护试验进行免疫效果评价。

22、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

23、(1)本发明在狂犬病病毒糖蛋白抗原区的c端融合了肠道m细胞的结合多肽omphβ1α1螺旋区域和co1，它进而能够增强抗原蛋白进入m细胞的递送能力，从而提高口服免疫效果。

24、(2)本发明利用酿酒酵母表面展示系统将融合m细胞靶向性多肽组合的狂犬病病毒糖蛋白的抗原区序列表达在酵母表面，得到一种具有优异口服免疫效果的候选疫苗，使其能够以投喂的方式免疫流浪动物或野生动物，以达到控制狂犬病流行的目的。

25、(3)酵母是一种天然存在且被广泛认可为安全的微生物，使用酵母表面展示技术制备的口服疫苗在安全性上具有优势，且酿酒酵母培养成本低廉，适合大规模生产。

26、(3)比针剂疫苗相比，本发明提供的口服疫苗更加容易免疫流浪动物以及野生动物。

技术特征：

1.一种酵母表面展示的重组狂犬病病毒糖蛋白抗原，其特征在于以去除信号肽的狂犬病病毒cvs-11标准毒株的糖蛋白胞外区序列作为抗原蛋白，其c端融合m细胞靶向配体omphβ1α1螺旋区域和co1中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的酵母表面展示的重组狂犬病病毒糖蛋白抗原，其特征在于其氨基酸序列如seq id no.1或2所示。

3.编码权利要求1或2所述的酵母表面展示的重组狂犬病病毒糖蛋白抗原的基因，其特征在于其核苷酸序列如seq id no.3或4所示。

4.一种与酵母表面展示的重组狂犬病病毒糖蛋白抗原相关的生物材料，其特征在于为下述a1)至a3)中的任一种：

5.根据权利要求4所述的与酵母表面展示的重组狂犬病病毒糖蛋白抗原相关的生物材料，其特征在于：

6.一种表面展示的重组狂犬病病毒糖蛋白抗原的重组酵母菌，其特征在于是将权利要求4或5中所述的a3)中所述的重组酵母菌进行诱导表达得到。

7.权利要求6所述的表面展示重组狂犬病病毒糖蛋白抗原的重组酵母菌的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

8.根据权利要求7所述的表面展示重组狂犬病病毒糖蛋白抗原的重组酵母菌的制备方法，其特征在于：

9.权利要求1或2所述的酵母表面展示的重组狂犬病病毒糖蛋白抗原、权利要求3所述的编码酵母表面展示的重组狂犬病病毒糖蛋白抗原的基因、权利要求4或5所述的与酵母表面展示的重组狂犬病病毒糖蛋白抗原相关的生物材料或权利要求6所述的表面展示重组狂犬病病毒糖蛋白抗原的重组酵母菌在制备动物狂犬病口服疫苗中的应用。

10.一种动物狂犬病口服疫苗，其特征在于包含权利要求6所述的表面展示重组狂犬病病毒糖蛋白抗原的重组酵母菌。

技术总结
本发明涉及疫苗技术领域，特别涉及一种酵母表面展示的重组狂犬病病毒糖蛋白抗原、动物狂犬病口服疫苗及应用。本发明利用酵母表面展示技术，将狂犬病病毒糖蛋白的胞外抗原区连接至酿酒酵母Aga2蛋白的C端，中间加GS柔性肽连接，并在狂犬病病毒糖蛋白抗原区的C端融合不同组合形式的肠道M细胞的靶向配体OmpHβ1α1螺旋区域和Co1，将设计好并经过密码子优化后的的基因序列插入pYD1质粒上，通过酿酒酵母EBY100株进行诱导表达，在其表面展示狂犬病病毒糖蛋白的胞外抗原区。诱导表达后的重组酵母菌可作为口服疫苗免疫小鼠。

技术研发人员：罗永文,钟凯宁,陈欣婷,黄敏仪,刘谕儒,毕水莲,郭霄峰
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23