一种包载有抑制NFKBIZ基因表达的功能核酸的工程化外泌体及其应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种包载有抑制nfkbiz基因表达的功能核酸的工程化外泌体及其应用。

背景技术：

1、干眼(ded)是一种多因素导致的眼表疾病，常伴有不稳定的高渗泪膜，可导致眼部不适、视觉障碍，严重者可能造成失明。目前，ded已影响了全球约30％的人口，是全球最常见的眼表疾病，给社会带来了巨大的经济负担。虽然ded的发病机制还没有完全阐述清楚，但是炎症反应作为先天性免疫反应和适应性免疫反应的伴随过程，已被确定为引发ded恶性循环的关键因素。ded的恶性循环是指炎症、高渗、细胞凋亡和泪膜失稳相互作用的恶性发展循环。因此，打破眼表的炎症恶性循环，恢复眼表稳态，是ded治疗的重要方向。糖皮质激素是一类应用广泛的抗炎药物，但长期使用可能导致患者眼压升高，具有引发青光眼和白内障等严重副作用的风险，因此其应用受限。另一类新兴的干眼药物是以环孢素a为代表的免疫调节剂，可抑制t细胞的活化和细胞因子产生。并且，环孢菌素a滴眼液(restasis)，已被美国食品药品监督管理局(fda)批准用于ded治疗。但是，此类药物往往需要数周至数月才能生效，并且具有强疏水性，需要添加助溶剂才能形成均质滴眼液，存在潜在不良影响，如眼部灼伤、视力损伤等。

2、在典型的干眼进展过程中，异常的泪液渗透压激活上皮细胞中的nf-κb信号传导，刺激促炎细胞因子(如il-6、il-1β、tnf-α)、趋化因子和基质金属蛋白酶(mmps)的产生。这些炎性介质进一步促进先天免疫和获得性免疫细胞的浸润和活化，加剧炎症和干眼症状。为了打破这种恶性循环，调节nf-κb信号通路是治疗干眼的潜在方法。但是直接靶向转录因子nf-κb可能会破坏免疫系统平衡，引发严重的副作用。

3、此外，采用滴眼液进行眼表滴注是眼科治疗中最常见的非侵入性的给药方式，在干眼的治疗中得到了广泛应用。然而，由于亲水-疏水性交替、快速更新的泪膜屏障特点，以及紧密排列的角膜细胞对核酸药物的低生物利用度以及核酸药物易被降解的稳定性问题，眼表功能核酸药物的高效靶向递送仍然面临挑战。将功能核酸药物与脂质或配体(如抗体、适配体、肽或小分子)结合可以促进细胞摄取，但裸露的核酸药物仍然容易降解，大大降低药物的药效。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种包载有抑制nfkbiz基因表达的功能核酸的工程化外泌体，以眼表细胞来源的外泌体为载体，将抑制nfkbiz基因表达的功能核酸作为活性成分包裹在内，能有效抑制眼表炎症反应，同时具有良好的生物利用度和安全性。

2、本发明提供了一种包载有抑制nfkbiz基因表达的功能核酸的工程化外泌体，包括眼表细胞来源的外泌体和包裹在所述外泌体内部的抑制nfkbiz基因表达的功能核酸。

3、优选的，所述外泌体的来源细胞包括以下至少一种眼表细胞：角膜上皮细胞、角膜基质细胞、角膜缘干细胞、角膜纤维细胞和眼表浸润的免疫细胞；

4、优选的，所述眼表细胞包括天然眼部组织提取的眼表细胞和/或基因工程化眼表细胞。

5、优选的，所述外泌体为直接来源于眼表细胞的外泌体和/或来源于经人工改造的眼表细胞的外泌体。

6、优选的，所述人工改造的方法为利用以下至少一种靶标分子进行修饰：适配体、抗体、纳米抗体和天然产生的受体表面结合物或多肽。

7、优选的，所述功能核酸是以nfkbiz基因为靶标基因发挥抑制靶标基因表达功能的核酸分子。

8、所述功能核酸包括以下至少一种：双链核糖核酸、小干扰核糖核酸、微小核糖核酸、短发卡核糖核酸和反义寡核苷酸。

9、优选的，所述功能核酸的获得途径为天然材料分离得到或人工合成得到。

10、优选的，所述核酸分子包含以下任意一种或几种修饰的核苷酸：脱氧-核苷酸、3'端脱氧-胸腺嘧啶核苷酸、2'-o-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、构象限制的核苷酸、约束乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-o-烯丙基修饰的核苷酸、2'-c-烷基修饰的核苷酸、2'-羟基修饰的核苷酸、2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-o-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-脱水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸酯基的核苷酸、包含甲基膦酸酯基的核苷酸、包含5'-磷酸酯的核苷酸和包含5'-磷酸酯类似物的核苷酸。

11、本发明提供了所述的工程化外泌体的制备方法，将功能核酸包载在外泌体内部；

12、所述包载的方法包括以下至少一种：共挤出、超声法、电穿孔和膜融合。

13、本发明提供了所述的工程化外泌体或所述制备方法制备得到的工程化外泌体在制备预防和/或治疗干眼疾病的药物中的应用。

14、有益效果：

15、本发明的目的在于提供一种包载有抑制nfkbiz基因表达的功能核酸的工程化外泌体，以抑制nfkbiz基因表达的功能核酸作为活性成分，以外泌体作为载体。所述外泌体一方面可以起到活性成分的保护作用，防止快速降解，降低药效，另一方面借助外泌体表面蛋白的识别作用，高效递送抑制nfkbiz基因表达的功能核酸进入眼表细胞中，同时延长功能核酸在眼表的滞留时间，使功能核酸发挥眼表细胞nfkbiz基因和ikbζ蛋白的下调作用，从而抑制眼表炎症反应，调控眼表巨噬细胞的抗炎极化，恢复角膜组织结构和功能，促进泪液分泌和泪膜稳定，实现干眼治疗。本发明实施例结果对包载有抑制nfkbiz基因表达的功能核酸的工程化外泌体的安全性和有效性进行充分验证，而且制备简单，可规模化生产，具有极大的经济效益和转化价值。

技术特征：

1.一种包载有抑制nfkbiz基因表达的功能核酸的工程化外泌体，其特征在于，包括眼表细胞来源的外泌体和包裹在所述外泌体内部的抑制nfkbiz基因表达的功能核酸。

2.根据权利要求1所述的工程化外泌体，其特征在于，所述外泌体的来源细胞包括以下至少一种眼表细胞：角膜上皮细胞、角膜基质细胞、角膜纤维细胞、角膜缘干细胞和眼表浸润的免疫细胞。

3.根据权利要求2所述的工程化外泌体，其特征在于，所述眼表细胞包括天然眼部组织提取的眼表细胞和/或基因工程化眼表细胞。

4.根据权利要求2所述的工程化外泌体，其特征在于，所述外泌体为直接来源于眼表细胞的外泌体和/或来源于经人工改造的眼表细胞的外泌体。

5.根据权利要求1～4中任意一项所述的工程化外泌体，其特征在于，所述功能核酸是以nfkbiz基因为靶标基因发挥抑制靶标基因表达功能的核酸分子。

6.根据权利要求5所述的工程化外泌体，其特征在于，所述功能核酸包括以下至少一种：双链核糖核酸、小干扰核糖核酸、微小核糖核酸、短发卡核糖核酸和反义寡核苷酸。

7.根据权利要求6所述的工程化外泌体，其特征在于，所述功能核酸的获得途径为天然材料分离得到或人工合成得到。

8.根据权利要求6所述的工程化外泌体，其特征在于，所述核酸分子包含以下任意一种或几种修饰的核苷酸：脱氧-核苷酸、3'端脱氧-胸腺嘧啶核苷酸、2'-o-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、构象限制的核苷酸、约束乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-o-烯丙基修饰的核苷酸、2'-c-烷基修饰的核苷酸、2'-羟基修饰的核苷酸、2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-o-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-脱水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸酯基的核苷酸、包含甲基膦酸酯基的核苷酸、包含5'-磷酸酯的核苷酸和包含5'-磷酸酯类似物的核苷酸。

9.权利要求1～8中任意一项所述的工程化外泌体的制备方法，其特征在于，将功能核酸包载在外泌体内部；

10.权利要求1～8任意一项所述的工程化外泌体或权利要求9所述制备方法制备得到的工程化外泌体在制备预防和/或治疗干眼疾病的药物中的应用。

技术总结
本发明提供了一种包载有抑制NFKBIZ基因表达的功能核酸的工程化外泌体及其应用，属于生物医药技术领域。包载有抑制NFKBIZ基因表达的功能核酸的工程化外泌体包括外泌体和包裹在所述外泌体内部的用于抑制NFKBIZ基因的功能核酸。功能核酸基于外泌体的保护和靶向作用被细胞摄取，通过靶向NFKBIZ基因，下调眼表NFKBIZ基因以及IkBζ蛋白的表达，从而抑制干眼相关炎症因子的分泌，调控眼表巨噬细胞抗炎极化，遏制了干眼的炎症恶性循环，高效发挥治疗效果。本发明提供的工程化外泌体具有优良的安全性和有效性，而且制备简单，可规模化生产，具有极大的经济效益和转化价值。

技术研发人员：张川,谢淼,江凯
受保护的技术使用者：上海交通大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23