一种小麦抗穗发芽基因TaZFP18及其应用

xiaoxiao6天前  4

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一种小麦抗穗发芽基因TaZFP18及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是作物遗传育种的技术领域,尤其涉及的是一种小麦抗穗发芽基因 TaZFP18及其应用。
【背景技术】
[0002] 收获前穗发芽(Pre-harvest sprouting,PHS)是指作物临近收获前遭遇阴雨天气 导致籽粒直接在穗部发芽的现象。小麦发生收获前穗发芽会严重降低产量及品质的稳定 性。如果收获前遭遇持续阴雨天气时间越长,则穗发芽危害更严重。因此,培育穗发芽抗性 持续性强的小麦品种有助于降低这种风险。
[0003] 影响穗发芽的因素主要有外界环境因素和内部因子。光照和温度是主要环境因 素;内部因子主要有种子休眠性、种皮颜色、穗部形态、籽粒吸水特性、淀粉酶活性及内源 激素等,其中种子休眠性是影响穗发芽抗性的主要遗传机制。
[0004] 前人利用连锁分析及关联分析的方法定位了大量小麦种子休眠/穗发芽抗性相关 的QTL,几乎覆盖小麦21条染色体。然而已鉴定的QTL并非功能性标记,它仅代表染色体上的 某一区段,影响了分子标记辅助育种选择的高效性和准确性。目前,小麦穗发芽抗性相关功 能基因大都通过同源克隆被鉴定出来。然而,培育穗发芽抗性水平较高兼具持续性较强的 品种还需要继续挖掘抗穗发芽主效基因,以满足小麦穗发芽抗性的多基因分子聚合育种的 需求。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供了一种小麦抗穗发芽基因 TaZFPIS 及其应用,以提供一种新的小麦抗穗发芽主效基因,满足小麦穗发芽抗性的多基因分子聚 合育种的需求。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的:
[0007] 本发明提供了一种小麦抗穗发芽基因 TaZFP18,所述基因包含如SEQ ID N0.1所示 的核苷酸序列,或包含与SEQ ID NO. 1序列互补的核苷酸序列,该基因编码CCCH型锌指蛋白 18,可作为小麦穗发芽抗感品种的分子标记基因。
[0008] 本发明还提供了一种上述小麦抗穗发芽基因 TaZFP18在鉴定小麦穗发芽抗感品种 中的应用。
[0009] 本发明还提供了一种利用上述小麦抗穗发芽基因 TaZFPIS鉴定小麦穗发芽抗感品 种的方法,包括以下步骤:
[0010] (1)以小麦基因组DNA为模板,以C8DBS6BL-F和C8DBS6BL-R为特异性引物,进行PCR 扩增,所述C8DBS6BL-F和C8DBS6BL-R的序列为:
[0011] SEQ ID N0.2:C8DBS6BL-F:CGCGACAGGAAGTTTGC
[0012] SEQ ID N0.3:C8DBS6BL-R:ATTGAAGAGGATTGGAGGG
[0013] (2)若步骤(l)PCR扩增获得如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列或其互补序列,则该 小麦为穗发芽抗性品种,若步骤(1)未扩增获得如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其互补 序列,则该小麦为穗发芽感性品种。
[0014] 优选地,所述步骤(1)中,以小麦种子的基因组DNA为模板进行PCR扩增。
[0015] 本发明相比现有技术具有以下优点:本发明提供了一种小麦抗穗发芽基因 TaZFP18及其应用,该小麦抗穗发芽基因 TaZFP18为一种新的小麦抗穗发芽主效基因,利用 其开发分子标记,可以迅速鉴定小麦是否为穗发芽抗性品种,也为小麦穗发芽抗性育种提 供了新的基因资源。
【附图说明】
[0016] 图1为小麦穗发芽抗感品种的鉴定结果电泳图,其中,M:Marker,1:红芒春21,2:京 411,3:遂宁坨坨麦,4:济麦22,5:涪陵须须麦,6:烟农19,7:永川白壳壳麦,8:中优9507。
【具体实施方式】
[0017] 下面对本发明的实施例作详细说明,本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。
[0018] 实施例1
[0019] 1、材料
[0020] 本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法,所用 的试剂等材料,如无特别说明,均为市售购买产品,所用种质资源,均可从国家种质资源库 获得。
[0021] 2、方法
[0022] 2. lSDS-Tris饱和酚法抽提小麦基因组DNA
[0023] (1)分别取8种小麦品种的种子各2-3粒,置于2ml灭菌离心管,利用高通量组织研 磨仪研磨成粉末,所述小麦品种为红芒春21、京411、遂宁坨坨麦、济麦22、涪陵须须麦、烟农 19、永川白壳壳麦、中优9507,其中京411、济麦22、烟农19、中优9507可通过市售获得,红芒 春21、遂宁挖挖麦、涪陵须须麦、永川白壳壳麦(C.Chang et.al.Identifying alleles of Viviparous-IB associated with pre-harvest sprouting in micro-core collections of Chinese wheat germplasm,Molecular Breeding March 2010,Volume 25,Issue 3,pp 481-490)为地方品种,可通过国家种质资源库或当地直接购买获得。
[0024] (2)加入 1.2ml DNA提取缓冲液(200mM Tris-Cl,250mM NaCl,25mM EDTA,0.5% SDS,2%0-ME)〇
[0025] (3) 60°C水浴45min,期间间歇振荡以充分提取。
[0026] (4)室温下 12000rpm 离心 10min。
[0027] (5)转移上清液至新的2ml灭菌离心管中,加入预冷的等体积Tris饱和酚/氯仿异/ 戊醇(体积比为25:24:1),于冰上颠倒混匀15min,期间间歇振荡。
[0028] (6)室温下 12000rpm 离心 10min。
[0029] (7)转移上清液至新的2ml灭菌离心管中,重复步骤(5)、(6),以充分去除蛋白。
[0030] (8)转移上清液至新的1.5ml灭菌离心管中,加入0.6倍异丙醇(300μ1)和1/10倍体 积(50μ1 )NaAc(pH5.2),充分混合混匀后冰上静置17min,使DNA白色沉淀充分析出。
[0031] (9)4°C10000rpm 离心 lOmin。
[0032] (10)弃上清,加入预冷的70%乙醇漂洗2遍,然后用无水乙醇漂洗1遍,室温晾干, 加入100μΙ其中含2μ1 10mg/ml RNase酶的1XTE缓冲液(或双蒸水)过夜溶解。
[0033] (11)在NanoVue Plus微量分光光度计上检测DNA浓度,并统一稀释成50ng/ul工作 液,备用。
[0034] 2.2PCR扩增及检测
[0035] PCR扩增体系为20yL,包括lOXbuffer(含有2.0mmol L-WghU.OyLJ.Smmol L- MNTPs DNA polymerase 0.2yL,10ymol L-1引物各0·8μL,2·0Λ模板DNA (5〇-60ngyL_1),ddH2〇 13.8yL〇
[0036] 所述引物序列为:
[0037] SEQ ID NO.2:C8DBS6BL-F:CGCG ACAGGAAGTTTGC
[0038] SEQ ID N0.3:C8DBS6BL-R:ATTGAAGAGGATTGGAGGG
[0039] 反应程序为:94°C预变性5min; 35个循环(95°C变性30s,60°C退火30s,72°C延伸 lmin); 72°C延伸lOmin;4°C保存。
[0040] PCR产物利用质量比为1.2%的琼脂糖凝胶电泳进行分析检测,GelStain荧光染料 染色,BI0-RAD凝胶成像系统扫描拍照。
[0041] 结果如图1所示,结果发现在红芒春21、遂宁坨坨麦、涪陵须须麦、永川白壳壳麦这 4个穗发芽抗性品种中均扩增出790bp目的片段,而在京411、济麦22、烟农19、中优9507这4 个穗发芽感性品种中均无扩增产物。
[0042] 2.3目的基因的验证
[0043]对穗发芽抗性品种扩增产物进行胶回收,连接于pGEM-T载体中进行克隆测序,测 序结果验证该扩增产物确为TaZFP18基因部分基因序列,即与SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列 一致。通过比对分析发现扩增产物包括452bp编码区序列和338bp 3'非翻译区序列,且该扩 增产物为TaZFP18锌指蛋白的G-patch结构域序列,主要与mRNA特异结合有关,因此,该位置 序列的缺失可能会导致该锌指转录因子与下游调控基因不能正常结合,从而影响下游相关 基因的表达。
[0044] 3、功能标记基因在不同群体中的验证
[0045] 3.1种子萌芽指数(GI)测定
[0046] 于小麦蜡熟期分别收获小麦主茎穗材料,室内风干2天,立即存放于_20°C冰箱以 维持种子的休眠性,待全部试验材料收获完毕,一并进行发芽试验。选取10个成熟期一致的 主茎穗,手工脱粒,每个材料取50粒进行种子发芽试验,2次重复。籽粒腹沟朝下摆放在培养 皿内,培养皿内加9ml无菌水,置于人工气候培养箱(20°C,光照14h,黑暗10h,湿度80% ),24 小时候后开始统计每个培养皿萌发种子数,于每天同一时间统计萌芽数并剔除发芽种子 (以胚部露白为萌芽鉴定标准),3天后计算种子萌芽指数(GI)。
[0047] 种子萌芽指数(GI)计算公式:GI = [(3Xnl+2Xn2+lXn3)/(3XN)]X100%
[0048] 其中nl、n2、n3是种子第1天、第2天、第3天每天所萌芽的籽粒数,N指总粒数。
[0049] 3.2田间整穗发芽率(FS)测定
[0050]小麦收获期间遇到自然降雨天气,于田间保留10个小麦主茎穗进行自然降雨整穗 发芽率测定。收获后置于电热恒温干燥箱中,150°C快速烘干,手工脱粒,统计发芽种子数和 总粒数,计算田间整穗发芽率(fie 1 d sprouting,FS)
[00511田间整穗发芽率(FS)计算公式:FS=( 10穗发芽数+ 10穗总粒数)X 100%
[0052] 3.3功能标记基因在小麦微核心种质资源群体中的验证
[0053]取235份小麦微核心种质资源,利用上述步骤2的方法进行PCR扩增,测定并统计各 种质资源的种子萌芽指数(GI)和田间整穗发芽率(FS),对统计结果做差异显著性分析和相 关性分析,结果如下表1、2所示。
[0054] 3.5功能标记基因在京411/红芒春21的RILs群体家系中的验证
[0055]取京411/红芒春21的RILs群体家系,利用上述步骤2的方法进行PCR扩增,测定并 统计各种质资源的种子萌芽指数(GI)和田间整穗发芽率(FS),对统计结果做差异显著性分 析和相关性分析,结果如下表1、2所示,表中,GI3、GI7、GI 15分别表示收获后第3天、第7天、 第15天测定的种子萌芽指数。
[0056]表1不同基因型间的穗发芽表型差异显著性分析
[0057]
[0059] 注,为P < 0.01,达到极显著水平;*为P < 0.05,达到显著水平;3为标准差 [0060]表2携带790bp的等位变异与不同穗发芽表型的相关性分析
[0061]
[0062] 注,为P<0.01,达到极显著水平;*为P<0.05,达到显著水平 [0063]结果发现,在235份小麦微核心种质资源中,携带790bp基因型的材料具有较高的 穗发芽抗性,而不含该基因型的材料则具有较高的发芽指数和田间整穗发芽率,差异显著 性分析结果表明,两者在2014年GI3、GI7及2015年GI3、FS表型上差异极显著(P<0.01),在 2015年GI 15表型上差异显著(P<0.05)。进一步对不同基因型与不同穗发芽表型进行相关 性分析,结果表明携带790bp的等位变异与2014年GI3、GI7及2015年GI3、FS表型呈极显著负 相关(Ρ<〇.〇1),与2015年GI 15表型呈显著负相关(P<0.05)。
[0064]此外对京411/红芒春21RILs群体家系的差异显著性分析和相关性分析,结果也表 明,不同等位变异对应的穗发芽表型间差异极显著(P<〇.01);携带790bp的等位变异与所 有穗发芽表型都呈极显著负相关(P<〇. 01)。
【主权项】
1. 一种小麦抗穗发芽基因TaZFP18,其特征在于,所述基因包含如SEQIDN0.1所示的 核苷酸序列,或包含与SEQIDNO. 1序列互补的核苷酸序列。2. -种如权利要求1所述的小麦抗穗发芽基因TaZFP18在鉴定小麦穗发芽抗感品种中 的应用。3. -种利用如权利要求1所述的小麦抗穗发芽基因TaZFP18鉴定小麦穗发芽抗感品种 的方法,其特征在于,包括以下步骤: (1) 以小麦基因组DNA为模板,以C8DBS6BL-F和C8DBS6BL-R为特异性引物,进行PCR扩 增,所述C8DBS6BL-F和C8DBS6BL-R的序列为: SEQIDN0.2:C8DBS6BL-F:CGCGACAGGAAGTTTGC SEQIDN0.3:C8DBS6BL-R:ATTGAAGAGGATTGGAGGG (2) 若步骤(l)PCR扩增获得如SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列或其互补序列,则该小麦 为穗发芽抗性品种,若步骤(1)未扩增获得如SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列或其互补序 列,则该小麦为穗发芽感性品种。4. 根据权利要求3所述的一种利用小麦抗穗发芽基因TaZFP18鉴定小麦穗发芽抗感品 种的方法,其特征在于,所述步骤(1)中,以小麦种子的基因组DNA为模板进行PCR扩增。
【专利摘要】本发明公开了一种小麦抗穗发芽基因TaZFP18,所述基因包含如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列,或包含与SEQ?ID?NO.1序列互补的核苷酸序列,该基因编码CCCH型锌指蛋白18,可作为小麦穗发芽抗感品种的分子标记基因。该小麦抗穗发芽基因TaZFP18为一种新的小麦抗穗发芽主效基因,利用其开发分子标记,可以迅速鉴定小麦是否为穗发芽抗性品种,也为小麦穗发芽抗性育种提供了新的基因资源。
【IPC分类】C12N15/29, C12Q1/68
【公开号】CN105483136
【申请号】CN201610005847
【发明人】王升星, 朱玉磊, 张海萍, 常成, 姜昊, 吴曾云, 曹佳佳, 卢杰, 司红起, 马传喜
【申请人】安徽农业大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年1月4日

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