一种具核梭杆菌疫苗及其制备方法与应用

本发明涉及疫苗，尤其是指一种具核梭杆菌疫苗及其制备方法与应用。

背景技术：

1、已经发现了超过1014种寄居在人体内的细菌，这些微生物群落通常在人类健康中扮演着重要角色。一些寄居于肿瘤中的细菌，包括伪黄单胞菌、链霉菌、糖多糖产生菌、克劳斯氏芽孢杆菌和鲁特乳杆菌，已知能够影响肿瘤的生长、转移以及对化疗、放疗和免疫疗法等不同治疗方式的疗效。最近的基因组研究揭示了肠道肿瘤和腺瘤中常见的口腔革兰氏阴性厌氧细菌——具核梭杆菌的普遍存在，并通过直接或间接干扰代谢途径等功能促进肿瘤发生。最近的一些研究还表明，具核梭杆菌能够激活癌细胞的自噬，从而导致对多种化疗药物的耐药性。此外，寄居于肿瘤内的具核梭杆菌可能会导致免疫抑制的肿瘤微环境的形成，如招募免疫抑制性的骨髓源性抑制细胞(mdscs)来阻碍肿瘤杀伤性自然杀伤细胞和t细胞的浸润。因此，消除肿瘤内的具核梭杆菌可能是改善具核梭杆菌感染肿瘤的治疗效果的合理选择。

2、抗生素可以有效杀灭细菌或抑制其生长，因此被广泛用于细菌感染的治疗。虽然抗生素是治疗细菌感染的重要药物，但其具有以下特点：首先，耐药性是一个严峻的问题，为了有效消除细菌，需要使用高剂量的抗生素，这可能导致产生耐药性细菌。过度或不正确使用抗生素会加速细菌对其的耐药性发展。其次，抗生素使用可能引起副作用，从轻微不适到严重不良反应。此外，大多数抗生素通常会不加区分地杀死细菌，包括益生菌和促肿瘤细菌，甚至可能导致肠道微生物群落的紊乱。抗生素具有选择性作用，只对特定类型的细菌有效，对病毒感染无效。最后，抗生素需要正确选择和使用，且有时需要进行细菌培养和药敏试验，这可能耗时和费资源。合理使用抗生素、遵循医生的建议，以及采取预防措施来减少感染的发生，是降低抗生素滥用和耐药性发展的关键。

3、细菌疫苗可能是克服非选择性细菌杀灭和耐药菌株增加等挑战的一种有前景的策略。细菌疫苗可以预防多种细菌引起的疾病，如百日咳、破伤风、流感嗜血杆菌感染等。常见的细菌疫苗包括百日咳疫苗、破伤风疫苗、肺炎球菌疫苗和流感嗜血杆菌疫苗等，一般来说，细菌疫苗的组成成分包括以下几个方面，抗原，佐剂和稳定剂，其中抗原常为灭活细菌或者减毒细菌，佐剂有氢氧化铝，矿化油，液体石蜡，糖脂体，吐温20，span80，cpg，poly(i:c)，r837，r848，cpg等，稳定剂有蔗糖，明胶等。

4、虽然细菌疫苗作为预防细菌感染的重要工具，也存在一些缺点和限制。细菌中的主要抗原是具有免疫原性较差的血清型特异性多糖，这使得生产有效的细菌疫苗面临困难。虽然添加了辅助剂如明胶铝、cpg和poly(i:c)可以增强体液免疫应答，但由于抗原特异性t细胞的激活不足，疫苗的效果仍然有限，而这些t细胞在特别是杀灭细胞内感染病原体方面起着关键作用。

5、因此，亟需开发一种安全高效的细菌疫苗以满足现有技术的需求。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种具核梭杆菌疫苗及其制备方法与应用。本发明开发了一种安全高效的细菌疫苗(lipofm-cpg)，通过将佐剂(胆固醇修饰的cpg寡核苷酸chol-cpg，即toll样受体(tlr)9激动剂)插入具核梭杆菌的细胞膜中。该膜含有高比例的多种细菌抗原，并且可以轻松进行修饰以引入额外的功能。与传统的灭活细菌乳剂和明胶铝辅助剂相比，具备抗原和佐剂共同传递能力的lipofm-cpg能够显著促进树突状细胞(dc)的成熟和抗原呈递，并触发强大的下游抗菌免疫应答。

2、研究表明，本发明的lipofm-cpg能够选择性而有效地消除细菌，成功克服细菌引起的化疗耐药性，提高化疗效果，并减少细菌感染的结直肠癌的转移。更有趣的是，与全身或口服抗生素相比，本发明的lipofm-cpg对肿瘤内和肠道微生物群落的影响微乎其微。据申请人所知，这是首次报告设计细菌疫苗以诱导针对肿瘤内具核梭杆菌的免疫应答，从而增强癌症治疗的潜力。这种细菌疫苗lipofm-cpg具有简单的制造工艺、强大的免疫原性和理想的生物相容性，可选择性地消除肿瘤内的细菌并改善细菌感染的癌症的治疗效果，是一种有前景的技术。

3、本发明通过以下技术方案实现：

4、本发明第一个目的是提供一种具核梭杆菌疫苗，所述具核梭杆菌疫苗包括具核梭杆菌细胞膜、稳定剂和佐剂；所述稳定剂与所述佐剂锚定在所述细菌细胞膜上。

5、进一步地，所述具核梭杆菌细胞膜是通过细菌裂解，蔗糖密度梯度离心提取得到的，其包含大量的膜蛋白。

6、进一步地，所述膜蛋白包括fap-2、fada、foma、radd、ompf、ompc和phoe中的一种或多种。

7、进一步地，所述具核梭杆菌疫苗的粒径为50nm-300nm。

8、进一步地，所述佐剂选自chol-cpg、单脂质a磷酸酯、poly(i:c)、2'3'-cgamp、脂多糖、氢氧化铝、角鲨烯、r837、r848、霍乱毒素、大肠杆菌热不稳定毒素、gs9688、qs-21、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、锰离子和胞壁酰二肽中的一种或多种。

9、进一步地，所述稳定剂通过将磷脂溶于有机溶剂，然后真空蒸发形成；所述磷脂选自二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、胆固醇、磷脂酰胆碱pc、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酸、二油酰磷脂酰乙醇胺、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷和dlin-mc3-dma中的一种或多种。

10、进一步地，所述具核梭杆菌疫苗的应用方式为皮内注射、吸入或口服。

11、本发明第二个目的是提供所述具核梭杆菌疫苗的制备方法，包括以下步骤：

12、将含有具核梭杆菌细胞膜和佐剂的缓冲液与稳定剂混合，经过间歇式超声和推挤通过聚碳酸脂膜后，得到所述具核梭杆菌疫苗。

13、进一步地，所述具核梭杆菌细胞膜的浓度为5μg/ml-1000μg/ml，优选为200μg/ml；所述佐剂的添加量为5nmol-1000nmol，优选为92nmol。

14、进一步地，所述间歇式超声的功率为100w-1000w；所述间歇式超声的时间为5min-60min。

15、进一步地，所述间歇式超声为超声1-5秒，停止5-10秒。

16、进一步地，所述聚碳酸脂膜的孔径≤200nm。

17、进一步地，所述稳定剂通过以下方式制备得到：

18、将dppc、胆固醇与dspe-peg溶于三氯甲烷中，通过真空蒸发形成薄膜状脂质层。

19、进一步地，所述dppc、胆固醇与dspe-peg的质量比为13:5:(4-8)，优选为9.58:3.19:3.19。

20、本发明第三个目的是提供所述具核梭杆菌疫苗在制备预防和/或治疗肿瘤的产品中的应用。

21、进一步地，所述肿瘤包括结肠癌，乳腺癌和胰腺癌中的一种或多种。

22、本发明所述的lipofm-cpg在激活抗肿瘤定植具核梭杆菌免疫反应，缓解具核梭杆菌引起的化疗耐药，减少具核梭杆菌引起的肿瘤转移，但是不影响肿瘤菌群和肠道菌群的丰度和组成中的应用。

23、进一步地，所述细菌疫苗被引流淋巴结摄取，实现抗原(具核梭杆菌细胞膜)和佐剂(chol-cpg)的共递送，引起抗细菌细胞免疫和体液免疫。lipofm-cpg引起的抗细菌细胞免疫和体液免疫可以有效地清除肿瘤部位的细菌。进一步缓解由细菌引起的化疗耐药和肿瘤转移。且该lipofm-cpg不影响肠道细菌的组成和丰度，也不影响肿瘤细菌的组成和丰度。

24、进一步地，所示化疗药包括5-氟尿嘧啶、氨甲蝶呤、奥沙利铂、环磷酰胺、阿霉素、紫杉醇，顺铂、吉西他滨、卡培他滨、培美曲塞、替吉奥、长春瑞滨、多西他赛、伊利替康、他莫昔芬和卡铂中的一种或多种。

25、本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

26、本发明提供了一种具核梭杆菌疫苗及其制备方法与应用。本发明通过将高度免疫刺激的佐剂(chol-cpg)插入自体源性的fm中，开发了一种简单的仿生lipofm-cpg，能够显著提高多种抗原/佐剂的共同传递给树突状细胞，最大限度地发挥它们实现有效抗原呈递和激活强大下游免疫反应的能力。这种lipofm-cpg表现出卓越的选择性预防和治疗效果，能够消除细菌而不影响肿瘤内和肠道微生物群落，并显著提高化疗的效率，减少细菌感染引起的癌症转移。

27、与传统的使用氢氧化铝和甲醛灭活的具核梭杆菌乳液疫苗相比，本发明的lipofm-cpg在增强抗原呈递和免疫刺激方面具有明显优势。这种疫苗能够激发更强大的细胞和体液免疫应答，针对细菌产生更有效的免疫反应。相比之下，传统疫苗往往在免疫刺激方面效果有限。

28、另外，lipofm-cpg引起的免疫应答具有长期预防细菌感染的能力。这意味着通过接种本发明的lipofm-cpg，人体可以建立持久的免疫保护，预防细菌感染的发生。这对于改善化疗的治疗效果以及减少细菌感染的结直肠癌的转移具有重要意义。

29、更为重要的是，本发明的lipofm-cpg能够选择性地杀灭肿瘤内的细菌，而不对肿瘤和肠道微生物群落造成显著干扰。肿瘤和肠道微生物群落在人类健康中扮演着关键角色，对于癌症的发展、进展和扩散具有重要影响。本发明的lipofm-cpg能够针对性地杀灭肿瘤内的细菌，同时保护和维持其他微生物群落的稳定。这种选择性的作用机制对于最大程度地减少对人体微生物群落的干扰至关重要。

30、此外，本发明的lipofm-cpg在常温下具有出色的稳定性，这得益于冻干保护剂的使用。这使得疫苗的存储和运输更加便捷，并且能够降低相关成本。通过提高疫苗的易用性和可靠性，有望推动疫苗的普及化，使更多的人能够受益于这项技术的发展。

31、综上所述，本发明的lipofm-cpg在免疫刺激、选择性杀菌作用以及稳定性方面具有显著优势。这项技术有望成为一种有前景的方法，用于消除特定细菌感染。同时，本发明可以借助最新的肿瘤微生物组筛查技术，将基于细菌膜的疫苗作为混合疫苗平台，针对不同类型的细菌进行应用。此外，这种平台还可以进一步扩展，整合癌细胞膜和细菌膜，实现抗菌和抗肿瘤的同时效果。

技术特征：

1.一种具核梭杆菌疫苗，其特征在于，所述具核梭杆菌疫苗包括具核梭杆菌细胞膜、稳定剂和佐剂；所述稳定剂与所述佐剂锚定在所述细菌细胞膜上。

2.根据权利要求1所述的具核梭杆菌疫苗，其特征在于，所述具核梭杆菌疫苗的粒径为50nm-300nm。

3.根据权利要求1所述的具核梭杆菌疫苗，其特征在于，所述佐剂选自chol-cpg、单脂质a磷酸酯、poly(i:c)、2'3'-cgamp、脂多糖、氢氧化铝、角鲨烯、r837、r848、霍乱毒素、大肠杆菌热不稳定毒素、gs9688、qs-21、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、锰离子和胞壁酰二肽中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的具核梭杆菌疫苗，其特征在于，所述稳定剂通过将磷脂溶于有机溶剂，然后真空蒸发形成；所述磷脂选自二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、胆固醇、磷脂酰胆碱pc、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酸、二油酰磷脂酰乙醇胺、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷和dlin-mc3-dma中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的具核梭杆菌疫苗，其特征在于，所述具核梭杆菌疫苗的应用方式为皮内注射、吸入或口服。

6.权利要求1-5任一项所述具核梭杆菌疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述具核梭杆菌细胞膜的浓度为5μg/ml-1000μg/ml；所述佐剂的添加量为5nmol-1000nmol。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述间歇式超声的功率为100w-1000w；所述间歇式超声的时间为5min-60min。

9.权利要求1-5任一项所述具核梭杆菌疫苗在制备预防和/或治疗肿瘤的产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括结肠癌，乳腺癌和胰腺癌中的一种或多种。

技术总结
本发明涉及一种具核梭杆菌疫苗及其制备方法与应用。本发明的具核梭杆菌疫苗包括具核梭杆菌细胞膜、稳定剂和佐剂；所述稳定剂与所述佐剂锚定在所述细菌细胞膜上。本发明的具核梭杆菌疫苗能够选择性而有效地消除细菌，成功克服细菌引起的化疗耐药性，提高化疗效果，并减少细菌感染的结直肠癌的转移。与全身或口服抗生素相比，本发明的具核梭杆菌疫苗对肿瘤内和肠道微生物群落的影响微乎其微。这是首次报告设计细菌疫苗以诱导针对肿瘤内具核梭杆菌的免疫应答，从而增强癌症治疗的潜力。本发明具核梭杆菌疫苗具有简单的制造工艺、强大的免疫原性和理想的生物相容性，可选择性地消除肿瘤内的细菌并改善细菌感染的癌症的治疗效果，是一种有前景的技术。

技术研发人员：陈倩,陈林甫
受保护的技术使用者：苏州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23