以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑技术的制作方法

xiaoxiao6天前  4

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以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑技术的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及生物技术领域,具体而言,涉及一种以Argonaute内切核酸酶为核心的 简单的高效的精确的靶向基因编辑技术。
【背景技术】
[0002] 深入了解遗传信息以及进行基因治疗需要精确和有效的基因组编辑工具。基因或 基因组编辑是一种基因工程技术。该技术通过核酸酶对基因组的特定位点进行突变、插入、 置换等改造。基因编辑的过程包括三步:首先,经过特别设计的向导DNA或RNA(基因导向元 件)与核酸内切酶(基因切割元件)结合,前者引导后者到靶向基因的特定区域;其次,核酸 内切酶对靶向基因的特定区域进行切割,在两条DNA上各形成一个缺口,造成双链断裂 (DSB);最后,利用DSB激活细胞内固有的修复机制这一现象,在修复缺口的同时可以进行突 变、插入、置换等改造。大部分物种细胞对DSB有两种修复机制:
[0003] nonhomologous end-joining(NHEJ)和homologous directed repair(HDR)〇NHEJ 利用一系列酶反应将DNA断裂端直接重新连接;HDR需要一段同源序列作为修复模板对DSB 后失去的DNA序列进行复原。NHEJ是一种带有错误倾向性的低保真修复途径,它在修复过程 中往往带入突变。而HDR需要同源模板进行修复,于是可利用这一性质将外源的编码序列插 入基因组的靶向位点。HDR机制类似于同源重组,但因为HDR是基于DSB的修复,其引入外源 序列的成功率较同源重组高三个数量级。因此,这两种修复途径的特性成为了核酸酶高效 基因编辑的基础,对诱导的断裂区进行改造性修复。基因编辑技术对深入了解基因功能、改 变基因以及基因治疗有着革命性的意义。
[0004] 目前,应用于基因组编辑的核酸酶包括四个家族:Zinc finger nucleases (ZFNs)'Transcription Activator-Like Effector Nucleases(TALENs)、the engineered meganuclease re-engineered homing endonucleases和CRISPR/Cas9system〇前三者或者 对革巴向序列有特殊要求、或者针对祀向序列需要对酶本身个体化特定设计、或者有高脱革巴 可能,所以应用受到限制。CRISPR/Cas9是目前比较推崇的基因编辑系统。Cas9源自细菌,它 以向导RNA为引导,理论上可对基因组中的任何在靠近PAM序列上游的靶点进行切割造成 DSB。然而,因为RNA较易形成二级结构,因此对GC丰富的基因序列,Cas9系统效率低下。并 且,因为细胞自身产生大量RNA片段,Cas9有与这些非特异RNA结合被错误引导切割非靶向 基因组位点的可能性;而且Cas9对向导RNA和靶向DNA序列错配的耐受较高(5个核苷酸错配 不会阻止切割),所以Cas9有一定的脱靶缺陷。
[0005] Argonautes是一种核酸酶,其普遍存在于细菌、植物、真菌、哺乳细胞内。 Argonaute广为人们所知的是其参与RNA干扰机制,大部分物种的Argonaute与短链非编码 RNA相结合,后者作为向导RNA通过互补反应识别革E1向mRNA,引导Argonaute降解mRNA,或阻 止翻译进程达到抑制基因翻译的效果。近来发现从细菌Thermusthermophilus获取的 Argonaute (TtAgo)能够结合单链DNA并以后者为向导降解DNA质粒。这一现象提示某些物种 的Argonaute可作为DNA核酸内切酶。TtAgo自身因为酶切反应需要较高的温度(>65°C)而不 适于用作基因编辑工具。本发明中,我们公开了来自于一种细菌的Argonaute,其在37°C具 有很好的酶切活性适用于作为基因编辑的工具。该蛋白用5'磷酸化的单链DNA作为向导 DNA,对哺乳动物细胞的基因定点切割造成DSB。该Argonaute系统高效精准,向导DNA设计简 单,能有效地将外源基因片段导入切割区。其不受GC序列和PAM序列的限制,能针对基因组 的任何序列进行编辑,并且忠实度高。是较CRISPR/Cas9更为有效的基因编辑工具。

【发明内容】

[0006]本发明的目的是提供一种新型的以Argonaute核酸酶为主体的以短链DNA作为向 导的高保真基因编辑工具。其可被用于但不限于DNA体外编辑、细胞内DNA编辑、基因组基因 灭活、外源片段插入基因组。
[0007]本发明公开了 一种以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑方法,10-50°C以5 '端磷 酸化的单链向导DNA为向导,Argonaute核酸酶与所述向导DNA结合,对与该向导DNA互补的 革巴向DNA进行切割,造成革E1向DNA双链断裂。所述的Argonaute核酸酶为能以5'端磷酸化的单 链短链DNA作为向导对靶向双链DNA进行切割造成双链断裂的Argonaute核酸内切酶。
[0008] 本发明公开了一种以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑方法在基因组靶向编辑 上的应用。即在基因组造成靶向DNA双链断裂后,通过细胞自身的低保真Non-Homologous End Joining修复途径,引入突变,从而造成革El向基因或功能区灭活或改变。
[0009] 本发明公开了一种以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑方法在基因组靶向编辑 上的应用。即在基因组造成靶向DNA双链断裂后,在存在具有同源序列的外源DNA片段情况 下,能够通过细胞自身的Homologous Directed Repair修复途径将该外源DNA片段插入双 链断裂区,从而达到靶向基因或功能区按设计而改变。
[0010] 本发明的特点在于1、向导单链DNA设计简单,除5 '磷酸化24个核苷酸长外无特殊 序列或二级结构要求;2、对靶序列无特殊序列要求,靶序列富含GC不影响其切割效率,因此 可编辑基因组的任何位置;3、因为哺乳动物细胞内罕有5'磷酸化的单链DNA,所以基本不存 在被其它非向导DNA误导脱靶的可能;4、高特异低脱靶性,向导DNA与靶序列间1个碱基对的 错配就会造成切割效率大大下降;3个碱基对的错配会造成切割活性的丧失;5、因为向导是 DNA,因此转染细胞简单而且剂量可控。
【附图说明】
[0011 ] 图1: (a)靶质粒、靶切割位点和向导DNA的设计图。(b)靶质粒pACYCDuet-GFP与细 胞来源经过纯化的NgAgo蛋白以及向导DNA分别孵育4小时和8小时。随后电泳分析质粒。4小 时时部分质粒还处于完整的超螺旋结构,部分单链断裂成开环结构,部分双链断裂成线性 DNA』小时时反应完全,所有质粒均被双链切割。(c)靶质粒被NgAgo双链切割后靶位点测序 的部分结果。结果显示靶位点被定向切割并有部分序列被移除。
[0012]图2: (a)靶质粒、靶切割位点、向导DNA和向导RNA的设计图。(b)部分Hela细胞共转 染了 EGFP-N1靶质粒、NgAgo表达载体和标注的向导DNA;部分细胞共转染了靶质粒、Cas9表 达载体和标注的向导RNAaGFP蛋白的表达通过Western blot来检测。本Western电泳图是三 次独立实验的代表图,其相应半定量结果显示在左下方柱形图。右下方柱形图显示了NgAgo 系统和Cas9系统改变GFP蛋白表达的统计结果(林叶〈0.01)。(〇)用恥48〇的三种同源酶 HpAgo、NaAgo和NtAgo分别重复上述实验,结合向导DNA后,此三种Argonaute均可有效的革巴 向抑制靶蛋白GFP的表达。
[0013] 图3: (a)选取的两个靶位点分别是人基因组里HBA2和GATA4基因的高GC含量序列。 分别设计了针对这两个序列的向导DNA(G37和640)^13)2931 1细胞转染了NgAgo表达载体和 向导DNA,一些细胞转染了 Cas9表达载体和靶向于同一区域的向导RNA。随后用T7核酸内切 酶KT7EI)检测法检测基因组里的靶位点被编辑的效率。可以看见NgAgo系统对高GC含量的 靶向区编辑效率较Cas9系统要高得多。
[0014] 图4: (a)NgAgo系统对哺乳动物基因组连续多途径编辑实验模式图。RFP-TGA-GFP 供体DNA由以下序列组成:一个报告基因区和一个抗G418选择基因,后者由自带的CMV启动 子引导具有表达功能。前者报告基因区由一个红色荧光蛋白(RFP)基因和一个绿色荧光蛋 白(GFP)基因组成。二者由TGA转录终结子分隔。该供体DNA两端由两段人DYRK1A基因同源序 列构成。如果该供体DNA按正确读码框插入基因组的靶向位置,RFP和G418选择基因会表达 而GFP因为TGA的存在而不表达。(b) 293T细胞共转染了NgAgo表达载体、针对DYRK1A基因靶 向区的向导DNA和RFP-TGA-GFP供体DNA。3天后,细胞的靶向区用PCR扩增,发现供体DNA准确 的插入靶向区域。(c)通过G418选择两周后,绝大部分细胞表达RFP。这些细胞又被转染 NgAgo表达载体和针对TGA转录 终结子区的向导DNA进行第二次编辑,以去除表达阻隔使GFP 蛋白表达激活。2天后,流式细胞仪检测表明11.7%的细胞成功的表达了RFP-GFP红绿荧光 复合蛋白。
【具体实施方式】
[0015]本发明公开了 一种以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑方法,其特征在于以5' 端磷酸化的单链向导DNA为向导,Argonaute核酸酶与所述向导DNA结合,对与该向导DNA互 补的革巴向DNA进行切割,造成革巴向DNA双链断裂。所述的Argonaute核酸酶能在10-50°C编辑 DNA,具体为能以5 '端磷酸化的单链短链DNA作为向导对靶向双链DNA进行切割造成双链断 裂的Argonaut e核酸内切酶。
[0016] 所述的Argonaute核酸酶优选自以下(a)~(i)中的一种:
[0017] (a)来自 Natronobacterium gregoryi SP2 细菌,所述的 Natronobacterium gregoryi SP2细菌的ATCC菌株号为CP003377,所述的Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号 为:AFZ73749.1;
[0018] (b)来源于Microcystisaeruginosa NIES 843,简称MaAgo,所述的 Microcystisaeruginosa NIES 843的FACHB编号为315,所述的Argonaute核酸酶的NCBI基 因序列号为:WP_012265209.1;
[0019] (c)来源于Halosarcina pallida JCM14848,简称HpAgo,所述Halosarcina pallida JCM14848的中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC编号为:1.8954,所述的 Argonaute 核酸酶的GenBank:ELZ29017.1;
[0020] (d)来源于Natrialba asiatica DSM12278,简称NaAgo,所述Natrialba asiatica DSM12278 的 ATCC 编号为:700177, CGMCC 编号为:1.2199,所述的 Argonaute 核酸酶的 NCBI 基 因序列号:WP_006111085.1;
[0021 ] (e)来源于Natronorubrum tibetense GA33,简称NtAgo,所述Natronorubrum tibetense GA33的CGMCC编号:1.2123,所述的4找〇1^此6核酸酶的从^1基因序列号为:肝_ 006090832.1;
[0022] (f)来源于Natrinema pellirubrum DSM15624,简称NpAgo,所述Natrinema pellirubrum DSM15624的CGMCC编号:1.3708,所述的4坪〇1^此6核酸酶的从^1基因序列号 为 NCBI 基因序列号:WP_006183335.1;
[0023] (g)来源于Microcystis sp.7806,简称SPAgo,所述Microcystis sp.7806的中国 科学院淡水藻种库(FACHB)编号:FACHB-915,所述Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为: WP_002747795.1;
[0024] (h)来源于Microcystis aeruginosa NIES843,简称NIESAgo,所述Microcystis aeruginosa NIES843的FACHB编号为:315,所述Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为:WP_ 012265209.1;
[0025] (i)来源于Synechococcus 7942,简称SchAgo,所述Synechococcus 7942的FACHB 编号为:805,所述Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号:WP_011378069.1。
[0026]本发明公开了一种以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑方法在基因组靶向编辑 上的应用。即在基因组造成靶向DNA双链断裂后,通过细胞自身的低保真Non-Homologous End Joining修复途径,引入突变,从而造成革El向基因或功能区灭活或改变。
[0027]本发明公开了一种以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑方法在基因组靶向编辑 上的应用。即在基因组造成靶向DNA双链断裂后,在存在具有同源序列的外源DNA片段情况 下,能够通过细胞自身的Homologous Directed Repair修复途径将该外源DNA片段插入双 链断裂区,从而达到靶向基因或功能区按设计而改变。
[0028]下面结合实施例进行说明。
[0029] 实施例一:体外DNA质粒内切
[0030] 1 ·将从Natronobacterium gregoryi SP2细菌获得的Argonaute(简称NgAgo)完整 阅读框克隆于pcDNA3.1质粒上,其5 '端和3 '端分别附带FLAG和HA标记序列。NgAgo的氨基酸 序列如SEQ ID N0:1所示。
[0031] 2.合成一段5'磷酸化的向导DNA 5'P-TGCTTCAGCCGCTACCCCGACCAC-3',其与 pACYCDuet-GFP靶向质粒上的GFP基因的一段序列互补(图la)。
[0032] 3.将构建的该FLAG-NgAg〇-HA-pcDNA3.1质粒与上述步骤2的向导片段共转染入人 源293T细胞。
[0033] 4.用FLAG,HA Tandem Affinity Purification Kit试剂盒(Sigma-Aldrich公司) 从被转染的细胞内纯化结合有向导DNA的FLAG-NgAgo-HA蛋白。
[0034] 5·5yg纯化的结合有向导DNA的NgAgo蛋白与400ng pACYCDuet-GFP质粒于50ul反 应体系37°C下(10mm Tris PH 8.0,20mM Nacl,0.5mM MgCl2,0.4%glycerol,2mM DTT and 20μg/ml BSA)孵育8小时。
[0035] 6.用proteinase K于52°C反应2小时降解反应体系里的蛋白,而后产物于1% agrose胶电泳。结果:孵育4小时后尚有未切割的超螺旋质粒以及单链切割的开放环状质 粒;部分质粒被双链切割成线性化。孵育8小时后可见所有质粒都被切割成双链断裂的线性 化质粒(图lb)。
[0036] 7.对反应8小时后的质粒产物的靶位点进行测序,发现靶向序列被NgAgo成功切 害J,并且靶向序列里1-20个核苷酸被随机去除(图lc)。
[0037]实施例二:哺乳动物细胞内Argonaute介导的质粒切割以及与CRISPR/Cas9系统介 导的切割效率的比较
[0038] 1.在NgAgo蛋白N端附加细胞核内定位信号(NLS),该改良蛋白NLS-NgAgo基因序列 构建于pcDNA3.1质粒上。NLS-NgAg〇-pcDNA3.1在Hela细胞表达后主要分布在细胞核内。 [0039] 2 ·Hela细胞共转染了EGFP-N1靶质粒、NLS-NgAg〇-pcDNA3 · 1表达质粒。另外,细胞 还分别转染了 4条针对靶质粒CMV启动子区和GFP编码区的向导DNA(G卜G4)(图2a)。转染条 件:200ng NLS_NgAgo_pcDNA3 · 1 质粒与 100ng向导DNA通过Lipof ectamine 2000转染入2 X 1〇5细胞内(于24孔板)。
[0040] 3.另外一组细胞共转染了EGFP-N1靶质粒、Cas9表达质粒SpCas9-pCDNA3.1以及分 别针对CMV启动子区的向导RNA(sgRNAl)和针对GFP编码区的向导RNA(sgRNA2)。
[0041 ] 4.转染36小时后,Western电泳分析GFP蛋白的表达量(图2b)。结果:NgAgo能够有 效的抑制质粒GFP的表达,并且效果较转染了同样剂量的Cas9要好。
[0042] 5.用同样的方法,我们发现来自于Halosarcina pallida JCM14848的Argonaute (简称HpAgo,HpAgo的氨基酸序列如SEQ ID N0:2)所示。来自于Natrialba asiatica DSM12278的Argonaute(简称NaAgo,NaAgo的氨基酸如SEQIDN0:3所示)。和来自于 Natronorubrum tibetense GA33的Argonaute(简称NtAgo,NtAgo的氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示)等Argonaute都与NgAgo-样有很强的编辑哺乳动物细胞内基因表达的能力(图 2c) 〇
[0043] 另外,
[0044] (b)来源于Microcystisaeruginosa NIES 843,简称MaAgo,所述的 Microcystisaeruginosa NIES 843的FACHB编号为315,所述的Argona ute核酸酶的NCBI基 因序列号为:WP_012265209.1;
[0045] (f)来源于Natrinema pellirubrum DSM15624,简称NpAgo,所述Natrinema pellirubrum DSM15624的CGMCC编号:1.3708,所述的Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号 为 NCBI 基因序列号:WP_006183335.1;
[0046] (g)来源于Microcystis sp.7806,简称SPAgo,所述Microcystis sp.7806的中国 科学院淡水藻种库(FACHB)编号:FACHB-915,所述Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为: WP_002747795.1;
[0047] (h)来源于Microcystis aeruginosa NIES843,简称NIESAgo,所述Microcystis aeruginosa NIES843的FACHB编号为:315,所述Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为:WP_ 012265209.1;
[0048] (i)来源于Synechococcus 7942,简称SchAgo,所述Synechococcus 7942的FACHB 编号为:805,所述Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号:WP_011378069.1;
[0049] 等Argonaute核酸酶也能在37°C编辑DNA(附图2b),它们的共同性在于都能以5'端 磷酸化的单链短链DNA作为向导对靶向双链DNA进行切割造成双链断裂(而其它大部分物种 的Argonaute都是以RNA作为向导切割靶向RNA)。
[0050] 实施例三:哺乳动物细胞内Argonaute介导的针对基因组内富含GC序列的切割以 及与CRISPR/Cas9系统介导的切割效率的比较
[0051 ] 1.293T细胞转染了 NLS-NgAgo表达质粒以及分别针对HBA2基因和GATA4基因里富 含GC区的向导DNA(图3a)。
[0052] 2.作为比较,一些293T细胞转染了 Cas9表达质粒以及针对同一区域的向导RNA。
[0053] 3.因为哺乳动物基因组的双链断裂主要通过细胞自发的indel-forming non- homologous end joining(NHEJ)途径进行修复,所以我们用T7核酸内切酶KT7EI)检测法 检测基因组靶序列被切割效率。在每个Τ7ΕΙ反应里,500ng PCR产物与Τ7核酸内切酶I反应, 后者会切割不配对的DNA序列。产物通过变性PAGE电泳以及银染检测。条带密度由Image Lab(Bio-Rad)软件分析.基因组被切割效率由以下公式计算:{l-[l-(b+c/a+b+c)]l/2}X 100(其中a代表DNA底物的条带密度,b和c代表切割后产物的条带密度)。
[0054] 4.结果:NgAgo能非常有效的切割这些基因组位点,但Cas9对这些基因组内富含GC 位点的切割活性非常有限(图3b)。
[0055] 实施例四:哺乳动物细胞内Argonaute介导的基因组HDR和NHEJ复合编辑
[0056] 1.供体DNA由一段报告基因和G418拮抗基因组成。报告基因又由两个报告片段组 成:分别是表达红色荧光的RFP(red monomer)和表达绿色荧光的GFP,它们被一个TGA转录 终结子分隔。报告基因不带启动子,因此供体DNA必须按正确编码结构(in-frame)插入基因 组后才能被表达。(图4a)
[0057] 2.以人类基因 DYRK1A的一段外显子为靶序列设计了向导DNA。
[0058] 3.293T细胞(24孔板)转染了200ng NLS-NgAgo表达质粒、100ng向导DNA以及500ng 供体DNA。
[0059] 4.3天后,通过荧光显微镜观察到有表达红色荧光的细胞存在,证明HDR介导的外 源DNA片段插入成功。另外,通过以下方法对靶位点PCR扩增后测序证明供体DNA插入成功: [0060] (1)细胞的基因组DNA通过QuickExtract DNA提取试剂盒(Epicentre)提取。
[0061 ] DYRK1A基因的靶向区随后用以下引物PCR扩增:
[0062] 5'Junction
[0063] DYRKlA-test-F:5 '-GGTCACTGTTGAAACTCATCC-3 ' and
[0064] Rm-test-R:5 '-CTTGTAGATGAAGGTGCCG-3 ';
[0065] 3'Junction
[0066] P〇lyA-test-F:5 '-CTAACTGAAACACGGAAGGAG-3 ' and
[0067] DYRKlA-test-R:5 '-CTTGTAGCGGTTCAGTGTGT-3 '
[0068] (2)PCR产物随后克隆到T-载体上接受测序,测序结果证明基因组上的靶位点被精 准插入了供体DNA (图4b)。
[0069] 5.细胞随后通过G418选择2周,所有的细胞都表达红色荧光。
[0070] 6.随后,插入的阳性细胞又被转染了NLS-NgAgo表达质粒以及针对TGA转录终结子 序列的向导DNA,希望NgAgo对TGA转录终结子切割后通过NHEJ途径错位修复造成转录终结 子失效(图4c)。
[0071] 7.2天后,流式细胞仪检测表明:11.7 %的细胞表达RED-GFP红绿荧光复合蛋白(图 4c) 〇
【主权项】
1. 一种以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑方法,其特征在于在10-50°c下以5 '端磷 酸化的单链向导DNA为向导,Argonaute核酸酶与所述向导DNA结合,对与该向导DNA互补的 靶向DNA进行切割,造成靶向DNA双链断裂。2. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述的Argonaute核酸酶为在10-50°C下能 以5'端磷酸化的单链短链DNA作为向导对靶向双链DNA进行切割造成双链断裂的Argonaute 核酸内切酶。3. 根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于所述的Argonaute核酸酶优选自以下(a) ~(i)中的一种: (a)所述的Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为:AFZ73749· 1; (b) 所述的Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为:WP_012265209 · 1; (c)所述的Argonaute核酸酶的GenBank:ELZ29017 · 1; (d) 所述的Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号:WP_006111085 · 1; (e)所述的Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为:WP_006090832.1; (f) 所述的Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为:WP_006183335.1; (g)所述Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为:WP_002747795 · 1; (h) 所述Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号为:WP_012265209 · 1; (i) 所述Argonaute核酸酶的NCBI基因序列号:WP_011378069.1。4. 权利要求1所述方法在基因组靶向编辑上的应用。5. 如权利要求4所述的应用,其特征在于在基因组造成靶向DNA双链断裂后,通过细胞 自身的低保真Non-HomologousEndJoining修复途径,引入突变,从而造成革巴向基因或功 能区灭活或改变。6.如权利要求4所述的应用,其特征在于在基因组造成靶向DNA双链断裂后,在存在具 有同源序列的外源DNA片段情况下,能够通过细胞自身的HomologousDirectedRepair修 复途径将该外源DNA片段插入双链断裂区,从而达到靶向基因或功能区按设计而改变。7. 权利要求1所述方法对细胞内病毒DNA靶向编辑上的应用。8. 权利要求1所述方法在体外DNA靶向编辑上的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑技术。在向导DNA存在下,Argonaute核酸内切酶能够对靶向DNA序列包括哺乳动物的基因组的任意位点进行切割,造成DNA双链断链从而达到编辑目的。编辑手段包括内切、删除、引入突变、外源序列插入、片段置换等。编辑效果包括基因灭活、基因突变、导入外源基因等。该蛋白可作为基因组编辑的重要工具。以该蛋白为核心的基因编辑工具具有操作简单、效率高、低脱靶高保真的特点。并且,几乎任何基因组位点都能被Argonaute核酸酶有效靶向和切割。利用本技术,有望实现高特异性和高效率的基因组靶向编辑。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105483118
【申请号】CN201510971234
【发明人】沈啸, 韩春雨
【申请人】浙江大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月21日

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