一种灵芝三萜提取物的提取方法及灵芝三萜提取物的应用与流程

本技术涉及食药用真菌的加工，更具体地说，它涉及一种灵芝三萜提取物的提取方法及灵芝三萜提取物的应用。

背景技术：

1、灵芝是一种担子菌纲、多孔菌科、灵芝属的真菌，是我国著名的高等药用真菌，具有补中益气、扶正固本、延年益寿等功效，灵芝的关键药效成分是灵芝多糖和灵芝三萜，其中灵芝三萜具有消炎止痛、镇静、解毒、保肝、抗病毒、抗肿瘤等功能。

2、由于灵芝子实体由纤维素、半纤维素和木质素等主要成分构成，结构紧密，活性多糖有效成分附着在细胞壁内侧，传统的热水浸提法时间长、耗能高，活性成分提取物得率低。

3、目前灵芝三萜的提取方法主要有：有机溶剂法、超声波提取法和超临界二氧化碳萃取法，传统的萃取方法主要是使用有机溶剂从灵芝子实体中萃取三萜，该方法消耗的有机溶剂多、耗时长，而超临界二氧化碳萃取法存在提取效率低、提取的灵芝三萜活性较低的问题，而活性较低的灵芝三萜在体内的吸收率可能会受到影响，而且活性偏低的灵芝三萜难以与体内的靶点结合，从而发挥其生物学效应，导致其在体内的生物利用度降低。

技术实现思路

1、为了提高灵芝三萜的提取率和活性，改善其在体内的吸收率，本技术提供一种灵芝三萜提取物的提取方法及灵芝三萜提取物的应用。

2、第一方面，本技术提供一种灵芝三萜提取物的提取方法，采用如下的技术方案：

3、一种灵芝三萜提取物的提取方法，包括以下步骤：

4、双向发酵：①取在斜面培养基中活化后的灵芝菌丝体，加入到液体培养基中，在28-30℃培养5-7d，获得第一菌液；②将菌液接种到液体培养基中，在28-30℃培养5-7d，获得第二菌液；③将第二菌液与灵芝子实体粉末按照100:12-15的固液比混合，在28-30℃下培养8-10天，在40-45℃下干燥至恒重，制得灵芝粉；

5、超临界萃取：将灵芝粉在20-25mpa、30-32℃下超临界提取40-60min，二氧化碳流速为55-60ml/min，依次经过微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜，获得萃取液，浓缩、干燥，制得灵芝三萜提取物。

6、通过采用上述技术方案，将灵芝菌丝体培养获得第一菌液和第二菌液，能改善灵芝菌的生长代谢，增加灵芝酸和灵芝多糖的积累和合成，随着发酵的进行，菌丝长满灵芝子实体，双向发酵是运用灵芝菌丝体作为发酵菌种，接种于灵芝子实体粉上进行发酵，发酵过程中，药食兼用真菌生长过程中分泌的果胶酶、纤维素酶、几丁质酶等进入药性基质，破坏其细胞壁、细胞膜结构，引起中药材细胞破裂，可以利用、分解和转化灵芝子实体粉末中的物质，并将部分物质转化为其他有效成分，从而将灵芝子实体粉末中大分子物质酶解成为更小、更容易浸出的小分子物质，因为小分子物质更容易与人体细胞蛋白结合，所以更容易被人体消化、吸收，在人体中吸收较快、较完全，而且灵芝子实体粉末中有些成分也可以刺激灵芝菌丝生长和某些活性物质的产生，从而生产出具有多种活性成分且功效更好的发酵物质，在发酵时控制适宜的温度和时间，能不影响灵芝菌丝体生长，同时刺激合成更多的灵芝酸，从而促进灵芝三萜和灵芝多糖产量的积累，提高灵芝三萜和灵芝多糖的提取率；然后再利用超临界提取时，合理控制提取压力、温度、时间和流速，在增加对灵芝三萜和灵芝多糖溶解能力的同时，减少物质间的传质距离，增加传质速率和浓度差，有利于物质的萃取，但同时也降低了超临界提取时参数对萃取所得灵芝三萜提取物活性的影响，在增加灵芝三萜提取物提取率的同时，保护灵芝三萜提取物的活性，从而提高其在人体内的吸收率，而且将萃取所得物依次经过微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜后，再进行浓缩和干燥，采用多级膜分离技术，实现灵芝三萜类提取物的精细分离与纯化，使沉淀更少，澄清度更好，稳定性更好，使制成的灵芝三萜提取物在使用时更加纯净，若添加到精油中，较为澄清透明，不影响下游产品的品质。

7、可选的，所述微滤膜直径为0.1-1μm，超滤膜直径为0.05-0.5μm，纳滤膜直径为0.0005-0.005μm，反渗透膜直径为0.0001-0.001μm

8、微滤膜可有效去除提取液中的悬浮物、细菌、不分病毒及大尺度的胶体等物质，超滤膜能使小分子溶质和溶剂穿过，在分子水平上对成分进行纯化，去除提取液中的色素、鞣质、粘液质等大分子杂质，纳滤膜用于提取液中活性成分的浓缩和纯化，能截留透过超滤膜的小分子量的活性物质，又能透析反渗透膜所截留的部分无机盐，可脱盐，去除矿物质，反渗透膜能去除盐、金属离子、矿物质，使所得灵芝三萜萃取液更加澄清、纯度更好。

9、可选的，所述灵芝子实体粉末包括质量比为1:0.3-0.7:0.5-1赤芝子实体原粉、黄芪粉末和黑灵芝子实体原粉。

10、通过采用上述技术方案，赤芝能镇静、抑制组胺释放，对于心神不安、失眠等症状有一定的功效，还能改善皮肤状况，使衰老细胞变得有活力，黄芪含有多糖、氨基酸、叶酸等多种微量元素，具有增强机体免疫功能、修复受损细胞、提高细胞活性、抗衰老的作用，黑灵芝用于治疗心神不能、失眠、惊悸等，三种不同原料作为发酵基质，获得的灵芝三萜提取物含量高，而且能达到改善皮肤屏障，提高机体免疫功能，增强肌肤抵抗力，滋养并促进肌肤能量再生，提升细胞能力，加速肌肤焕新，促进细胞内dna的合成，滋润养颜，增加肌肤弹性的效果。

11、可选的，所述灵芝子实体粉末的制法如下：将赤芝子实体原粉、黄芪粉末和黑灵芝子实体原粉混合，制得灵芝子实体原粉；

12、将第二菌液按照3-5％的接种量与灵芝子实体原粉混合，在28-30℃、溶氧为20-25％的下发酵3-5d，烘干，制得子实体发酵粉；

13、将子实体发酵粉、离子液体和去离子水按照1:5-6:500-600的固液比混合，装入密封袋中，升压至300-350mpa，保压8-10min，卸压，得混合溶液，浓缩、干燥，制得灵芝子实体粉末。

14、通过采用上述技术方案，灵芝子实体结构紧密，为缩短培养时间，先将灵芝子实体粉末用第二菌液预处理，第二菌液以黑灵芝子实体原粉、黄芪粉末和赤芝子实体原粉作为发酵基质，黄芪的加入能促进灵芝多糖和灵芝三萜的合成和积累，从而提高灵芝三萜和灵芝多糖的提取，而且在发酵时控制发酵时的溶氧条件，第二发酵液中灵芝菌作为一种好样真菌在缺氧的情况下会使其生长代谢受到影响，导致其生长受限，所以溶氧在20-25％的条件下，能提高灵芝多糖的积累量，然后用离子液体进行超高压处理，离子液体是一种绿色友好型溶剂，其由阳离子和阴离子组成，具有蒸气压低、熔点低、化学稳定性好等优点，其具有很高的溶解纤维素的能力，对破坏厚重、坚硬的灵芝子实体细胞壁具有明显的优势，同时能提高灵芝子实体中生物活性的稳定性和溢出速率；在利用离子液体的同时，进行超高压提取，在短时间内提升压力，使得灵芝子实体细胞内外的压力大较大，导致细胞短时间内迅速破裂，从而使提取剂更容易进入细胞内部，进入溶解，在卸压时，灵芝子实体细胞内外又产生巨大的压力差，灵芝孢子粉内的有效成分随无水乙醇带出细胞外，扩散到溶液中，使得细胞内溶解的有效物质迅速溢出，实现提取过程，破壁效率高、用时短、工艺简单，而且使活性成分不易失活，有效成分的提取率增加。

15、可选的，离子液体为1-氨丙基-3-甲基咪唑溴。

16、通过采用上述技术方案，氨基的存在能保护灵芝三萜，避免其被氧气氧化，提高提取率。

17、可选的，所述步骤①中，在发酵第2天时，加入酸枣仁油，加入量为液体培养基的2-3％；所述步骤②中，在发酵第2天时，加入亚硒酸钠，加入浓度为(4-5)×10-4g/l。

18、通过采用上述技术方案，在灵芝菌丝体培养的过程中，通过添加外源物质酸枣仁油，能促进灵芝菌丝体生长和灵芝三萜的生物合成，从而提高灵芝三萜的提取率，而且酸枣仁油能抑制神经递质分泌，有助于减轻神经系统得过渡兴奋和压力，从而凝心安神、延缓衰老；在二次培养时添加亚硒酸钠，从而在生物发酵时，在灵芝三萜中富集硒，改善灵芝三萜的应用效果，而且硒能激动响应的酶系统而发挥作用，诱导产生灵芝三萜，但其浓度过高，易产生类似重金属离子的特性，与膜蛋白结合抑制有关酶的活性，另外硒具有很强的抗氧化作用，能帮助防止器官老化与病变，延缓衰老，增加免疫力并抵御疾病，而且还能促进糖代谢，降低体内糖化反应的发生，从而避免胶原蛋白流失，皮肤暗黄而失去弹性，因此在灵芝菌丝体培养时，分步加入酸枣仁油和亚硒酸钠，能进一步改善灵芝三萜的提取效率，并改善灵芝三萜的应用效果，达到抗衰老的作用。

19、第二方面，本技术提供一种灵芝三萜类提取物的应用，采用如下的技术方案：

20、一种灵芝三萜类提取物的应用，用于抗皱精华液。

21、通过采用上述技术方案，灵芝三萜提取物具有抗氧化作用，可以清除体内的自由基，减少氧化应力反应对细胞的损伤，而且还能产生抗炎作用，减轻炎症对组织的损伤，调节免疫系统功能，增强机体的免疫力，改善皮肤中胶原蛋白和弹性蛋白的活力，从而延缓细胞衰老，增加肌肤弹性和润滑度，使肌肤更加年轻化。

22、可选的，所述抗皱精华液包括以下重量百分比的原料：灵芝三萜提取物15-25％、海参肽6-10％、沟鹿角菜提取物10-15％、视黄醇棕榈酸酯3-7％、代赭石粉5-10％、磷脂3-6％、一缩二丙二醇8-10％、甘油10-20％、1,2-己二醇0.2-1％和对羟基苯乙酮0.2-0.8％，余量为水。

23、通过采用上述技术方案，以灵芝三萜提取物、海参肽、沟鹿角菜提取物等制备抗皱精华液，海参肽能通过提高过氧化氢酶活力减少细胞的氧化损伤，清除自由基，促进成纤细胞增殖等保护皮肤，而且与灵芝三萜提取物在提高皮肤中过氧化物酶活力方面存在协同增效作用，二者联合应用在抗皱精华液中，能提高抗皱精华液的抗皮肤衰老功效。

24、沟鹿角菜提取物是可持续的天然海洋成分，富含高含量的褐藻糖胶，从而多维度丰盈肌肤，增加皮肤光泽，增加胶原蛋白iii的合成，上调糖胺聚糖，抑制多种基质金属蛋白酶mmp的活性，减少黑色素含量，紧致皮肤和增加皮肤防御力，减少皱纹的产生，特别是能巩固眼部纹理组织，就是眼部肌肤的新陈代谢，保持眼部肌肤光彩细致；视黄醇棕榈酸酯非常容易被皮肤吸收，能刺激基质蛋白合成，淡化细纹、美白，促进胶原蛋白的生成并调节细胞再生速度等作用，重塑皮肤细胞，修复肌肤并恢复肌肤活力。

25、代赭石粉用于肌肤能舒缓肌肤、减少毛孔、调节皮肤油脂分泌，而且还具有安神、镇静的功效，当提取灵芝三萜提取物使使用酸枣仁油，能与酸枣仁油配合产生抑制神经递质分泌的效果，从而减缓神经系统得过度兴奋和压力，改善睡眠质量、缓解焦虑，从而达到抗衰作用。

26、通过灵芝三萜提取物和海参肽的抗氧化作用，与沟鹿角菜提取物和视黄醇棕榈酸酯的刺激基质蛋白合成作用，以及代赭石和酸枣仁油的抑制神经递质分泌作用，三种不同皮肤抗衰作用机制配合，实现复合抗衰效果，从而改善抗衰作用，使肌肤更加年轻化。

27、而且使用磷脂改善灵芝三萜提取物等不溶于水的原料作用于肌肤时的渗透效率，促进头皮吸收，增加抗皱精华液的作用力，改善产品抗衰效果。

28、可选的，所述抗皱精华液的制法如下：

29、将磷脂、十聚甘油单月桂酸酯和一缩二丙二醇混合，升温至70-75℃，加入灵芝三萜提取物、视黄醇棕榈酸酯，混合均匀，作为油相；

30、将甘油和水、对羟基苯乙酮、沟鹿角菜提取物、海参肽、代赭石粉和1，2-己二醇混合，升温至70-75℃，混合均匀，作为水相；

31、将水相和油相混合，搅拌均匀，均质，冷却至室温，出料，制得抗皱精华液。

32、通过采用上述技术方案，将水相和油相经均质后，冷却出料，

33、可选的，所述均质压力为700-800bar，均质次数为4-7次。

34、通过采用上述技术方案，高压均质能使均质温度升高，乳液剧烈运动，相互碰撞，降低精华液的粒径，粒径精华液在皮肤上形成更加致密的薄膜，减少皮肤表面水分的蒸发，促进活性成分的经皮吸收。

35、可选的，所述抗皱精华液中还添加了重量百分比为3-6％的十聚甘油单月桂酸酯。

36、通过采用上述技术方案，非离子表面活性剂因在水溶液中不会发生电离，对酸、碱、盐等具有较好的稳定性，所以使用与甘油具有较好亲和性的十聚甘油单月桂酸酯与磷脂配合作为乳化剂，能增加磷脂对灵芝三萜等不溶于水的有效成分的包封作用，增加包封浓度，应用到皮肤表面后，能在皮肤表面形成致密的薄膜，减少皮肤水分蒸发，使角质细胞堆积减少及细胞间的间隙增大，角质层结构疏松，有利于灵芝三萜提取物等有效成分的透皮吸收，因此能进一步改善灵芝三萜提取物等成分的渗透效率，缩短抗皱显效期，抗衰老效果更加显著。

37、可选的，所述代赭石粉经以下预处理：将代赭石粉与蜂王浆酶解物混合、均质，代赭石粉和蜂王浆酶解物的质量比为1:1-2。

38、通过采用上述技术方案，经过酶解的蜂王浆，结合水的能力显著提升，从而具有良好的吸湿、保湿性，而且其润滑效果好，能改善代赭石粉的亲肤效果，提高抗皱精华液的补水、保湿和抗皱效果。

39、综上所述，本技术具有以下有益效果：

40、1、由于本技术采用双向发酵和超临界提取配合的方法，双向发酵进行初步提取，降低了灵芝三萜和灵芝多糖的损失，然后用绿色高效的超临界萃取进一步萃取，两种方法的有效结合，增加了灵芝三萜和灵芝多糖的提取效率，同时保护了提取物的活性，使灵芝三萜提取物的酶解率更高、更易吸收。

41、2、本技术中优选采用酸枣仁油和亚硒酸钠在灵芝菌丝体发酵时作为外源物质，不仅促进了灵芝三萜和灵芝多糖的合成，增加了灵芝三萜和灵芝多糖的提取效率，还使灵芝三萜提取物具有更加优异的抗衰老、增加皮肤弹性的效果。

42、3、本技术中优选采用灵芝三萜提取物、海参肽、沟鹿角菜提取物、代赭石粉等原料制备抗皱精华液，通过抗氧化、刺激基质蛋白合成和抑制神经递质分泌三种不同作用配合，改善抗皱精华液的抗衰老作用。

技术特征：

1.一种灵芝三萜提取物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的灵芝三萜提取物的提取方法，其特征在于：所述灵芝子实体粉末包括质量比为1:0.3-0.7:0.5-1赤芝子实体原粉、黄芪粉末和黑灵芝子实体原粉。

3.根据权利要求2所述的灵芝三萜提取物的提取方法，其特征在于：所述灵芝子实体粉末的制法如下：将赤芝子实体原粉、黄芪粉末和黑灵芝子实体原粉混合，制得灵芝子实体原粉；

4.根据权利要求1所述的灵芝三萜提取物的提取方法，其特征在于：所述步骤①中，在发酵第2天时，加入酸枣仁油，加入量为液体培养基的2-3%；所述步骤②中，在发酵第2天时，加入亚硒酸钠，加入浓度为（4-5）×10-4g/l。

5.权利要求1-4任一项所述提取方法制成的灵芝三萜类提取物的应用，其特征在于，用于抗皱精华液。

6.根据权利要求5所述的灵芝三萜提取物的应用，其特征在于：所述抗皱精华液包括以下重量百分比的原料：灵芝三萜提取物15-25%、海参肽6-10%、沟鹿角菜提取物10-15%、视黄醇棕榈酸酯3-7%、代赭石粉5-10%、磷脂3-6%、一缩二丙二醇8-10%、甘油10-20%、1,2-己二醇0.2-1%和对羟基苯乙酮0.2-0.8%，余量为水。

7.根据权利要求6所述的灵芝三萜提取物的应用，其特征在于：所述抗皱精华液的制法如下：

8.根据权利要求7所述的灵芝三萜提取物的应用，其特征在于：所述均质压力为700-800bar，均质次数为4-7次。

9.根据权利要求6所述的灵芝三萜提取物的应用，其特征在于：所述抗皱精华液中还添加了重量百分比为3-6%的十聚甘油单月桂酸酯。

10.根据权利要求6所述的灵芝三萜提取物的应用，其特征在于：所述代赭石粉经以下预处理：将代赭石粉与蜂王浆酶解物混合、均质，代赭石粉和蜂王浆酶解物的质量比为1:1-2。

技术总结
本申请涉及食药用真菌加工领域，具体公开了一种灵芝三萜提取物的提取方法及灵芝三萜提取物的应用。一种灵芝三萜提取物的提取方法，包括以下步骤：双向发酵：①取在斜面培养基中活化后的灵芝菌丝体，加入到液体培养基中，培养，获得第一菌液；②将菌液接种到液体培养基中，在培养，获得第二菌液；③将第二菌液与灵芝子实体粉末混合，培养8‑10天，干燥至恒重，制得灵芝粉；超临界萃取：将灵芝粉超临界提取40‑60min，依次经过微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜，获得萃取液，浓缩、干燥，制得灵芝三萜提取物。本申请的灵芝三萜提取物·可用于抗皱精华液，本申请的方法具有灵芝三萜提取率高，且活性高，易吸收的优点。

技术研发人员：张群
受保护的技术使用者：上海娜蔻生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23