甘蔗黄锈病抗性基因ScWAKL2及其抗病育种应用
本发明专利属于甘蔗基因工程领域，具体涉及甘蔗黄锈病抗性基因scwakl2及其抗病育种应用。
背景技术：
1、甘蔗黄锈病是由屈恩柄锈菌(pucciniakuehniibutler)引起的一种世界性真菌病害，主要危害甘蔗叶片、芽等部位，随着病斑的扩张，病斑着生处的叶背面，生出黄色须状物，并产生大量的夏孢子。由于自然气候的影响以及甘蔗生产方式的转变，近期蔗区黄锈病的发病率呈现上升趋势。甘蔗黄锈病的发生近年来在澳大利亚、美国、巴西、危地马拉、墨西哥等国家均有报道。黄锈病的最早记录于澳大利亚的甘蔗主要栽培品种q124，据报道，仅在2000年一季就有超过2亿澳元的损失，这是澳大利亚糖业历史上甘蔗病害单季损失最大的一次。自2007年在美国首次发现黄锈病以来，它已成为甘蔗产业的新威胁，严重时导致感病品种的产量降低50％。我国在2014年首次于云南蔗区发现甘蔗黄锈病，表明我国甘蔗生产面临甘蔗黄锈病突发流行的风险。
2、sood等发明了叶轮接种法鉴定甘蔗品种对黄锈病的抗性，用移液管将0.5ml夏孢子悬浮液(夏孢子最适接种浓度为104个/ml)接种4月龄甘蔗叶片，可在短时间内对甘蔗品种进行抗性鉴定(soodetal.,2009)。zhao等采用叶轮接种法对甘蔗盆栽植株接种黄锈病菌，采用0-4的等级进行病害分级，当病害等级≥2时，叶片的叶绿素相对含量、固碳效率、气孔导度、叶片蒸腾速率和净光合速率显著降低(zhao etal.,2011)。cardenas等从2个感病甘蔗品种cl85-1040和cp89-2143的分离菌株(1040和2143)组装基因组，其大小分别为73.9mb和113.0mb，重复序列分别为5.9％和17.4％，转座子的数量分别为11,698和21,143，共预测出2,660个和1,423个分泌蛋白，分别占所有蛋白编码基因的10.7％和8.3％，这2种黄锈病菌基因组将对未来的基因组研究具有巨大的价值，特别是进一步探索预测的分泌蛋白，可能是确定病原体关键致病性的决定因素(cardenasetal.,2021)。
3、由于甘蔗是一类遗传背景复杂且基因组庞大的多倍体植物，而甘蔗黄锈病的爆发、流行与品种自身的抗病能力密切相关，选育和种植抗黄锈病品种是解决当前黄锈病病害最为经济的有效方式之一。目前，对于甘蔗抗黄锈病基因的挖掘尚在起步阶段。由yang等通过cp95-1039(高抗黄锈病)×cp88-1762(高感黄锈病)杂交，利用杂交的拟“f2”分离群体，鉴定到1个对表型贡献率为58％的qtl位点(qorr109)。单标记分析表明，g1标记与抗黄锈病性显著相关，进而开发了抗黄锈病基因的分子诊断标记g1(yang et al.,2018)。利用pcr技术对甘蔗野生种与近缘属材料进行g1标记检测，研究结果表明，g1标记所在的基因是编码一种细胞壁类受体激酶wak/wakl，并用甘蔗栽培品种r570的单倍体蛋白组数据库进行鉴定，鉴定到了3个相似度较高的蛋白序列，这些蛋白都有wak/wakl的跨膜结构域、胞外结构域和激酶结构域(王恒波等.,2021)。甘蔗黄锈病抗病品种cp96-1252是美国佛罗里达州近10年来主要的甘蔗栽培品种，约占该州甘蔗总种植面积的30％(boukari etal.,2020)，相反的是，cp88-1762是一个感黄锈病的甘蔗品种。本研究通过三代全称转录本数据库，根据抗黄锈病g1标记所在的unigene序列，从抗、感黄锈病甘蔗栽培品种cp96-1252和cp88-1762克隆抗黄锈病的候选基因scwakl2，构建过表达载体遗传转化烟草，获得纯化株系后接种致病菌验证其抗病性。
技术实现思路
1、本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点和难点，提出一个甘蔗黄锈病抗性基因scwakl2及其抗病育种应用，该scwakl2基因可用于选育抗黄锈病甘蔗新品种中，提高育种效率和杂交育种亲本选配，对于培育抗黄锈病甘蔗新品种具有重要应用潜力和价值。
2、本发明的目的通过以下技术方案实现：
3、甘蔗黄锈病抗性基因scwakl2，所述甘蔗黄锈病抗性基因scwakl2的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述甘蔗黄锈病抗性基因scwakl2编码的蛋白的氨基酸序列如seq idno.2所示。
4、含有上述甘蔗黄锈病抗性基因scwakl2的重组表达载体，所述重组表达载体是将甘蔗黄锈病抗性基因scwakl2连入pearleygate 203载体制得。
5、上述甘蔗黄锈病抗性基因scwakl2在增强植物抗病性中的应用，所述增强植物抗病性指的是增强烟草对青枯菌和茄病镰刀菌蓝色变种的抗性。
6、上述甘蔗黄锈病抗性基因scwakl2在植物抗病性育种中的应用，所述植物包括甘蔗、烟草。
7、上述甘蔗黄锈病抗性基因scwakl2的分子标记，其为seq id no.1所示核苷酸序列第1149bp位置起插入8个碱基cccacagt。
8、上述分子标记在辅助鉴定甘蔗黄锈病抗性中的应用。
9、上述分子标记的检测方法，提取待测样品基因组dna作为模板，用所述分子标记的检测引物进行pcr扩增，将pcr扩增产物用faq i(bsmfi)限制性内切酶酶切，电泳检测酶切后的扩增产物，根据电泳结果判定分子标记的多态性及基因型；
10、其中，所述检测引物序列如下：
11、scwakl2-exon-f：5’-tacgaggcaataataaaaaga-3’，
12、scwakl2-exon-r：5’-ggagaggacatacctacacag-3’。
13、本发明利用rt-pcr技术，分别从抗、感黄锈病甘蔗栽培品种cp96-1252和cp88-1762克隆抗黄锈病标记的候选scwakl2基因，两者间存在8个碱基(cccacagt)插入序列的差异，进一步以甘蔗栽培品种的三个原始野生种(热带种la-purple和割手密种ses208、np-x)为模板，克隆scwakl2基因，并通过测序验证单倍型的起源。利用gateway方法构建重组过表达载体pearleygate 203-scwakl2，再利用农杆菌gv3101介导的花序蘸染法，将过表达载体转化到烟草植株，经抗除草剂bar基因和目的基因检测后，获得转基因株系，并经过连续3次自交，获得纯合转基因株系。对纯合转基因烟草植株分别接种致病菌(烟草青枯菌和茄病镰刀菌蓝色变种)，再结合植株的表型、dab染色及免疫相关基因的表达模式验证其抗病性。针对差异序列开发多态性分子标记，结合限制性内切酶，对70个代表性的甘蔗栽培品种进行检测，以便对不同育种单位培育的甘蔗品种黄锈病抗性进行鉴定。
14、与现有技术相比，本发明具有以下有益结果：
15、1)本发明是依据图位克隆方法开发的紧密连锁标记，分别从抗、感黄锈病甘蔗品种中，克隆获得scwakl2基因，经序列比对后，推测该基因功能发生变化。通过构建过表达载体后，将其遗传转化到烟草植株。结果证明，与野生型相比，过表达scwakl2转基因烟草植株抗病性显著增加，进一步佐证本研究对抗黄锈病甘蔗品种scwakl2基因的抗性机制。
16、2)本发明通过对过表达植株接种不同病原菌，结合植株的表型、过氧化氢含量及免疫相关基因的表达模式，充分的阐述该基因的抗性功能。并通过检测甘蔗属不同原始种，进一步阐述该抗性基因的起源，针对差异序列开放出共线性标记，这为将来选育抗黄锈病甘蔗种质和新品种奠定重要的研究基础。
17、3)本发明结果表明，现代甘蔗栽培品种的遗传背景中，感黄锈病甘蔗栽培品种中scwakl2由于发生插入序列，导致丧失抗病性。因此，可用基因工程技术(基因编辑)，改造该基因序列，从而获得生产性能优异的抗黄锈病甘蔗新品种。
技术特征：
1.甘蔗黄锈病抗性基因scwakl2，其特征在于：所述甘蔗黄锈病抗性基因scwakl2的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.根据权利要求1所述的甘蔗黄锈病抗性基因scwakl2，其特征在于：所述甘蔗黄锈病抗性基因scwakl2编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
3.含有权利要求1~2任一项所述的甘蔗黄锈病抗性基因scwakl2的重组表达载体。
4.权利要求1~2任一项所述的甘蔗黄锈病抗性基因scwakl2在增强植物抗病性中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述增强植物抗性指的是增强烟草对青枯菌和茄病镰刀菌蓝色变种的抗性。
6.权利要求1~2任一项所述的甘蔗黄锈病抗性基因scwakl2在植物抗病性育种中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述植物包括甘蔗、烟草。
8.权利要求1~2任一项所述的甘蔗黄锈病抗性基因scwakl2的分子标记，其特征在于：其为seq id no.1所示核苷酸序列第1149 bp位置起插入8个核苷酸序列cccacagt。
9.权利要求8所述的分子标记在辅助鉴定甘蔗黄锈病抗性中的应用。
10.权利要求8所述的分子标记的检测方法，其特征在于：提取待测样品基因组dna作为模板，用所述分子标记的检测引物进行pcr扩增，将pcr扩增产物用faq i (bsmf i)限制性内切酶酶切，电泳检测酶切后的扩增产物，根据电泳结果判定分子标记的多态性及基因型；
技术总结
本发明专利属于甘蔗基因工程领域，具体涉及甘蔗黄锈病抗性基因ScWAKL2及其抗病育种应用。本发明通过从抗、感黄锈病甘蔗品种中分别克隆ScWAKL2基因，找到功能差异的原因，通过异源过表达的方法验证该基因的抗病分子功能，针对ScWAKL2基因在抗、感病甘蔗等位基因型中的差异，开发分子标记，利用该标记对现有甘蔗品种及育种亲本材料进行抗性鉴定，为后续利用分子标记辅助育种选育抗黄锈病甘蔗新品种奠定重要的研究基础。
技术研发人员：王恒波,覃丽谦,阙友雄,刘俊鸿,杨世韦,赵平
受保护的技术使用者：福建农林大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23