一种无机抗菌纳米制剂、及其制备方法和应用

1.本发明属于医药技术领域，特别是一种无机抗菌纳米制剂、及其制备方法和应用。


背景技术：

2.真菌感染治疗需求迫切，但临床上治疗真菌感染的药物仅有4类，即唑类、多烯类、棘白菌素类和氟胞嘧啶类。由于现有药物的长时间、高剂量使用，耐药真菌层出不穷。由于药物种类不足，真菌一旦对任何一类药物产生耐药性，其治疗难度将急剧增加，而多药耐药真菌将使感染者无药可治。唑类药物本身不能完全杀灭真菌，且念珠菌属可通过表达多药外排转运蛋白抵抗唑类药物；棘白菌素类药物是治疗侵袭性念珠菌病的最新一线用药，但抗菌谱较窄，且光滑念珠菌对其耐药性较强。更为严重的是，多种多药耐药真菌也相继被报道，包括耳念珠菌(candida auris)、镰孢菌(fusarium spp.)、丝孢菌属(scedosporium spp.)等。近年来爆发于医院内的耳念珠菌被称为“超级真菌”，其多药耐药性对患者造成致命威胁。另一方面，当前抗真菌药物的毒性严重限制了其在侵袭性真菌感染治疗中的应用。多烯类药物两性霉素b已有超半个世纪的使用历史，但毒副作用明显，包括严重的肾毒性、静脉滴注不良反应；5-氟胞嘧啶作用于核糖核酸并抑制蛋白质合成，可造成肝毒性、肾毒性和消化道毒性等严重不良反应；唑类药物可抑制药物代谢相关的细胞色素p450酶，从而与其他药物相互作用。
3.随着纳米技术和生物材料广泛应用于生物医药，针对抗真菌药物展开了广泛研究。抗真菌纳米药物主要在临床前研究阶段，具有杀菌机制独特、不易耐药等优势。但是，抗真菌纳米药物的主要问题如下。
4.第一，抗真菌活性不足。目前，自身抗真菌活性强的纳米药物鲜有报道。对真菌抑制率达到90％以上需要的药物浓度普遍较高(10μg/ml以上)。纳米药物的抗真菌活性一般低于临床一线小分子药物。另一方面，大多数纳米材料仅作为载体递送小分子药物。
5.第二，高抗真菌活性的纳米制剂通常成分、结构较为复杂，需要结合抗菌药物或其他治疗模式。近期研究报道的高活性抗真菌纳米药物，结合了光学治疗、化学药物治疗等手段，其成分较多，质量控制较为困难，不利于临床转化。
6.第三，生物相容性有待验证。对于成分较为复杂的纳米制剂，不仅质控复杂，且系统给药的生物安全性验证不足，用于静脉注射治疗侵袭性真菌感染可行性较差。
7.因此，急需开发抗真菌活性强、成分简单且生物相容性好的纳米药物。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种抗真菌活性强、成分简单且生物相容性好无机抗菌纳米制剂。
9.本发明的第二目的在于提供此种无机抗菌纳米制剂的制备方法。
10.本发明的第三目的在于提供此种无机纳米制剂的用途。
11.本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种无机抗菌纳米制剂，所述无机抗菌
纳米制剂由cu、fe、se或/和辅料组成的纳米结构，三种元素的价态分别是：cu为+1、fe为+3、se为-2。
12.进一步地，所述辅料为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乳酸、壳聚糖或透明质酸中的任意一种；
13.进一步地，所述无机抗菌纳米制剂中cu元素质量分数占比为5～13％，fe元素质量分数占比为3～15％，se元素质量分数占比为12～34％，辅料的质量分数占比为39～79％。
14.一种无机抗菌纳米制剂的制备方法，盛有去离子水的反应容器中加入se粉，在氮气氛围下，将nabh4的水溶液加入反应容器中进行反应，所述反应时间为至少1.5h，反应结束后将混合溶液加入反应容器中继续反应至少50min，制得无机抗菌纳米制剂；其中，所述混合溶液为氯化铜、氯化亚铁和辅料的水溶液。
15.进一步地，所述的反应最适温度为10～40℃，过高或过低的温度不利于纳米粒子的形成。
16.进一步地，加入nabh4的水溶液前，反应容器中通氮气的时间不少于30min，且反应均在氮气氛围下进行。由于氧气会与nabh4发生氧化还原应从而使se粉不能完全被还原导致实验失败，因此，至少通30min氮气保证氧气基本除去。
17.进一步地，所述混合溶液的制备方法为：氯化铜、氯化亚铁和辅料加入去离子水中，采用超声振动的方式混合均匀，超声振动使溶质完全溶解且可以排出氧气。
18.进一步地，它还包括：将反应后的溶液在去离子水中透析48h以上后再冻干。
19.上述的无机抗菌纳米制剂、上述的方法制备的无机抗菌纳米制剂在制备抑制真菌药物或革兰氏阳性细菌药物中的应用。
20.进一步地，所述真菌为白色念珠菌，所述革兰氏阳性细菌为金黄色葡萄球菌。
21.本发明具有以下优点：本发明提供的一种无机抗菌纳米制剂，由cu、fe、se或/和辅料组成，成分简单，来源广、成本低；制备无机抗菌纳米制剂的方法快速便捷，所用溶剂为去离子水，整个生产过程无需使用任何有机溶剂，因此，制备的无机抗菌纳米制剂安全性更高、生物相容性好、抗菌活性强。本发明公开的无机纳米制剂不仅对真菌具有超高的抗菌活性，对革兰氏阳性细菌，如金黄色葡萄球菌也具有较强的抗菌活性。
附图说明
22.图1为本发明的无机抗菌纳米制剂的物理表征，图中，a为低分辨率透射电子显微镜照片；b为针对单个粒子的高分辨透射电子显微镜照片；c为电子衍射图；d为元素映射图形。
23.图2为本发明的无机抗菌纳米制剂的确证，图中，e为动态光散射数据；f-h分别为三种元素的xps(x射线光电子能谱)数据。
24.图3为本发明的无机抗菌纳米制剂对真菌白色念珠菌(种属atcc 10231)的抑制活性实验结果图，图中，a为酶标仪分析法各制剂抗活性测试结果图；b为各抑制剂对白色念珠菌(种属atcc 10231)的抑制率结果图。
25.图4为本发明的无机抗菌纳米制剂对真菌白色念珠菌(种属bncc 359501)的抑制活性实验结果图，图中，c为酶标仪分析法各制剂抗白色念珠菌(种属bncc 359501)活性测试结果图；d为各抑制剂对白色念珠菌(种属bncc 359501)的抑制率结果图。
26.图5为平板涂布法比较本发明的无机抗菌纳米制剂与5-氟胞嘧啶的抗真菌活性结果图。
27.图6本发明的无机抗菌纳米制剂对金黄色葡萄球菌的强抑制作用以及活体伤口金黄色葡萄球菌感染的有效治疗图。
28.图7本发明的无机抗菌纳米制剂生物相容性实验结果图，图中，a)、b)溶血评价；c)细胞毒性评价；d)静脉注射急性毒性评价。
具体实施方式
29.下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：
30.实施例1：一种无机抗菌纳米制剂的制备方法
31.向三颈瓶中加入21.8mg se粉和48ml去离子水，并通入氮气。反应容器中通氮气的时间不少于30min，在氮气氛围下，将1.5ml浓度为35mg/ml的nabh4的水溶液加入反应容器中进行反应，反应温度为10℃，所述反应时间为1.5小时。反应结束后将金属离子混合溶液加入反应容器中继续反应50min可得无机纳米制剂。其中，所述金属离子混合溶液为氯化铜、氯化亚铁的水溶液，所述混合溶液的制备方法为：18.19mg氯化铜、16.21mg氯化亚铁加入去离子水中，采用超声振动的方式混合均匀。
32.实施例2：一种无机抗菌纳米制剂的制备方法
33.向三颈瓶中加入21.8mg se粉和48ml去离子水，并通入氮气。反应容器中通氮气的时间不少于30min，在氮气氛围下，将1.5ml浓度为35mg/ml的nabh4的水溶液加入反应容器中进行反应，反应温度为40℃，所述反应时间至少为1.5h。反应结束后将金属离子混合溶液加入反应容器中继续反应至少50分钟。将反应后的溶液在去离子水环境中透析48小时以上，冻干后，制得抗菌纳米制剂；其中，所述混合溶液为氯化铜、氯化亚铁和辅料的水溶液，所述金属离子混合溶液的制备方法为：18.19mg氯化铜、16.21mg氯化亚铁和20mg辅料加入去离子水中，采用超声振动的方式混合均匀；本实施例中所述辅料可以为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乳酸、壳聚糖或透明质酸中的任意一种。
34.实施例3：一种无机抗菌纳米制剂的制备方法
35.向三颈瓶中加入21.8mg se粉和48ml去离子水，并通入氮气。反应容器中通氮气的时间不少于30min，在氮气氛围下，将1.5ml浓度为35mg/ml的nabh4的水溶液加入反应容器中进行反应，反应温度为26℃，所述反应时间至少为1.5h。反应结束后将金属离子混合溶液加入反应容器中继续反应至少50分钟。将反应后的溶液在去离子水环境中透析48小时以上，冻干后，制得抗菌纳米制剂1；其中，所述混合溶液为氯化铜、氯化亚铁和pvp辅料的水溶液，所述金属离子混合溶液的制备方法为：18.19mg氯化铜、16.21mg氯化亚铁和20mg pvp辅料加入去离子水中，采用超声振动的方式混合均匀。
36.通过电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)测试并计算可得，制剂1中cu元素质量分数占比为12.86％，fe元素质量分数占比为14.08％，se元素质量分数占比为33.9％，辅料的质量分数占比为39.16％，化学组成为cu
1.6192 fe
2.0161
se
3.4347
。
37.实施例4：一种无机抗菌纳米制剂的制备方法
38.室温下，向三颈瓶中加入21.8mg se粉和48ml去离子水，并通入氮气。反应容器中
通氮气的时间不少于30min，在氮气氛围下，将1.5ml浓度为35mg/ml的nabh4的水溶液加入反应容器中进行反应，所述反应时间至少为1.5h。反应结束后将金属离子混合溶液加入反应容器中继续反应至少50分钟。将反应后的溶液在去离子水环境中透析48小时以上，冻干后，制得抗菌纳米制剂2；其中，所述混合溶液为氯化铜、氯化亚铁和pvp辅料的水溶液，所述金属离子混合溶液的制备方法为：18.19mg氯化铜、16.21mg氯化亚铁和40mg pvp辅料加入去离子水中，采用超声振动的方式混合均匀。
39.通过电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)测试并计算可得，制剂2中cu元素质量分数占比为7.67％，fe元素质量分数占比为8.46％，se元素质量分数占比为19.36％，辅料的质量分数占比为64.51％，化学组成为cu
0.9651
fe
1.2115
se
1.9618
。
40.实施例5：一种无机抗菌纳米制剂的制备方法
41.室温下，向三颈瓶中加入21.8mg se粉和48ml去离子水，并通入氮气。反应容器中通氮气的时间不少于30min，在氮气氛围下，将1.5ml浓度为35mg/ml的nabh4的水溶液加入反应容器中进行反应，所述反应时间至少为1.5h。反应结束后将金属离子混合溶液加入反应容器中继续反应至少50分钟。将反应后的溶液在去离子水环境中透析48小时以上，冻干后，制得抗菌纳米制剂3；其中，所述混合溶液为氯化铜、氯化亚铁和pvp辅料的水溶液，所述金属离子混合溶液的制备方法为：18.19mg氯化铜、16.21mg氯化亚铁和60mg pvp辅料加入去离子水中，采用超声振动的方式混合均匀。
42.通过电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)测试并计算可得，制剂3中cu元素质量分数占比为8.92％，fe元素质量分数占比为11.19％，se元素质量分数占比为23.75％，辅料的质量分数占比为56.14％，化学组成为cu
1.1232
fe
1.6021
se
2.4063
。
43.实施例6：一种无机抗菌纳米制剂的制备方法
44.室温下，向三颈瓶中加入21.8mg se粉和48ml去离子水，并通入氮气。反应容器中通氮气的时间不少于30min，在氮气氛围下，将1.5ml浓度为35mg/ml的nabh4的水溶液加入反应容器中进行反应，所述反应时间至少为1.5h。反应结束后将金属离子混合溶液加入反应容器中继续反应至少50分钟。将反应后的溶液在去离子水环境中透析48小时以上，冻干后，制得抗菌纳米制剂4；其中，所述混合溶液为氯化铜、氯化亚铁和pvp辅料的水溶液，所述金属离子混合溶液的制备方法为：18.19mg氯化铜、16.21mg氯化亚铁和80mg pvp辅料加入去离子水中，采用超声振动的方式混合均匀。
45.通过电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)测试并计算可得，制剂4中cu元素质量分数占比为8.74％，fe元素质量分数占比为6.56％，se元素质量分数占比为15.56％，辅料的质量分数占比为69.13％，化学组成为cu
1.1004
fe
0.9400
se
1.5767
。
46.实施例7：一种无机抗菌纳米制剂的制备方法
47.室温下，向三颈瓶中加入21.8mg se粉和48ml去离子水，并通入氮气。反应容器中通氮气的时间不少于30min，在氮气氛围下，将1.5ml浓度为35mg/ml的nabh4的水溶液加入反应容器中进行反应，所述反应时间至少为1.5h。反应结束后将金属离子混合溶液加入反应容器中继续反应至少50分钟。将反应后的溶液在去离子水环境中透析48小时以上，冻干后，制得抗菌纳米制剂5；其中，所述混合溶液为氯化铜、氯化亚铁和pvp辅料的水溶液，所述金属离子混合溶液的制备方法为：18.19mg氯化铜、16.21mg氯化亚铁和100mg pvp辅料加入去离子水中，采用超声振动的方式混合均匀。
48.通过电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)测试并计算可得，制剂5中cu元素质量分数占比为5.16％，fe元素质量分数占比为3.38％，se元素质量分数占比为12.85％，辅料的质量分数占比为78.61％，化学组成为cu
0.6500
fe
0.4838
se
1.3019
。
49.实施例8：一种无机抗菌纳米制剂的制备方法
50.室温下，向三颈瓶中加入21.8mg se粉和48ml去离子水，并通入氮气。反应容器中通氮气的时间不少于30min，在氮气氛围下，将1.5ml浓度为35mg/ml的nabh4的水溶液加入反应容器中进行反应，所述反应时间至少为1.5h。反应结束后将金属离子混合溶液加入反应容器中继续反应至少50分钟。将反应后的溶液在去离子水环境中透析48小时以上，冻干后，制得抗菌纳米制剂6；其中，所述金属离子混合溶液为氯化铜、氯化亚铁和pvp辅料的水溶液，所述混合溶液的制备方法为：18.19mg氯化铜、16.21mg氯化亚铁和120mg pvp辅料加入去离子水中，采用超声振动的方式混合均匀。
51.通过电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)测试并计算可得，制剂6中cu元素质量分数占比为5.89％，fe元素质量分数占比为7.67％，se元素质量分数占比为13.39％，辅料的质量分数占比为73.06％，化学组成为cu
0.7410
fe
1.0983
se
1.3564
。
52.以下通过实验说明本发明的有益效果：
53.室温下，向三颈瓶中加入21.8mg se粉和48ml去离子水，并通入氮气。反应容器中通氮气的时间不少于30min，在氮气氛围下，将1.5ml浓度为35mg/ml的nabh4的水溶液加入反应容器中进行反应，所述反应时间为2小时。将18.19mg氯化铜、16.21mg氯化亚铁和100mg pvp辅料加入2ml去离子水中充分混合后，注入三颈瓶中，反应至少1小时后，将产物透析48小时以上，冻干得到无机抗菌纳米制剂(实施例7)。
54.物理表征与确证
55.对上述制备的无机抗菌纳米制剂进行物理表征与确证，包括透射电子显微镜表征、元素确证、粒径与表面电位、元素价态确证，实验结果如图1、图2所示，由图可知：图1a为发明涉及纳米制剂的低分辨率透射电子显微镜照片，由于pvp修饰，可见小纳米粒子呈片状分布；图1b为针对单个粒子的高分辨透射电子显微镜照片，可见粒子的晶格条纹；图1c为选区电子衍射，可推测部分粒子的多晶结构；图1d为元素映射图像，分别为暗场成像、铜元素的分布、铁元素的分布、硒元素的分布，该图验证了纳米制剂的元素组成(实施例7)。
56.图2中e为纳米制剂动态光散射数据，可见所制备处方的有效粒径为268.7
±
6.198nm；多分散参数为0.1233
±
0.007095；zeta电位为-29.1
±
0.5mv。图2f-图2h为xps(x射线光电子能谱)数据，可得到三种元素的价态，其中铜为+1、铁为+3、硒为-2。
57.1.抑制真菌活性实验
58.采用本发明的纳米制剂(实施例7)、氟康唑、特比奈芬、5-氟胞嘧啶、金纳米粒子、银纳米粒子对白色念珠菌进行进行抗菌实验，实验结果如图3、图4和图5所示。
59.由图可知：本发明涉及的纳米制剂对真菌具有极高的抑制活性，优于临床一线小分子药物和常见纳米粒子。图3a为酶标仪分析法对本发明涉及的纳米制剂与其他制剂抗白色念珠菌(种属atcc 10231)活性测试结果，所选择浓度为50、25、12.5、6.25、3.125、1.56微克/毫升。图3、图4中标注的英文词汇对照如下：nanoparticle(本发明涉及的纳米制剂)，fluconazole(氟康唑),terbinafine(特比奈芬),5-fc(5-氟胞嘧啶),au(金纳米粒子)，ag(银纳米粒子)。进一步，我们比较了低浓度(1.56微克/毫升)下，各个制剂的抗真菌活性。如
图3b所示，发明涉及的纳米制剂对白色念珠菌(种属atcc 10231)的抑制率显著高于其他各类制剂。图4c和图4d的实验方案同2a与2b，不同之处在于使用了耐药性更强的白色念珠菌种属(bncc 359501)。图5为平板涂布法比较发明涉及的纳米制剂与5-氟胞嘧啶的抗真菌活性。可见，本发明涉及的纳米制剂在1.56微克/毫升的低浓度下即可完全抑制菌落的生长；而5-氟胞嘧啶在各个浓度下均无法抑制菌落的生长。
60.2.抑制金黄色葡萄球菌的实验
61.采用本发明制备的纳米制剂(实施例3)及空白对照组进行平板实验和活体伤口感染实验，结果如图6所示。
62.由图6可知：本发明涉及无机纳米制剂对金黄色葡萄球菌的强抑制作用以及活体伤口金黄色葡萄球菌感染的有效治疗。
63.3.细胞相容性实验
64.本发明涉及的纳米制剂(实施例7)具有优越的生物相容性。我们通过酶标仪吸光度测试检测了本发明涉及的纳米制剂对红细胞的溶血作用，实验结果如图7所示，从图7a可知，本发明涉及的纳米制剂在1.56至50微克/毫升的浓度范围内，不会对红细胞造成明显的溶血，其溶血率甚至低于pbs缓冲液对照组，阳性对照组曲拉通(triton x-100)红细胞大部分发生溶血；肉眼观察图7b也可发现，本发明涉及的纳米制剂不会造成明显的红细胞溶血。我们使用mtt法检测了不同浓度的该纳米制剂与动物心肌细胞(h9c2细胞系)共同孵育16-48小时后，动物细胞活性的变化。如图7c所示，发明所涉及的纳米制剂在1.56至50微克/毫升的浓度范围内，对该细胞无明显毒性。最后，我们通过尾静脉注射的方式，将50微升浓度为50微克/毫升的该纳米制剂对小鼠进行给药，并于给药后24小时处死小鼠，获取主要脏器并通过病理切片考察急性毒性。如图7d所示，与pbs对照组相比，本发明涉及的纳米制剂(nanoparticles)在活体水平对小鼠无明显急性毒性。
65.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种无机抗菌纳米制剂，其特征在于，所述无机抗菌纳米制剂由cu、fe、se或/和辅料组成的纳米结构，三种元素的价态分别是：cu为+1、fe为+3、se为-2。2.如权利要求1所述的一种无机抗菌纳米制剂，其特征在于，所述辅料为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乳酸、壳聚糖或透明质酸中的任意一种。3.如权利要求1所述的一种无机抗菌纳米制剂，其特征在于，无机抗菌纳米制剂中cu元素质量分数占比为5～13％，fe元素质量分数占比为3～15％，se元素质量分数占比为12～34％，辅料的质量分数占比为39～79％。4.根据权利要求1所述的一种无机抗菌纳米制剂的制备方法，其特征在于，盛有去离子水的反应容器中加入se粉，在氮气氛围下，将nabh4的水溶液加入反应容器中进行反应，所述反应时间为至少1.5h，反应结束后将混合溶液加入反应容器中继续反应至少50min，制得无机抗菌纳米制剂；其中，所述混合溶液为氯化铜、氯化亚铁或/和辅料的水溶液。5.如权利要求4所述的一种无机抗菌纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述的反应最适温度为10～40℃。6.如权利要求4所述的一种无机抗菌纳米制剂的制备方法，其特征在于，加入nabh4的水溶液前，反应容器中通氮气的时间不少于30min，且反应均在氮气氛围下进行。7.如权利要求4所述的一种无机抗菌纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述混合溶液的制备方法为：氯化铜、氯化亚铁或/和辅料加入去离子水中，采用超声振动的方式混合均匀。8.如权利要求4所述的一种无机抗菌纳米制剂的制备方法，其特征在于，它还包括：将反应后的溶液在去离子水中透析48h以上再冻干。9.权利要求1或2或3所述的无机抗菌纳米制剂、权利要求4-8中任一所述的方法制备的无机抗菌纳米制剂在制备抑制真菌药物或革兰氏阳性细菌药物中的应用。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述真菌为白色念珠菌，所述革兰氏阳性细菌为金黄色葡萄球菌。

技术总结
本发明公开了一种无机抗菌纳米制剂、及其制备方法和应用。所述无机抗菌纳米制剂由Cu、Fe、Se或/和辅料组成的纳米结构，三种元素的价态分别是：Cu为+1、Fe为+3、Se为-2。无机抗菌纳米制剂在制备抑制真菌药物或革兰氏阳性细菌药物中的应用。本发明提供的一种无机抗菌纳米制剂成分简单，来源广、成本低；制备无机抗菌纳米制剂的方法快速便捷，所用溶剂为去离子水，整个生产过程无需使用任何有机溶剂，因此，制备的无机抗菌纳米制剂不仅抗菌活性强，而且安全性更高、生物相容性好。本发明公开的无机纳米制剂不仅对真菌具有超高的抗菌活性，对革兰氏阳性细菌，如金黄色葡萄球菌也具有较强的抗菌活性。菌活性。


技术研发人员：王朝辉
受保护的技术使用者：海南大学
技术研发日：2022.09.26
技术公布日：2023/1/6