一种基于高能电子束诱变挖掘隐性代谢产物的方法
本发明涉及微生物代谢产物领域，具体涉及一种基于高能电子束诱变挖掘隐性代谢产物的方法。
背景技术：
1、天然产物一直被认为是治疗药物和新药的主要来源。1981年-2019年批准的1881种新药中，近一半是天然产物及其衍生物(j.nat.prod.2020,83,770-803)。其中，一半以上的抗菌药物和抗肿瘤药物是微生物来源的天然产物。在微生物体内负责天然产物生物合成的基因通常是成簇存在的。随着基因组测序技术的发展，研究发现在常规实验室条件下，高达80-90％的基因簇是沉默的或低表达的(natural product reports 2009,26(11),1362-1384)。因此，这些次级代谢基因簇代表了一个巨大的、尚未开发的新化学实体资源，有望提供新的候选药物来源。
2、该领域目前最大的挑战之一是开发唤醒这些沉默基因簇的通用方法，并表征其代谢产物的化学生物学特征。目前，常用的激活沉默基因簇的方法主要有靶向性激活和多效性激活，其中多效性激活方法，如共培养、高通量激活子筛选、核糖体工程等通过随机激活一个或多个通路而获得多组产物，但该方法存在天然产物重复发现的问题；而靶向性激活，如强启动子插入、异源表达等虽可以对选定的目标基因簇进行定向激活，但需要微生物遗传等操作，过程极为繁琐(nature communications 2021,12(1),3864.)。物理诱变，如紫外线(uv)、常压室温等离子体(artp)、60co-γ射线等是较常见的多效性激活方法，可以在短时间内获得优质的突变株。uv诱变操作简单，但突变效率低；artp诱变是一种新型诱变育种方法，但筛选工作量大；60co-γ射线诱变有辐射残留，危害健康。因此，一种更安全简便，激活效率更高的方法尚待开发。
技术实现思路
1、针对现有技术中对更安全简便，激活效率更高的方法的需求，本发明提供了一种基于高能电子束诱变挖掘隐性代谢产物的方法，具体技术方案如下：
2、第一方面，本发明提供了一种基于高能电子束诱变挖掘隐性代谢产物的方法，包括：对链霉菌菌株进行高能电子束辐照诱变，激活菌株基因组中的沉默基因簇，以使菌株发酵产生隐性代谢产物。
3、进一步地，所述链霉菌菌株为链霉菌zs181728；所述链霉菌zs181728的保藏分类命名为灰棕褐链霉菌(streptomyces griseobrunneus)zs181728，于2023年11月15日保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏分类号为cgmcc no.29023，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码为100101。
4、进一步地，所述链霉菌zs181728的隐性代谢产物结构如式ⅰ所示：
5、
6、其中：r表示一个h，或者一个甲基，或者与式ⅰ中所示的c9成环。
7、进一步地，所述链霉菌zs181728的隐性代谢产物包括化合物ⅱ、ⅲ、ⅳ中的一种或多种：
8、
9、
10、进一步地，所述链霉菌菌株为链霉菌(streptomyces lividans)1326。
11、进一步地，所述链霉菌(streptomyces lividans)1326的隐性代谢产物为放线紫红素和/或十一烷基灵菌红素。
12、进一步地，所述电子束诱变剂量为0.5kgy、1kgy、2kgy、3kgy、4kgy、5kgy、6kgy、7kgy或8kgy。
13、进一步地，所述电子束诱变剂量为6kgy。
14、进一步地，所述电子束能量为9～10mev；吸收剂量为3～4kgy/s。
15、进一步地，所述高能电子束的能量为10mev，电流为1.5ma；扫描频率为335hz；吸收剂量为4kgy/s。
16、进一步地，所述链霉菌(streptomyces lividans)1326为一种模式菌，所述链霉菌(streptomyces lividans)1326位于region1.12(5343601-5414417nt)区间的沉默基因簇以及region1.16(6226853-6272591nt)区间的沉默基因簇在高能电子束辐照诱变后被激活，诱变后的菌株可以产生放线紫红素以及十一烷基灵菌红素。
17、进一步地，所述链霉菌zs181728经过在高能电子束辐照诱变后，位于链霉菌zs181728基因组中region1.8(1321947-1382049nt)的沉默基因簇被激活。
18、本发明提供的基于高能电子束(hepe)对菌株进行诱变的方法，对模式菌链霉菌(streptomyces lividans)1326进行诱变，与现有技术中紫外(uv)诱变、常压室温等离子体(artp)诱变相比，不同剂量总体来看，阳性克隆数具有显著的提升，说明基于高能电子束的诱变方法相比另外两种方法具有更高的使菌株产生变异的效率。并且本发明中使用放线紫红素(actinorhodin，act)生物合成基因簇和十一烷基灵菌红素(undecylprodigiosin，red)生物合成基因簇这两种在验证菌株中通常不表达的基因簇，通过对使用不同方法进行诱变后的菌株中的这两种基因簇的表达情况进行检测，以此来检测不同诱变方法对于沉默基因簇的激活情况，相比于uv、artp进行诱变，使用hepe进行诱变所得到的菌株中沉默基因簇的激活率有着约8倍的提升，说明使用hepe对菌株中沉默基因簇激活效率更高。因此本发明使用的基于高能电子束(hepe)对菌株进行诱变的方法在诱变能力和诱变效率上都具有相比现有技术更好的效果。
19、在已经建立高能电子束诱变方法之后，本技术的发明人对链霉菌zs181728进行高能电子束诱变，得到了可以产生新的天然产物的菌株。经过对s.lividans 1326基因组序列进行分析确认act位于s.lividans 1326基因组上的region1.12(5343601-5414417nt)，red位于s.lividans 1326基因组上的region1.16(6226853-6272591nt)，将测序得到的zs181728基因组序列进行分析，确认该系列化合物的基因簇位于zs181728基因组上的region1.8(1321947-1382049nt)。
20、第二方面，本发明提供了一种链霉菌，所述链霉菌菌株为链霉菌zs181728；所述链霉菌zs181728的保藏分类命名为灰棕褐链霉菌(streptomyces griseobrunneus)zs181728，保藏号为cgmcc no.29023，保藏日期为2023年11月15日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
21、第三方面，本发明提供了一种隐性代谢产物，所述隐性代谢产物结构如下式所示：
22、
23、其中：r表示一个h,或者一个甲基，或者与c9成环。
24、进一步地，所述隐性代谢产物包括化合物ⅱ、ⅲ、ⅳ中的一种或多种：
25、
26、进一步地，所述隐性代谢产物为上述链霉菌zs181728经过高能电子束诱变后的链霉菌菌株发酵产生。
27、进一步地，所述化合物ⅱ、ⅲ、ⅳ具有抑制黑色素生成的功能。
28、本技术通过使用高能电子束对s.lividans 1326进行诱变，得到的诱变后的菌株的发酵产物为化合物ⅱ、ⅲ、ⅳ，将其命名为griseobrucin a、griseobrucin b、griseobrucin c，griseobrucin a～c与melanostatin(a new screening method formelanin biosynthesis inhibitors using streptomyces bikiniensis,the journal ofantibiotics,1990volume 43issue 12pages1601-1605；synthesis,stereochemistry,andbiological properties of the depigmenting agents,melanostatin,feldamycin andanalogs，the journal of antibiotics,1991volume 44issue 1pages76-85)具有相同的平面结构，说明griseobrucin a～c同样具有抑制黑色素生成的活性功能。
29、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
30、(1)本发明提供了一种基于高能电子束诱变的高效激活微生物沉默基因簇以产生隐性代谢产物的方法，其诱变能力和诱变效率都与现有技术相比具有显著的提升。
31、(2)本发明通过基于高能电子束的诱变方法得到了一类新的隐性代谢产物。
技术特征：
1.一种基于高能电子束诱变挖掘隐性代谢产物的方法，其特征在于：包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述链霉菌菌株为链霉菌zs181728；所述链霉菌zs181728的保藏分类命名为灰棕褐链霉菌(streptomyces griseobrunneus)zs181728，保藏号为cgmcc no.29023，保藏日期为2023年11月15日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述链霉菌zs181728的隐性代谢产物结构如式ⅰ所示：
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述链霉菌zs181728的隐性代谢产物包括化合物ⅱ、ⅲ、ⅳ中的一种或多种：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述链霉菌菌株为链霉菌(streptomyceslividans)1326。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述链霉菌(streptomyces lividans)1326的隐性代谢产物为放线紫红素和/或十一烷基灵菌红素。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述电子束诱变剂量为0.5kgy、1kgy、2kgy、3kgy、4kgy、5kgy、6kgy、7kgy或8kgy。
8.一种链霉菌，其特征在于：所述链霉菌菌株为链霉菌zs181728；所述链霉菌zs181728的保藏分类命名为灰棕褐链霉菌(streptomyces griseobrunneus)zs181728，保藏号为cgmcc no.29023，保藏日期为2023年11月15日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
9.一种隐性代谢产物，其特征在于：所述隐性代谢产物包括化合物ⅱ、ⅲ、ⅳ中的一种或多种：
10.如权利要求9所述的隐性代谢产物在抑制黑色素生成中的应用。
技术总结
本发明涉及微生物代谢产物领域，具体涉及一种基于高能电子束诱变挖掘隐性代谢产物的方法，所述方法为对菌株进行电子束辐照，以激活菌株基因组中的沉默基因簇。本发明基于高能电子束诱变，高效激活微生物沉默基因簇以产生隐性代谢产物，其诱变能力和诱变效率都与现有技术相比具有显著的提升，并且基于此诱变方法得到了一类新的天然产物。
技术研发人员：徐飞,冯新媛,张艺菲
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23