一种兔轮状病毒基因分型的多重RT-PCR检测的引物及检测方法

本发明涉及一种兔轮状病毒基因分型的多重rt-pcr检测的引物及检测方法，属于生物。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的一些理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、兔轮状病毒病(lapine rotavirus disease)是由呼肠孤病毒科轮状病毒属兔轮状病毒(lapine rotavirus,lrv)引起的一种兔的急性肠道传染病，给家兔饲养行业造成较大的经济损失，同时也危及公共卫生安全。目前发现的兔轮状病毒均属于a群血清3型。lrv的基因组为一条单股正链的rna分子，大小约6.4-7.3kb，基因组包含3个开放阅读框和多聚腺苷酸(polya)尾。其中vp4蛋白是位于外层衣壳的突刺状结构，决定病毒的p型，并经酶切反应增强病毒对宿主细胞的感染性。vp4含有中和抗原表位，诱导机体产生保护性抗体，是鉴定病毒血清型和研制rv疫苗的基础。vp7位于病毒衣壳的最外层，具有膜结合能力，在维持外壳蛋白的稳定和促进病毒的成熟过程中发挥重要作用，根据vp7可分为不同的g型。

3、目前已发现了兔轮状病毒优势基因型有g3p[22]型、g3p[41]型。lrv的常用检测方法有病毒分离、酶联免疫吸附法(elisa)、电镜观察法、rt-pcr法等。其中rt-pcr该技术检测成本低、效率高，可真正实现快速核酸检测。且多重rt-pcr检测方法可以有效的节约稀少样本，同时节省试剂，因此建立兔轮状病毒多重rt-pcr基因分型检测方法很有必要。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的技术目的之一在于提供一种用于检测lrv的特异性引物。本发明的技术目的之二在于提供一种利用rt-pcr扩增lrv基因分型的方法，该方法具有简便、快速、敏感性高、特异性好的优势，完全能够满足快速检测lrv基因分型的需要。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、在本发明的第一个方面，提供一种兔轮状病毒基因分型的多重rt-pcr检测的引物，所述引物包含以下3对特异性引物对，其核苷酸序列分别如seq id no.1～6所示；具体如下所示：

4、g3上游引物f：5’-tccactaaacacgcaaac-3’(seq id no.1)；

5、g3下游引物r：5’-cgacaacatcagttattacc-3’(seq id no.2)；

6、p[22]上游引物f：5’-gactcacaagcattcaga-3’(seq id no.3)；

7、p[22]上游引物r：5’-aacatatccaacggcaata-3’(seq id no.4)；

8、p[41]上游引物f：5’-gcagcgtcatcaatatct-3’(seq id no.5)；

9、p[41]上游引物r：5’-cacttcatcattatctacaactc-3’(seq id no.6)。

10、在本发明中，g3引物对应的特异性扩增片段位于lrv vp7基因的第636-739位点之间，大小为104bp；p[22]引物对应的特异性扩增片段位于lrv vp4基因的第1087-1598位点之间，大小为333bp；p[41]引物对应的特异性扩增片段位于lrvvp4基因的第1685-2017位点之间，大小为512bp。

11、g3特异性扩增片段的序列结构具体为：

12、5’-tccactaaacacgcaaactctaggaattggttgcttgaccaccgacacaacgacattcgaagaagttgcaacagctgagaaattggtaataactgatgttgtcg-3’，如seq id no.7所示。

13、p[22]特异性扩增片段的序列结构具体为：

14、5’-gactcacaagcattcagaaacatggtgtatgtgagatcgttagcggctgatctaaactctgttatttgcagtggtggtagctatagtttcgcattacctgtaggaaatttcccagtaatgtctggaggtgctgtatcattacattcttctggagtaacactatcaacgcaatttacagattatgtatctcttaattcgttaagatttagattcagattagtagtcgaggaacctccattctcgataacgcgcacgcgagtgagtgggttgtacgggttgccagccgtgaatccgaacaattctagagaattttacgaaataatgggaagattttctttaatatcattagtaccttcgaatgatgattatcaaacaccaataatgaattcagtaaccgtcagacaagacctcgagaaacaactcggagaattacgcgatgaatttaatgcattatctcaacaaattgcaatgtcacagctaatagatttagcactattgccgttggatatgtt-3’，如seqid no.8所示。

15、p[41]特异性扩增片段的序列结构具体为：

16、5’-gcagcgtcatcaatatctagaggatcaacaataagatcaattagttcatcagtttcagcatggacagaaatttcggattcagctggggacttaactacgacagctagctcagtggcaacacagactgcaacacttagcagacgactaagattaaaagaaattgccacgcagactgatggtatgaatttcgacgatatttctgctgcagtgcttaagactaaaatagataggtctacacaaattacaccaaacacattaccagacattgtgacagaagcatcagaaaaattcataccaaacagagcgtatagagttgtagataatgatgaagtg-3’，如seq id no.9所示。

17、在本发明的第二个方面，提供一种兔轮状病毒基因分型的多重rt-pcr检测试剂盒，该试剂盒包含所述seq id no.1～6所示的引物。

18、在本发明的第三个方面，提供所述引物和/或试剂盒在检测兔轮状病毒基因分型中的应用。

19、在本发明的第四个方面，提供一种兔轮状病毒基因分型的多重rt-pcr检测方法，该方法包括以下步骤：

20、(1)待测样本中rna的提取；

21、(2)以rna为模板，通过上述引物进行rt-pcr基因扩增；

22、(3)电泳观察：反应结束后取pcr产物加入琼脂糖凝胶中进行电泳观察，当扩增片段为104bp，则样本中兔轮状病毒为g3型；当扩增片段大小为333bp，则样本中兔轮状病毒为p[22]型；当扩增片段为512bp，则样本中兔轮状病毒为p[41]型。

23、步骤(1)中，采用trizol法进行rna提取。

24、步骤(2)中，所述rt-pcr反应体系：2×one stepbuffer10μl，primescript onestep酶混合液0.5μl，上、下游引物(20μmol/μl)各0.5μl，template 2μl，ddh2o补充至20μl。漩涡混匀，离心。

25、所述rt-pcr反应的扩增参数为：50℃、30min，94℃、3min，94℃、20s、50℃、20s、72℃、30s，共循环35次；72℃、10min。

26、与本发明人知晓的相关技术相比，本发明其中的一个技术方案具有如下有益效果：

27、本发明所述检测lrv基因分型的特异性引物，是根据lrv的vp7、vp4基因序列设计的引物，并基于该特异性引物的性质，本发明进一步优化建立了适宜于快速准确进行lrv基因分型检测的rt-pcr方法。采用rt-pcr方法鉴别检测lrv基因型，g3型预期扩增片段大小为104bp，p[22]型预期扩增片段大小为333bp，p[41]型预期扩增片段大小为512bp。本发明的检测方法具有很强的敏感性，对g3、p[22]、p[41]型的最低模板检测浓度分别为2×10-8ng/ml、2×10-7ng/ml和1×10-7ng/ml；特异性与重复性良好，该方法操作简单、快速，适用于临床生产和实验室的兔轮状病毒的快速分型检测。

技术特征：

1.一种兔轮状病毒基因分型的多重rt-pcr检测的引物，其特征是，所述引物包含以下3对特异性引物对，其核苷酸序列分别如seq id no.1～6所示。

2.根据权利要求1所述的兔轮状病毒基因分型的多重rt-pcr检测的引物，其特征是，seq id no.1～2所示的引物对应的特异性扩增片段位于lrv vp7基因的第636-739位点之间，大小为104bp；seq id no.3～4所示引物对应的特异性扩增片段位于lrv vp4基因的第1087-1598位点之间，大小为333bp；seq id no.5～6引物对应的特异性扩增片段位于lrvvp4基因的第1685-2017位点之间，大小为512bp。

3.一种兔轮状病毒基因分型的多重rt-pcr检测试剂盒，其特征是，该试剂盒包含权利要求1所述的引物。

4.权利要求1或2所述的引物和/或权利要求3所述的试剂盒在检测兔轮状病毒基因分型中的应用。

5.一种兔轮状病毒基因分型的多重rt-pcr检测方法，其特征是，该方法包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的兔轮状病毒基因分型的多重rt-pcr检测方法，其特征是，检测的基因型包括g3、p[22]和p[41]，其中：

7.根据权利要求5所述的兔轮状病毒基因分型的多重rt-pcr检测方法，其特征是，步骤(1)中，采用trizol法进行rna提取。

8.根据权利要求5所述的兔轮状病毒基因分型的多重rt-pcr检测方法，其特征是，步骤(2)中，rt-pcr反应体系：

9.根据权利要求5所述的兔轮状病毒基因分型的多重rt-pcr检测方法，其特征是，步骤(2)中，rt-pcr反应的扩增参数为：50℃、30min，94℃、3min，94℃、20s、50℃、20s、72℃、30s，共循环35次；72℃、10min。

技术总结
本发明公开一种兔轮状病毒基因分型的多重RT‑PCR检测的引物及检测方法，属于生物技术领域。所述引物包含以下3对特异性引物对，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～6所示。检测的基因型包括G3、P[22]和P[41]。本发明能够快速高效地检测出兔轮状病毒的3种基因型，可以有效的节约稀少样本，同时节省试剂，具有较高的灵敏度和特异性，结果判断简单，应用方便，检测成本低、效率高，适用于相关临床病例的快速基因分型及流行病学调查，为兔轮状病毒分型的特异性检测及兔轮状病毒的监测提供参考。

技术研发人员：赵巧雅,黄兵,马秀丽,鞠艳,姜亦飞,刘丽萍,胡峰,高月花,刘存霞,朱彤
受保护的技术使用者：山东省农业科学院家禽研究所（山东省无特定病原鸡研究中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23