吡咯并氮杂卓酮类化合物及其在制备治疗肿瘤的药物中的应用的制作方法
专利名称：吡咯并氮杂卓酮类化合物及其在制备治疗肿瘤的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类治疗肿瘤的药物，具体涉及一类吡咯并氮杂卓酮类化合物及其在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
背景技术：
癌症是当前危害人类健康和正常生活的最主要的疾病之一。由于癌症发生机制的复杂性和特殊性，因此，寻找高效低毒的抗癌药物是目前的一个研究热点。
Alisin(6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮)类化合物是一类含吡咯环的生物碱，同时也是多种海洋生物活性物质的代谢中间体。对Aldisin的最早报道是在1985年，Schmitz，F.J.等人从关岛海绵Hymeniacidon aldis de Laubenfels中分离得到化合物1a和1b，并分别命名为Aldisin和2-bromoaldisin(Schmita，F.J.，et al.J.Nat.Prod，1985，48，47-53)。之后，多种Aldisin类化合物又相继从多种海绵中分离得到。
为了研究Aldisin类化合物的生物活性，海洋天然产物研究人员对其进行了细胞毒性，抗肿瘤等多种生物活性实验。Inaba，K.等人(Inaba，K.，et al.；J.Nat.Prod.1998，61，693-695)发现化合物3c和3d对两种激酶c-erbB-2和cyclin-dependent kinase 4(CDK4)有一定的抑制作用。Eder，C.等人(Eder，C.，et al.J.Nat.Prod.1999，62，184-187)也对10余种Aldisin类化合物进行了细胞毒性实验，其中2a和2b对MONOMAC-6细胞显示出极大的毒性，其IC50值分别为2.4和0.2μg/ml。Meijer，L.等人(Meijer，L.，et al.Chem.Bio.2000，7，51-63)对2b的激酶抑制活性做了更深入的研究，活性实验结果表明2b对多种CDK都有一定的抑制活性，特别是对CDK1/cyclin B，CDK2/cyclin A，CDK2/cyclin E，CDK5/p25，GSK-3β，CK1等六种激酶显示出很强的抑制活性，其IC50值分别为22，70，40，28，10，35nM，同时hymenialdisine的两种立体构型2b和3b对细胞质致活酶Ref/MEK1/MAPK也有强烈的抑制活性，IC50值分别为6和3nM(Tasdemir，D.，et al.J.Med Chem.2002，45，529-532)。
由于该类化合物都是从海绵中提取的，量少，稳定性较差并且细胞毒性较大，而对于1-取代Aldisin衍生物作为抗癌药物未见有报道，因此，开发这类化合物作为抗肿瘤药物具有重要的应用前景。
本发明是在国家863基金资助下，为设计合成一类新型的具有自主知识产权的抗肿瘤药物所进行的研究。
1aR＝H，Aldisin 2aR1＝R2＝H，( Z)-debromohymenialdisine 1bR＝Br，2-bromoaldisin2bR1＝Br，R2＝H，(Z)-hymenialdisine 2cR1＝R2＝Br，(Z)-3-bromohymenialdisine
3aR1＝R2＝H，(E)-debromohymenialdisine 3bR1＝Br，R2＝H，(E)-hymenialdisine 4aR＝H，(Z)-debromoaxinohydantoin 3cR1＝R2＝Br，(E)-3-bromohymenialdisine4bR＝Br，(Z)-axinohydantoin 3dR1＝H，R2＝Br，Spongiacidin B
发明内容
本发明的一个目的是提供了一类对肿瘤细胞具有抑制作用的，具有式(I)结构的吡咯并氮杂卓酮类化合物及其药用盐。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为 如式(I)表示的吡咯并氮杂卓酮类化合物或其药用盐，
(I) 其中 n代表0或1；R1代表H，C1-C6烷基，或苄基；R2代表OH或O，当R2代表OH时候，O与相应的C单键连接，当R2代表O时候，其与相应的C双键连接；R3代表H，三氟甲基，C1-C6烷基，或OR4，R4代表H，C1-C6烷基。
优选为所述吡咯并氮杂卓酮类化合物或其药用盐选自以下化合物 1-(联苯-4-取代甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 1-(联苯-4-取代甲基)-4-羟基-4，5，6，7-四氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-8(1H)-酮 1-(联苯-4-取代)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 1-((4’-甲基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 1-((4’-羟基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 1-((4’-(三氟甲基)联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 1-((4’-甲氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 1-((4’-乙氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 1-((4’-丙氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 1-((4’-异丙氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 1-((4’-甲氧基联苯-4-取代)甲基)-7-甲基-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 7-苄基-1-((4’-羟基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮。
本发明的另一目的在于提供该类化合物或者其药用盐在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明的化合物能够以可药用盐的形式使用，尤其是酸的加成盐，采用可药用的游离酸来制备，如氢氯酸，硫酸，柠檬酸，酒石酸等。
一种治疗肿瘤的药物组合物，其含有有效量的作为活性成份的上述的吡咯并氮杂卓酮类化合物或者其药用盐和可药用的载体。
本发明的化合物的制备可通过以下基本方法和原则制备，其所用的原料都可从市场上购买，本领域的技术人员可以根据本发明制备到本发明所述的任一种化合物。
步骤一根据化学方程式
以乙腈做溶剂，三乙胺做碱，三氯乙酰吡咯与β-氨基丙酸乙酯盐酸盐在室温下发生偶合反应，生产化合物2；然后化合物2在2N NaOH溶液中室温水解得到化合物3；在加热条件下，化合物3在PPA和P2O5作用下关环得到化合物4. 步骤二根据化学方程式
以乙腈做溶剂，碳酸钾做碱，在回流的条件下，化合物4与4-溴甲基联苯偶合得到化合物5；化合物5在硼氢化钠还原下得到化合物6；而以二氯甲烷做溶剂，醋酸铜做催化剂，化合物4与联苯硼酸在室温条件可以偶联得到化合物7。
步骤三根据化学方程式
化合物8和9在Pd(OAc)2催化下偶联得到化合物10；随后，NBS溴代得到化合物11；在回流条件下，化合物11和4偶联得到化合物12。
步骤四根据化学方程式
化合物4和4-溴苄溴反应得到化合物13；化合物13在氢化钠做碱的条件下与溴代烷或碘代烷反应得到化合物14；化合物14在Pd(PPh3)4催化下与苯硼酸偶联得到化合物15。
本发明所提供的制备方法具有简单，易操作，成本低等优点。
本发明所述的吡咯并氮杂卓酮类化合物及其药用盐对多种肿瘤细胞具有一定的抑制作用，可用于制备治疗肿瘤的药物。为临床治疗肿瘤提供了更多的药物选择。
具体实施例方式 下列实施例进一步解释了本发明的化合物及其中间体的合成方法，但并不限制本发明的范围。
一、仪器与药品 NMR由美国VARIAN公司生产的Mercury-Plus 300M仪器测定，溶剂峰做内标；质谱由DSQ台式质谱仪(EI源)和日本岛津公司生产的LCMS-2010A(ESI源)测定；化学试剂购自广州东征，粤申化学品公司，Alfar-Aser公司，百灵威化学，阿拉丁化学试剂公司；柱层析用硅胶购自青岛海洋化工厂。
实施例一6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮的合成(化合物4) 在含有8.5g(40mmol)化合物1的100mL无水乙腈溶液中，加入7.38gβ-丙氨酸甲酯盐酸盐(48mmol)和7.2mL(52mmol)三乙胺。混合溶液在室温下搅拌12小时左右，至原料转化完全，停止搅拌，减压转旋蒸发除掉溶剂，再用乙酸乙酯溶解，用水，1N HCl溶液，饱和食盐水分别洗涤，有机相用无水Na2SO4干燥，抽滤除去Na2SO4，减压旋蒸除去溶剂，得化合物2(7.70g，产率92％)。
往化合物2(7.7g，36.7mmol)中加入37mL 2N的NaOH溶液(约73.4mmol)，混合液在室温下搅拌15小时，至反应物转化完全，冰浴下用6N的HCl溶液(约8mL)将混合液调至pH＝3，析出大量灰白色固体，抽滤，洗涤，滤饼真空40℃下烘干，称量，得化合物3(6.28g，产率94％)。
9.80g P2O5与103.2g PPA在120℃条件下搅拌50分钟左右，至溶液澄清。将温度降至105℃，加入化合物3(6.28g，34.6mmol)，搅拌1个小时左右，把混合液倾倒进碎冰中(约200mL)，搅拌1个小时，抽滤，固体烘干，得2.319g褐色固体。滤液用用乙酸乙酯萃取，合并有机层用饱和食盐水洗涤两次，用无水Na2SO4干燥，抽滤除去Na2SO4，减压旋蒸除去乙酸乙酯，得淡黄色固体1.243g。合并固体得化合物4(3.56g，产率65％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ12.14(br s，1H)，8.31(m，1H)，6.96(m，1H)，6.52(m，1H)，3.34(m，2H)，2.68(m，2H)；EI-MSm/z＝164[M]+. 实施例二1-(联苯-4-取代甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮(化合物5) 将化合物4(1mmol，164mg)溶于20ml无水乙腈中，在向其中加入4-溴甲基联苯(1.5mmol，369mg)和无水碳酸钾(2mmol，276mg)。回流反应12h至原料点消失。减压蒸发溶剂，加入乙酸乙酯和水，分出有机相，水层用乙酸乙酯抽提2次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤。干燥，浓缩，粗产品柱层析(二氯甲烷∶乙酸乙酯＝1∶1)，得化合物5(317mg，产率96％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.53-7.57(m，4H)，7.34-7.45(m，3H)，7.22(d，J＝8.1Hz，2H)，6.96(t，J＝5.4Hz，1H)，6.90(d，J＝3.0Hz，1H)，6.79(d，J＝2.7Hz，1H)，5.67(s，2H)，3.50(q，J＝5.7Hz，2H)，2.83(t，J＝5.4Hz，2H). EI-MSm/z＝330[M]+. 实施例三1-(联苯-4-取代甲基)-4-羟基-4，5，6，7-四氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-8(1H)-酮(化合物6) 将化合物5(165mg，0.5mmol)溶于5ml甲醇，向其中加入NaBH4(38mg，1.0mmol)。反应液室温搅拌至原料点消失。减压蒸发溶剂，加入二氯甲烷和水，分出有机相，用饱和食盐水洗涤。干燥，浓缩，粗产品柱层析(氯仿∶甲醇＝30∶1)，得化合物6(110mg，产率66％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.50-7.56(m，4H)，7.39-7.44(m，2H)，7.30-7.35(m，1H)，7.18(d，J＝8.4Hz，2H)，6.90(d，J＝2.7Hz，1H)，6.32(d，J＝2.7Hz，1H)，6.01-6.04(m，1H)，5.64(q，J＝15.3Hz，2H)，5.02(t，J＝5.1Hz，1H)，3.38-3.49(m，1H)，3.16-3.22(m，1H)，2.12-2.22(m，2H).EI-MSm/z＝332[M]+. 实施例四1-(联苯-4-取代)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮(化合物7) 在带有CaCl2干燥管的100mL圆底烧瓶中依次加入化合物4(1mmol)、联苯硼酸(2.0mmol)、一水乙酸铜(1.5mmol)，50mL无水二氯甲烷和吡啶(2mmol)，在室温下搅拌5小时。停止反应，减压蒸出二氯甲烷，剩余物中加入水和乙酸乙酯，过滤除去不溶物，水相用乙酸乙酯萃取2次，合并有机相。用饱和食盐水洗涤有机相2～3次，无水Na2SO4干燥，抽滤，浓缩，粗产品柱层析(二氯甲烷∶乙酸乙酯＝3∶1)，得到白色固体化合物7(268mg，产率85％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.66～7.36(m，9H)，7.01(d，J＝2.7Hz，1H)，6.87(d，J＝2.7Hz，1H)，6.76(d，J＝5.4Hz，1H)，3.60(q，J＝5.7Hz，2H)，2.84(t，J＝5.1Hz，2H)；EI-MSm/z＝316[M]+. 实施例五1-((4’-甲基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 在10ml微波反应管中加入化合物14(0.4mmol)，4-甲基苯硼酸(0.3mmol)，2N Na2CO3(0.4ml)，甲苯(2ml)，和乙醇(0.5ml)，然后在氮气保护下加入Pd(PPh3)4(5％mol)。加入搅拌磁子后盖上密封盖，置于单模微波反应器内。130℃下反应30分钟，停止反应，冷却至室温，倒入水中，乙酸乙酯萃取，有机相用食盐水洗，干燥，浓缩，粗产品柱层析分离(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)得白色固体70mg，产率51％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.43-7.56(m，5H)，7.19-7.25(m，3H)，6.91(d，J＝2.7Hz，1H)，6.79(d，J＝2.7Hz，1H)，6.60(m，1H)，5.56(s，2H)，3.52-3.53(m，2H)，2.83-2.86(m，2H)，2.40(s，3H)；EI-MSm/z＝344[M]+. 实施例六1-((4’-羟基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 合成方法与实施例五相同，不同之处在于用4-羟基苯硼酸代替4-甲基苯硼酸。提纯后得58mg白色固体，产率42％。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.35(t，J＝6.0Hz，1H)，7.41-7.50(m，4H)，7.22(d，J＝2.7Hz，1H)，7.15(d，J＝8.4Hz，2H)，6.79(d，J＝8.7Hz，2H)，6.54(d，J＝2.7Hz，1H)，5.62(s，2H)，3.28(q，J＝5.7Hz，2H)，2.64-2.67(m，2H)；EI-MSm/z＝346[M]+. 实施例七1-((4’-(三氟甲基)联苯基-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 将4-溴甲苯(1mmol)，4-三氟甲基苯硼酸(1.5mmol)溶于水和丙酮的混合液6.5ml(3.5/3，v/v)，然后向其中加入碳酸钠(2mmol)和Pd(OAc)2(0.5mol％)。溶液室温搅拌4h，加水和乙酸乙酯，抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，合并有机相，盐水洗，干燥，浓缩，柱层析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10)，得4-甲基-4’-(三氟甲基)联苯168mg，产率71％。
在10ml微波反应管中加入4-甲基-4’-(三氟甲基)联苯(0.6mmol)，NBS(0.63mmol)，BPO(0.06mmol)和CCl4(2ml)，加入搅拌磁子后盖上密封盖，置于单模微波反应器内。80℃下反应20分钟，停止反应，冷却至室温，反应液抽滤，滤液浓缩，得4-(溴甲基)-4’-(三氟甲基)联苯，不需纯化，直接投入下步反应。
在一50ml的圆底烧瓶中加入化合物4(0.5mmol)，K2CO3(1.0mmol)，上步粗产物和10ml无水乙腈，加热回流10h，停止反应，浓缩。向剩余物中加入水和乙酸乙酯，水相用乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，干燥完后蒸去溶剂，粗产品柱层析分离(二氯甲烷∶乙酸乙酯＝1∶1)，得白色固体(103mg，产率52％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.63-7.70(m，4H)，7.52-7.56(m，2H)，7.25(d，J＝8.1Hz，2H)，6.91(d，J＝3.0Hz，1H)，6.80(d，J＝3.0Hz，1H)，6.45(t，J＝5.7Hz，1H)，5.68(s，2H)，3.53(q，J＝5.7Hz，2H)，2.83-2.87(m，2H)；EI-MSm/z＝398[M]+. 实施例八1-((4’-甲氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 合成方法与实施例七相同，不同之处在于用4-甲氧基溴苯代替四溴甲苯，4-甲基苯硼酸代替4-三氟甲基苯硼酸。提纯后得104mg白色固体，产率58％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.48-7.50(m，4H)，7.20(d，J＝8.1Hz，2H)，6.96(d，J＝8.7Hz，2H)，6.89(d，J＝3.0Hz，1H)，6.78(d，J＝2.7Hz，1H)，6.50-6.54(m，1H)，5.65(s，2H)，3.85(s，3H)，3.53(q，J＝6.0Hz，2H)，2.82-2.86(m，2H)；EI-MSm/z＝360[M]+. 实施例九1-((4’-乙氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 合成方法与实施例七相同，不同之处在于用4-乙氧基溴苯代替四溴甲苯，4-甲基苯硼酸代替4-三氟甲基苯硼酸。提纯后得112mg白色固体，产率60％。
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ(ppm).7.46-7.51(m，4H)，7.20(d，J＝8.4Hz，2H)，6.94(d，J＝8.4Hz，2H)，6.90(d，J＝2.8Hz，1H)，6.78(d，J＝2.8Hz，1H)，6.19(brs，1H)，5.65(s，2H)，4.07(q，J＝7.2Hz，2H)，3.50-3.54(m，2H)，2.82-2.85(m，2H)，1.43(t，J＝7.2Hz，3H)；MS-EIm/z＝374[M]+. 实施例十1-((4’-丙氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 合成方法与实施例七相同，不同之处在于用4-丙氧基溴苯代替四溴甲苯，4-甲基苯硼酸代替4-三氟甲基苯硼酸。提纯后得103mg白色固体，产率53％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.46-7.51(m，4H)，7.17(d，J＝8.1Hz，2H)，6.95(d，J＝9.0Hz，2H)，6.89(d，J＝3.0Hz，1H)，6.78(d，J＝3.0Hz，1H)，6.47(t，J＝6.0Hz，1H)，5.65(s，2H)，3.96(t，J＝6.6Hz，2H)，3.52(q，J＝6.0Hz，2H)，2.82-2.86(m，2H)，1.78-1.90(m，2H)，1.07(t，J＝7.5Hz，3H)；EI-MSm/z＝388[M]+. 实施例十一1-((4’-异丙氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 合成方法与实施例七相同，不同之处在于用4-异丙氧基溴苯代替四溴甲苯，4-甲基苯硼酸代替4-三氟甲基苯硼酸。提纯后得109mg白色固体，产率56％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.45-7.51(m，4H)，7.19(d，J＝8.1Hz，2H)，6.94(d，J＝8.7Hz，2H)，6.89(d，J＝3.0Hz，1H)，6.77(d，J＝3.0Hz，1H)，6.48(t，J＝6.0Hz，1H)，5.65(s，2H)，4.55-4.63(m，1H)，3.52(q，J＝5.7Hz，2H)，2.82-2.86(m，2H)，1.37(d，J＝6.0Hz，6H)；EI-MSm/z＝388[M]+. 实施例十二1-((4’-甲氧基联苯-4-取代)甲基)-7-甲基-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 将1-((4’-甲氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮(0.2mmol)溶于1ml干燥的DMF中，冷却下加入NaH(0.22mol)，在此温度下搅拌30min，然后加入碘甲烷(0.3mmol)，升到室温搅拌过夜。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取，有机相干燥，浓缩，粗产品柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)得白色固体45mg，产率60％。
1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.50(dd，J＝6.6Hz，2.1Hz，4H)，7.20(d，J＝8.1Hz，2H)，6.96(dd，J＝6.6Hz，2.1Hz，2H)，6.84(d，J＝3.0Hz，1H)，6.68(d，J＝3.0Hz，1H)，5.61(s，2H)，3.86(s，3H)，3.69-3.73(m，2H)，3.20(s，3H)，2.80-2.84(m，2H)；MS-EIm/z＝374[M]+. 实施例十三7-苄基-1-((4’-羟基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 将1-(4-溴苄基-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮(0.5mmol)溶于4ml干燥的DMF中，冷却下加入NaH(0.6mol)，在此温度下搅拌30min，然后加入溴苄(0.75mmol)，升到室温搅拌过夜。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取，有机相干燥，浓缩，粗产品柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)得白色固体102mg，产率54％。
在10ml微波反应管中加入上步产品(0.2mmol)，4-羟基苯硼酸(0.3mmol)，2N Na2CO3(0.2ml)，甲苯(2ml)，和乙醇(0.5ml)，然后在氮气保护下加入Pd(PPh3)4(5％mol)。加入搅拌磁子后盖上密封盖，置于单模微波反应器内。130℃下反应30分钟，停止反应，冷却至室温，倒入水中，乙酸乙酯萃取，有机相用食盐水洗，干燥，浓缩，粗产品柱层析分离(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)得白色固体39mg，产率45％。
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.44-7.50(m，4H)，7.18-7.22(m，5H)，7.08-7.10(m，3H)，6.89-6.93(m，3H)，6.70(d，J＝2.8Hz，1H)，5.66(s，2H)，4.76(s，2H)，3.56(t，J＝4.8Hz，2H)，2.66-2.69(m，2H)；MS-EIm/z＝436[M]+. 实施例十四对人体结肠癌细胞，乳腺癌细胞和人胚胎成纤维细胞的抑制活性实验 实验方法72h MTT法(现有技术中检测细胞存活和生长的常用方法，属于已知技术) 测定了本发明的部分式(I)结构中的吡咯并氮杂卓酮类化合物对人体结肠癌细胞，乳腺癌细胞和人胚胎成纤维细胞的抑制活性。IC50值为抑制率达到50％时的抑制剂浓度。结果如下表
其中HCT-116表示人体结肠癌细胞，MCF-7表示人体乳腺癌细胞，MRC-5表示人胚胎成纤维细胞，N表示没有测试。
实施例十五对部分细胞系的抑制活性实验 方法72h MTT法 抑制剂抑制剂与实施例十四表格中抑制剂编号对应的结构相同
其中MDA-MB-435代表人乳腺癌高转移细胞，CNE-1代表人鼻咽癌细胞(高分化)，CNE-2代表人鼻咽癌细胞(低分化)，Hep3B代表人肝癌细胞，HepG2代表人肝癌细胞，BT549代表人乳腺管癌细胞，HeLa代表人宫颈癌细胞，LN19和LN444都代表神经胶质瘤细胞。
实施例十六对小鼠肝癌H22移植瘤的生长抑制作用 动物KM中小鼠 药物实施例十四的表格中编号2和7两化合物。吐温80助溶，蒸馏水配制成所需浓度2.5mg/ml，5mg/m，10mg/ml，每20g小鼠分别灌胃0.4ml。阳性对照药环磷酰胺(CTX)，临用前用生理盐水配制成10mg/ml，每20g小鼠腹腔注射0.2ml。
实验步骤用生理盐水按1∶2稀释H22腹水，每只小鼠腋下接种0.2ml腹水悬液。第二天称重，随机分组后给药，实验共设8组，除阴性对照组9只动物外，其余各组每组均为8只。实验设阴性对照组，阳性对照组(CTX 100mg/kg)，腹腔注射一次)，化合物250mg/kg，100mg/kg，200mg/kg剂量组，化合物750mg/kg，100mg/kg，200mg/kg剂量组，均为灌胃给药，共给药9天。实验11天称重后处死动物，并剥取肿瘤，拍照，称瘤重。
试验结果化合物2在100mg/kg剂量组对小鼠移植瘤H22生长有一定的抑制作用，化合物7抑制作用不明显，具体数据见下表。
上述活性数据表明，本发明的化合物对多种肿瘤细胞都具有一定的抑制作用，因此，该类化合物具有制备治疗肿瘤药物的应用前景。
权利要求
1.下述式(I)表示的吡咯并氮杂卓酮类化合物或者其药用盐
其中n代表0或1；R1代表H，C1-C6烷基，或苄基；R2代表OH或O；R3代表H，三氟甲基，C1-C6烷基，或OR4，R4代表H，C1-C6烷基。
2.根据权利要求1所述的吡咯并氮杂卓酮类化合物或者其药用盐，其特征在于所述的吡咯并氮杂卓酮类化合物或者其药用盐选自以下化合物
1-(联苯-4-取代甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮、
1-(联苯-4-取代甲基)-4-羟基-4，5，6，7-四氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-8(1H)-酮、
1-(联苯-4-取代)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮、
1-((4’-甲基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮、
1-((4’-羟基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮、
1-((4’-(三氟甲基)联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮、
1-((4’-甲氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮、
1-((4’-乙氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮、
1-((4’-丙氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮、
1-((4’-异丙氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮、
1-((4’-甲氧基联苯-4-取代)甲基)-7-甲基-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮、
7-苄基-1-((4’-羟基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮。
3.权利要求1所述的吡咯并氮杂卓酮类化合物或者其药用盐在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
4.一种治疗肿瘤的药物组合物，其含有有效量的作为活性成份的权利要求1所述的吡咯并氮杂卓酮类化合物或者其药用盐和药用载体。
全文摘要
本发明公开了一种吡咯并氮杂卓酮类化合物及其在制备治疗肿瘤的药物中的应用，旨在提供一类对肿瘤细胞具有抑制作用的，具有式(I)结构的吡咯并氮杂卓酮类化合物及其药用盐。它具有式(I)表示的化合物其中n代表0或1；R1代表H，C1-C6烷基，或苄基；R2代表OH或O；R3代表H，三氟甲基，C1-C6烷基，或OR4，R4代表H，C1-C6烷基。
文档编号A61P35/00GK101759699SQ200910261419
公开日2010年6月30日 申请日期2009年12月11日 优先权日2009年11月2日
发明者万一千, 谢建伟, 朱新海, 王淑东, 袁洁, 陈晓光, 苏丽, 孟飞, 汪晨霞, 黄漫娜 申请人:中山大学
技术领域：
本发明涉及一类治疗肿瘤的药物，具体涉及一类吡咯并氮杂卓酮类化合物及其在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
背景技术：
癌症是当前危害人类健康和正常生活的最主要的疾病之一。由于癌症发生机制的复杂性和特殊性，因此，寻找高效低毒的抗癌药物是目前的一个研究热点。
Alisin(6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮)类化合物是一类含吡咯环的生物碱，同时也是多种海洋生物活性物质的代谢中间体。对Aldisin的最早报道是在1985年，Schmitz，F.J.等人从关岛海绵Hymeniacidon aldis de Laubenfels中分离得到化合物1a和1b，并分别命名为Aldisin和2-bromoaldisin(Schmita，F.J.，et al.J.Nat.Prod，1985，48，47-53)。之后，多种Aldisin类化合物又相继从多种海绵中分离得到。
为了研究Aldisin类化合物的生物活性，海洋天然产物研究人员对其进行了细胞毒性，抗肿瘤等多种生物活性实验。Inaba，K.等人(Inaba，K.，et al.；J.Nat.Prod.1998，61，693-695)发现化合物3c和3d对两种激酶c-erbB-2和cyclin-dependent kinase 4(CDK4)有一定的抑制作用。Eder，C.等人(Eder，C.，et al.J.Nat.Prod.1999，62，184-187)也对10余种Aldisin类化合物进行了细胞毒性实验，其中2a和2b对MONOMAC-6细胞显示出极大的毒性，其IC50值分别为2.4和0.2μg/ml。Meijer，L.等人(Meijer，L.，et al.Chem.Bio.2000，7，51-63)对2b的激酶抑制活性做了更深入的研究，活性实验结果表明2b对多种CDK都有一定的抑制活性，特别是对CDK1/cyclin B，CDK2/cyclin A，CDK2/cyclin E，CDK5/p25，GSK-3β，CK1等六种激酶显示出很强的抑制活性，其IC50值分别为22，70，40，28，10，35nM，同时hymenialdisine的两种立体构型2b和3b对细胞质致活酶Ref/MEK1/MAPK也有强烈的抑制活性，IC50值分别为6和3nM(Tasdemir，D.，et al.J.Med Chem.2002，45，529-532)。
由于该类化合物都是从海绵中提取的，量少，稳定性较差并且细胞毒性较大，而对于1-取代Aldisin衍生物作为抗癌药物未见有报道，因此，开发这类化合物作为抗肿瘤药物具有重要的应用前景。
本发明是在国家863基金资助下，为设计合成一类新型的具有自主知识产权的抗肿瘤药物所进行的研究。
1aR＝H，Aldisin 2aR1＝R2＝H，( Z)-debromohymenialdisine 1bR＝Br，2-bromoaldisin2bR1＝Br，R2＝H，(Z)-hymenialdisine 2cR1＝R2＝Br，(Z)-3-bromohymenialdisine
3aR1＝R2＝H，(E)-debromohymenialdisine 3bR1＝Br，R2＝H，(E)-hymenialdisine 4aR＝H，(Z)-debromoaxinohydantoin 3cR1＝R2＝Br，(E)-3-bromohymenialdisine4bR＝Br，(Z)-axinohydantoin 3dR1＝H，R2＝Br，Spongiacidin B
发明内容
本发明的一个目的是提供了一类对肿瘤细胞具有抑制作用的，具有式(I)结构的吡咯并氮杂卓酮类化合物及其药用盐。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为 如式(I)表示的吡咯并氮杂卓酮类化合物或其药用盐，
(I) 其中 n代表0或1；R1代表H，C1-C6烷基，或苄基；R2代表OH或O，当R2代表OH时候，O与相应的C单键连接，当R2代表O时候，其与相应的C双键连接；R3代表H，三氟甲基，C1-C6烷基，或OR4，R4代表H，C1-C6烷基。
优选为所述吡咯并氮杂卓酮类化合物或其药用盐选自以下化合物 1-(联苯-4-取代甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 1-(联苯-4-取代甲基)-4-羟基-4，5，6，7-四氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-8(1H)-酮 1-(联苯-4-取代)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 1-((4’-甲基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 1-((4’-羟基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 1-((4’-(三氟甲基)联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 1-((4’-甲氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 1-((4’-乙氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 1-((4’-丙氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 1-((4’-异丙氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 1-((4’-甲氧基联苯-4-取代)甲基)-7-甲基-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 7-苄基-1-((4’-羟基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮。
本发明的另一目的在于提供该类化合物或者其药用盐在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明的化合物能够以可药用盐的形式使用，尤其是酸的加成盐，采用可药用的游离酸来制备，如氢氯酸，硫酸，柠檬酸，酒石酸等。
一种治疗肿瘤的药物组合物，其含有有效量的作为活性成份的上述的吡咯并氮杂卓酮类化合物或者其药用盐和可药用的载体。
本发明的化合物的制备可通过以下基本方法和原则制备，其所用的原料都可从市场上购买，本领域的技术人员可以根据本发明制备到本发明所述的任一种化合物。
步骤一根据化学方程式
以乙腈做溶剂，三乙胺做碱，三氯乙酰吡咯与β-氨基丙酸乙酯盐酸盐在室温下发生偶合反应，生产化合物2；然后化合物2在2N NaOH溶液中室温水解得到化合物3；在加热条件下，化合物3在PPA和P2O5作用下关环得到化合物4. 步骤二根据化学方程式
以乙腈做溶剂，碳酸钾做碱，在回流的条件下，化合物4与4-溴甲基联苯偶合得到化合物5；化合物5在硼氢化钠还原下得到化合物6；而以二氯甲烷做溶剂，醋酸铜做催化剂，化合物4与联苯硼酸在室温条件可以偶联得到化合物7。
步骤三根据化学方程式
化合物8和9在Pd(OAc)2催化下偶联得到化合物10；随后，NBS溴代得到化合物11；在回流条件下，化合物11和4偶联得到化合物12。
步骤四根据化学方程式
化合物4和4-溴苄溴反应得到化合物13；化合物13在氢化钠做碱的条件下与溴代烷或碘代烷反应得到化合物14；化合物14在Pd(PPh3)4催化下与苯硼酸偶联得到化合物15。
本发明所提供的制备方法具有简单，易操作，成本低等优点。
本发明所述的吡咯并氮杂卓酮类化合物及其药用盐对多种肿瘤细胞具有一定的抑制作用，可用于制备治疗肿瘤的药物。为临床治疗肿瘤提供了更多的药物选择。
具体实施例方式 下列实施例进一步解释了本发明的化合物及其中间体的合成方法，但并不限制本发明的范围。
一、仪器与药品 NMR由美国VARIAN公司生产的Mercury-Plus 300M仪器测定，溶剂峰做内标；质谱由DSQ台式质谱仪(EI源)和日本岛津公司生产的LCMS-2010A(ESI源)测定；化学试剂购自广州东征，粤申化学品公司，Alfar-Aser公司，百灵威化学，阿拉丁化学试剂公司；柱层析用硅胶购自青岛海洋化工厂。
实施例一6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮的合成(化合物4) 在含有8.5g(40mmol)化合物1的100mL无水乙腈溶液中，加入7.38gβ-丙氨酸甲酯盐酸盐(48mmol)和7.2mL(52mmol)三乙胺。混合溶液在室温下搅拌12小时左右，至原料转化完全，停止搅拌，减压转旋蒸发除掉溶剂，再用乙酸乙酯溶解，用水，1N HCl溶液，饱和食盐水分别洗涤，有机相用无水Na2SO4干燥，抽滤除去Na2SO4，减压旋蒸除去溶剂，得化合物2(7.70g，产率92％)。
往化合物2(7.7g，36.7mmol)中加入37mL 2N的NaOH溶液(约73.4mmol)，混合液在室温下搅拌15小时，至反应物转化完全，冰浴下用6N的HCl溶液(约8mL)将混合液调至pH＝3，析出大量灰白色固体，抽滤，洗涤，滤饼真空40℃下烘干，称量，得化合物3(6.28g，产率94％)。
9.80g P2O5与103.2g PPA在120℃条件下搅拌50分钟左右，至溶液澄清。将温度降至105℃，加入化合物3(6.28g，34.6mmol)，搅拌1个小时左右，把混合液倾倒进碎冰中(约200mL)，搅拌1个小时，抽滤，固体烘干，得2.319g褐色固体。滤液用用乙酸乙酯萃取，合并有机层用饱和食盐水洗涤两次，用无水Na2SO4干燥，抽滤除去Na2SO4，减压旋蒸除去乙酸乙酯，得淡黄色固体1.243g。合并固体得化合物4(3.56g，产率65％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ12.14(br s，1H)，8.31(m，1H)，6.96(m，1H)，6.52(m，1H)，3.34(m，2H)，2.68(m，2H)；EI-MSm/z＝164[M]+. 实施例二1-(联苯-4-取代甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮(化合物5) 将化合物4(1mmol，164mg)溶于20ml无水乙腈中，在向其中加入4-溴甲基联苯(1.5mmol，369mg)和无水碳酸钾(2mmol，276mg)。回流反应12h至原料点消失。减压蒸发溶剂，加入乙酸乙酯和水，分出有机相，水层用乙酸乙酯抽提2次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤。干燥，浓缩，粗产品柱层析(二氯甲烷∶乙酸乙酯＝1∶1)，得化合物5(317mg，产率96％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.53-7.57(m，4H)，7.34-7.45(m，3H)，7.22(d，J＝8.1Hz，2H)，6.96(t，J＝5.4Hz，1H)，6.90(d，J＝3.0Hz，1H)，6.79(d，J＝2.7Hz，1H)，5.67(s，2H)，3.50(q，J＝5.7Hz，2H)，2.83(t，J＝5.4Hz，2H). EI-MSm/z＝330[M]+. 实施例三1-(联苯-4-取代甲基)-4-羟基-4，5，6，7-四氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-8(1H)-酮(化合物6) 将化合物5(165mg，0.5mmol)溶于5ml甲醇，向其中加入NaBH4(38mg，1.0mmol)。反应液室温搅拌至原料点消失。减压蒸发溶剂，加入二氯甲烷和水，分出有机相，用饱和食盐水洗涤。干燥，浓缩，粗产品柱层析(氯仿∶甲醇＝30∶1)，得化合物6(110mg，产率66％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.50-7.56(m，4H)，7.39-7.44(m，2H)，7.30-7.35(m，1H)，7.18(d，J＝8.4Hz，2H)，6.90(d，J＝2.7Hz，1H)，6.32(d，J＝2.7Hz，1H)，6.01-6.04(m，1H)，5.64(q，J＝15.3Hz，2H)，5.02(t，J＝5.1Hz，1H)，3.38-3.49(m，1H)，3.16-3.22(m，1H)，2.12-2.22(m，2H).EI-MSm/z＝332[M]+. 实施例四1-(联苯-4-取代)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮(化合物7) 在带有CaCl2干燥管的100mL圆底烧瓶中依次加入化合物4(1mmol)、联苯硼酸(2.0mmol)、一水乙酸铜(1.5mmol)，50mL无水二氯甲烷和吡啶(2mmol)，在室温下搅拌5小时。停止反应，减压蒸出二氯甲烷，剩余物中加入水和乙酸乙酯，过滤除去不溶物，水相用乙酸乙酯萃取2次，合并有机相。用饱和食盐水洗涤有机相2～3次，无水Na2SO4干燥，抽滤，浓缩，粗产品柱层析(二氯甲烷∶乙酸乙酯＝3∶1)，得到白色固体化合物7(268mg，产率85％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.66～7.36(m，9H)，7.01(d，J＝2.7Hz，1H)，6.87(d，J＝2.7Hz，1H)，6.76(d，J＝5.4Hz，1H)，3.60(q，J＝5.7Hz，2H)，2.84(t，J＝5.1Hz，2H)；EI-MSm/z＝316[M]+. 实施例五1-((4’-甲基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 在10ml微波反应管中加入化合物14(0.4mmol)，4-甲基苯硼酸(0.3mmol)，2N Na2CO3(0.4ml)，甲苯(2ml)，和乙醇(0.5ml)，然后在氮气保护下加入Pd(PPh3)4(5％mol)。加入搅拌磁子后盖上密封盖，置于单模微波反应器内。130℃下反应30分钟，停止反应，冷却至室温，倒入水中，乙酸乙酯萃取，有机相用食盐水洗，干燥，浓缩，粗产品柱层析分离(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)得白色固体70mg，产率51％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.43-7.56(m，5H)，7.19-7.25(m，3H)，6.91(d，J＝2.7Hz，1H)，6.79(d，J＝2.7Hz，1H)，6.60(m，1H)，5.56(s，2H)，3.52-3.53(m，2H)，2.83-2.86(m，2H)，2.40(s，3H)；EI-MSm/z＝344[M]+. 实施例六1-((4’-羟基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 合成方法与实施例五相同，不同之处在于用4-羟基苯硼酸代替4-甲基苯硼酸。提纯后得58mg白色固体，产率42％。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.35(t，J＝6.0Hz，1H)，7.41-7.50(m，4H)，7.22(d，J＝2.7Hz，1H)，7.15(d，J＝8.4Hz，2H)，6.79(d，J＝8.7Hz，2H)，6.54(d，J＝2.7Hz，1H)，5.62(s，2H)，3.28(q，J＝5.7Hz，2H)，2.64-2.67(m，2H)；EI-MSm/z＝346[M]+. 实施例七1-((4’-(三氟甲基)联苯基-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 将4-溴甲苯(1mmol)，4-三氟甲基苯硼酸(1.5mmol)溶于水和丙酮的混合液6.5ml(3.5/3，v/v)，然后向其中加入碳酸钠(2mmol)和Pd(OAc)2(0.5mol％)。溶液室温搅拌4h，加水和乙酸乙酯，抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，合并有机相，盐水洗，干燥，浓缩，柱层析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10)，得4-甲基-4’-(三氟甲基)联苯168mg，产率71％。
在10ml微波反应管中加入4-甲基-4’-(三氟甲基)联苯(0.6mmol)，NBS(0.63mmol)，BPO(0.06mmol)和CCl4(2ml)，加入搅拌磁子后盖上密封盖，置于单模微波反应器内。80℃下反应20分钟，停止反应，冷却至室温，反应液抽滤，滤液浓缩，得4-(溴甲基)-4’-(三氟甲基)联苯，不需纯化，直接投入下步反应。
在一50ml的圆底烧瓶中加入化合物4(0.5mmol)，K2CO3(1.0mmol)，上步粗产物和10ml无水乙腈，加热回流10h，停止反应，浓缩。向剩余物中加入水和乙酸乙酯，水相用乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，干燥完后蒸去溶剂，粗产品柱层析分离(二氯甲烷∶乙酸乙酯＝1∶1)，得白色固体(103mg，产率52％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.63-7.70(m，4H)，7.52-7.56(m，2H)，7.25(d，J＝8.1Hz，2H)，6.91(d，J＝3.0Hz，1H)，6.80(d，J＝3.0Hz，1H)，6.45(t，J＝5.7Hz，1H)，5.68(s，2H)，3.53(q，J＝5.7Hz，2H)，2.83-2.87(m，2H)；EI-MSm/z＝398[M]+. 实施例八1-((4’-甲氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 合成方法与实施例七相同，不同之处在于用4-甲氧基溴苯代替四溴甲苯，4-甲基苯硼酸代替4-三氟甲基苯硼酸。提纯后得104mg白色固体，产率58％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.48-7.50(m，4H)，7.20(d，J＝8.1Hz，2H)，6.96(d，J＝8.7Hz，2H)，6.89(d，J＝3.0Hz，1H)，6.78(d，J＝2.7Hz，1H)，6.50-6.54(m，1H)，5.65(s，2H)，3.85(s，3H)，3.53(q，J＝6.0Hz，2H)，2.82-2.86(m，2H)；EI-MSm/z＝360[M]+. 实施例九1-((4’-乙氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 合成方法与实施例七相同，不同之处在于用4-乙氧基溴苯代替四溴甲苯，4-甲基苯硼酸代替4-三氟甲基苯硼酸。提纯后得112mg白色固体，产率60％。
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ(ppm).7.46-7.51(m，4H)，7.20(d，J＝8.4Hz，2H)，6.94(d，J＝8.4Hz，2H)，6.90(d，J＝2.8Hz，1H)，6.78(d，J＝2.8Hz，1H)，6.19(brs，1H)，5.65(s，2H)，4.07(q，J＝7.2Hz，2H)，3.50-3.54(m，2H)，2.82-2.85(m，2H)，1.43(t，J＝7.2Hz，3H)；MS-EIm/z＝374[M]+. 实施例十1-((4’-丙氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 合成方法与实施例七相同，不同之处在于用4-丙氧基溴苯代替四溴甲苯，4-甲基苯硼酸代替4-三氟甲基苯硼酸。提纯后得103mg白色固体，产率53％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.46-7.51(m，4H)，7.17(d，J＝8.1Hz，2H)，6.95(d，J＝9.0Hz，2H)，6.89(d，J＝3.0Hz，1H)，6.78(d，J＝3.0Hz，1H)，6.47(t，J＝6.0Hz，1H)，5.65(s，2H)，3.96(t，J＝6.6Hz，2H)，3.52(q，J＝6.0Hz，2H)，2.82-2.86(m，2H)，1.78-1.90(m，2H)，1.07(t，J＝7.5Hz，3H)；EI-MSm/z＝388[M]+. 实施例十一1-((4’-异丙氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 合成方法与实施例七相同，不同之处在于用4-异丙氧基溴苯代替四溴甲苯，4-甲基苯硼酸代替4-三氟甲基苯硼酸。提纯后得109mg白色固体，产率56％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.45-7.51(m，4H)，7.19(d，J＝8.1Hz，2H)，6.94(d，J＝8.7Hz，2H)，6.89(d，J＝3.0Hz，1H)，6.77(d，J＝3.0Hz，1H)，6.48(t，J＝6.0Hz，1H)，5.65(s，2H)，4.55-4.63(m，1H)，3.52(q，J＝5.7Hz，2H)，2.82-2.86(m，2H)，1.37(d，J＝6.0Hz，6H)；EI-MSm/z＝388[M]+. 实施例十二1-((4’-甲氧基联苯-4-取代)甲基)-7-甲基-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 将1-((4’-甲氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮(0.2mmol)溶于1ml干燥的DMF中，冷却下加入NaH(0.22mol)，在此温度下搅拌30min，然后加入碘甲烷(0.3mmol)，升到室温搅拌过夜。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取，有机相干燥，浓缩，粗产品柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)得白色固体45mg，产率60％。
1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.50(dd，J＝6.6Hz，2.1Hz，4H)，7.20(d，J＝8.1Hz，2H)，6.96(dd，J＝6.6Hz，2.1Hz，2H)，6.84(d，J＝3.0Hz，1H)，6.68(d，J＝3.0Hz，1H)，5.61(s，2H)，3.86(s，3H)，3.69-3.73(m，2H)，3.20(s，3H)，2.80-2.84(m，2H)；MS-EIm/z＝374[M]+. 实施例十三7-苄基-1-((4’-羟基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮 将1-(4-溴苄基-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮(0.5mmol)溶于4ml干燥的DMF中，冷却下加入NaH(0.6mol)，在此温度下搅拌30min，然后加入溴苄(0.75mmol)，升到室温搅拌过夜。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取，有机相干燥，浓缩，粗产品柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)得白色固体102mg，产率54％。
在10ml微波反应管中加入上步产品(0.2mmol)，4-羟基苯硼酸(0.3mmol)，2N Na2CO3(0.2ml)，甲苯(2ml)，和乙醇(0.5ml)，然后在氮气保护下加入Pd(PPh3)4(5％mol)。加入搅拌磁子后盖上密封盖，置于单模微波反应器内。130℃下反应30分钟，停止反应，冷却至室温，倒入水中，乙酸乙酯萃取，有机相用食盐水洗，干燥，浓缩，粗产品柱层析分离(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)得白色固体39mg，产率45％。
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.44-7.50(m，4H)，7.18-7.22(m，5H)，7.08-7.10(m，3H)，6.89-6.93(m，3H)，6.70(d，J＝2.8Hz，1H)，5.66(s，2H)，4.76(s，2H)，3.56(t，J＝4.8Hz，2H)，2.66-2.69(m，2H)；MS-EIm/z＝436[M]+. 实施例十四对人体结肠癌细胞，乳腺癌细胞和人胚胎成纤维细胞的抑制活性实验 实验方法72h MTT法(现有技术中检测细胞存活和生长的常用方法，属于已知技术) 测定了本发明的部分式(I)结构中的吡咯并氮杂卓酮类化合物对人体结肠癌细胞，乳腺癌细胞和人胚胎成纤维细胞的抑制活性。IC50值为抑制率达到50％时的抑制剂浓度。结果如下表
其中HCT-116表示人体结肠癌细胞，MCF-7表示人体乳腺癌细胞，MRC-5表示人胚胎成纤维细胞，N表示没有测试。
实施例十五对部分细胞系的抑制活性实验 方法72h MTT法 抑制剂抑制剂与实施例十四表格中抑制剂编号对应的结构相同
其中MDA-MB-435代表人乳腺癌高转移细胞，CNE-1代表人鼻咽癌细胞(高分化)，CNE-2代表人鼻咽癌细胞(低分化)，Hep3B代表人肝癌细胞，HepG2代表人肝癌细胞，BT549代表人乳腺管癌细胞，HeLa代表人宫颈癌细胞，LN19和LN444都代表神经胶质瘤细胞。
实施例十六对小鼠肝癌H22移植瘤的生长抑制作用 动物KM中小鼠 药物实施例十四的表格中编号2和7两化合物。吐温80助溶，蒸馏水配制成所需浓度2.5mg/ml，5mg/m，10mg/ml，每20g小鼠分别灌胃0.4ml。阳性对照药环磷酰胺(CTX)，临用前用生理盐水配制成10mg/ml，每20g小鼠腹腔注射0.2ml。
实验步骤用生理盐水按1∶2稀释H22腹水，每只小鼠腋下接种0.2ml腹水悬液。第二天称重，随机分组后给药，实验共设8组，除阴性对照组9只动物外，其余各组每组均为8只。实验设阴性对照组，阳性对照组(CTX 100mg/kg)，腹腔注射一次)，化合物250mg/kg，100mg/kg，200mg/kg剂量组，化合物750mg/kg，100mg/kg，200mg/kg剂量组，均为灌胃给药，共给药9天。实验11天称重后处死动物，并剥取肿瘤，拍照，称瘤重。
试验结果化合物2在100mg/kg剂量组对小鼠移植瘤H22生长有一定的抑制作用，化合物7抑制作用不明显，具体数据见下表。
上述活性数据表明，本发明的化合物对多种肿瘤细胞都具有一定的抑制作用，因此，该类化合物具有制备治疗肿瘤药物的应用前景。
权利要求
1.下述式(I)表示的吡咯并氮杂卓酮类化合物或者其药用盐
其中n代表0或1；R1代表H，C1-C6烷基，或苄基；R2代表OH或O；R3代表H，三氟甲基，C1-C6烷基，或OR4，R4代表H，C1-C6烷基。
2.根据权利要求1所述的吡咯并氮杂卓酮类化合物或者其药用盐，其特征在于所述的吡咯并氮杂卓酮类化合物或者其药用盐选自以下化合物
1-(联苯-4-取代甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮、
1-(联苯-4-取代甲基)-4-羟基-4，5，6，7-四氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-8(1H)-酮、
1-(联苯-4-取代)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮、
1-((4’-甲基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮、
1-((4’-羟基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮、
1-((4’-(三氟甲基)联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮、
1-((4’-甲氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮、
1-((4’-乙氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮、
1-((4’-丙氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮、
1-((4’-异丙氧基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮、
1-((4’-甲氧基联苯-4-取代)甲基)-7-甲基-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮、
7-苄基-1-((4’-羟基联苯-4-取代)甲基)-6，7-二氢吡咯[2，3-c]氮杂卓-4，8(1H，5H)-二酮。
3.权利要求1所述的吡咯并氮杂卓酮类化合物或者其药用盐在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
4.一种治疗肿瘤的药物组合物，其含有有效量的作为活性成份的权利要求1所述的吡咯并氮杂卓酮类化合物或者其药用盐和药用载体。
全文摘要
本发明公开了一种吡咯并氮杂卓酮类化合物及其在制备治疗肿瘤的药物中的应用，旨在提供一类对肿瘤细胞具有抑制作用的，具有式(I)结构的吡咯并氮杂卓酮类化合物及其药用盐。它具有式(I)表示的化合物其中n代表0或1；R1代表H，C1-C6烷基，或苄基；R2代表OH或O；R3代表H，三氟甲基，C1-C6烷基，或OR4，R4代表H，C1-C6烷基。
文档编号A61P35/00GK101759699SQ200910261419
公开日2010年6月30日 申请日期2009年12月11日 优先权日2009年11月2日
发明者万一千, 谢建伟, 朱新海, 王淑东, 袁洁, 陈晓光, 苏丽, 孟飞, 汪晨霞, 黄漫娜 申请人:中山大学
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