仔猪副伤寒活疫苗的制备方法及其产品的制作方法

专利名称：：仔猪副伤寒活疫苗的制备方法及其产品的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种动物活疫苗的制备方法，尤其涉及一种仔猪副伤寒活疫苗的制备方法以及由该方法制备得到的产品，属于副伤寒活疫苗领域。
背景技术：
：仔猪副伤寒是由猪霍乱沙门氏菌引起的急性、亚急性或慢性传染病。主要发生于2-4月龄仔猪，危害性极大，急性病例主要表现为败血症，症状为体温突然升高、精神不振、不食，后期间有下痢、呼吸困难、耳根、胸前和腹下皮肤有紫红色斑点，有时出现症状后24h内死亡，病死率很高。亚急性和慢性症状表现为消瘦、下痢和肠炎，病情往往拖后2-3周或更长，最后极度消瘦，衰竭而死。1948年苏联人伊瓦诺夫因成功研制出仔猪副伤寒灭活菌苗，获得了斯大林勋章。国外很早就使用灭活菌苗，我国在五六十年代也开始使用灭活菌苗，但灭活菌苗的使用效果很不理想，I960年我国曾制造了含各种不同佐剂的灭活菌苗共52批对235头仔猪进行免疫试验，均免疫两次，攻毒后保护率仅为29.9%。1961年我国开始弱毒菌株培育及弱毒菌苗的研制，于1964年选出一株毒力弱而又稳定、免疫原性良好的菌种，编号为C500。在生产C500弱毒菌苗过程中，因采用大扁瓶琼脂培养生产菌苗，存在劳动强度大和产量低的缺点，从七十年代初开始各生物制品厂陆续改用液体通气培养法生产。但由于通气培养有部分菌体生命较为脆弱，容易出现菌苗冻干后活菌率较低，而引起仔猪反应较大，并偶尔有出现不安全的情况。后经各厂家改善培养和冻干技术以及进行菌苗口服试验，口服试验证明口服免疫的效果与注射的效果同样良好，而且口服活菌率低至37%的菌苗也很安全，据此结果规定了冻干活菌率不低于50%的用于注射或口服；冻干活菌率低于50%的菌苗不能注射但可用于口服。此规定可保证更多的菌苗出厂使用。我国于1976年将液体通气培养法批准列入《兽用生物制品规程》，在全国许多生物制品生产厂家投入生产，推广应用。此方法一直延用至今，此培养方法一直存在着菌数低、冻干死亡率高的问题，生产难度大，产量低、成本高。因市场需求量大，各生产厂家时常都有出现断货的现象发生，多年来一直困扰着各生产厂家。《兽用生物制品规程》对仔猪副伤寒活疫苗的生产方法进行了具体的规范，按《规程》生产方法如下1、一级菌种的制备菌种用普通肉汤稀释或经普通肉汤培养繁殖后，接种普通琼脂平板，37t:培养18-20h，选取菌落为圆形、边缘整齐、突起、半透明、略湿润的光滑型中等大小菌落5-10个，混合接种于普通琼脂斜面若干支，37t:培养24h经纯粹检验，并用1/500吖啶黄溶液做玻片凝集试验检查合格，作为一级菌种，在2-『C保存，应不超过2个月此间可移植1-2次，在培养基上继代，不超过5代。2、二级菌种的制备3取一级菌种接种普通肉汤琼脂扁瓶，37t:培养24h(普通琼脂培养物用普通肉汤洗下制成浓度适宜的菌液)，纯粹检查合格后，即可作为种子。在2-『C保存，应不超过2日。3、菌液培养将二级菌种按培养基总量的1%_2%接种于含1%-1.5%蛋白胨的普通肉汤中，在37t:通气培养18-2ih，培养过程中根据需要加入适量的消泡剂，并根据ra升高情况加入适量灭菌40%葡萄糖液以控制ra。培养结束后立即加入经过灭菌及预热至37t:的稳定剂，使疫苗含1.5%明胶及5%蔗糖，充分混匀后按规定头份定量分装。每头份活菌不少于30亿个。按照上述方法生产，培养菌数一般在180-260亿/ml，按每头份活菌30亿个计算配苗，最大分装量为3.8ml/瓶，规程规定最低为20头份/瓶，此菌冻干死亡率在40%-60%，按最高培养菌数260亿和60%死亡率计算接近《规程》规定的最低头份标准，此培养方法一直存在着菌数低、冻干死亡率高的问题，生产难度大，产量低、成本高，有待改进。
发明内容本发明所要解决的技术问题是克服现有的仔猪副伤寒活疫苗的生产方法所存在的菌数低、冻干死亡率高，生产难度大，产量低，成本高等问题，提供一种新的仔猪副伤寒活疫苗的生产方法，该生产方法可使细菌培养时间縮短，培养菌数明显提高，冻干死亡率大幅度下降。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的—种仔猪副伤寒活疫苗的生产方法，包括(l)一级菌种的制备猪霍乱沙门氏菌菌种用普通肉汤稀释或经普通肉汤培养繁殖后，接种普通琼脂平板，37t:培养18-20h，选取中等大小菌落5-10个，混合接种于普通琼脂斜面，37t:培养24h，检验合格后作为一级菌种；(2)二级菌种的制备取一级菌种接种普通肉汤琼脂扁瓶，37t:培养24h，检查合格后，作为二级种子；(3)菌液培养将二级菌种接种到培养基中培养；培养结束后立即加入经过灭菌及预热至37°C的稳定剂，使疫苗含1.5%明胶及5%蔗糖，充分混匀；其中，步骤(3)中所述的培养基由普通肉汤培养基和合成培养基按照2:1的体积比例所组成；所述的普通肉汤培养基组成为牛肉500g，蛋白胨10-15g，氯化钠5g，蒸馏水或去离子水1000ml;所述的合成培养基的组成为牛肉浸粉10g，蛋白胨10g，酵母粉10g，葡萄糖2g，氯化钠5g;加水至1000ml。本发明还通过大量的实验发现，在上述生产方法中采用以下手段，对于縮短细菌培养时间，提高培养菌数以及降低冻干死亡率等方法均有明显的效果步骤(2)中取一级菌种接种普通琼脂或普通肉汤，37t:培养24h后用40%灭菌葡萄糖溶液冲洗菌苔后接入装量为3000ml—万瓶中，37t:培养20-22h;检查合格后，再作为二级种子；步骤(3)中所述的接种量优选为按培养基总重量的3%接种量将二级种子接种到培养基中；所述的培养优选为在37t:条件下通气培养15h，其中，更优选的，在37t:温度下逐渐加大通气培养15h;本发明针对仔猪副伤寒活疫苗生产方法所存在的菌数低、冻干死亡率高，生产难度大，产量低，成本高等问题，有针对性的开展了改进仔猪副伤寒活疫苗制备方法的研究，从生产工艺和培养基配方方面做了大量的探索、研究试验。本发明方法所生产的仔猪副伤寒活疫苗，培养菌数突破500亿/ml，最高达到580亿/ml，冻干死亡率降至20-40%。《兽用生物制品规程》中对仔猪副伤寒活疫苗规格为20头份/瓶、30头份/瓶、40头份/瓶；按照本发明方法所生产的15个批次的活疫苗，其中11个批次达到30头份/瓶，4个批次达到40头份/瓶。本发明方法具有所生产的活疫苗菌数高、冻干死亡率低，容易生产，产量高，成本低等优点。具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。—、普通肉汤的配制牛肉500g蒸馏水或去离子水1000ml蛋白胨10-15g氯化钠5g;将上述各组分溶于蒸馏水或去离子水中，高温高压灭菌，即得。二、合成培养基的配制牛肉浸粉10g，蛋白胨10g，酵母粉10g，葡萄糖2g，氯化钠5g;加水至1000ml，高温高压灭菌，即得。实施例11、一级菌种的制备将猪霍乱沙门氏菌菌种(购买于中国兽药监察所)用普通肉汤稀释或经普通肉汤培养繁殖后，接种普通琼脂平板，37t:培养18-20h，选取菌落为圆形、边缘整齐、突起、半透明、略湿润的光滑型中等大小菌落5-10个，混合接种于普通琼脂斜面若干支，37t:培养24h经纯粹检验，并用1/500吖啶黄溶液做玻片凝集试验检查合格，作为一级菌种，在2-8t:保存，应不超过2个月此间可移植1-2次，在培养基上继代，不超过5代。2、二级菌种的制备钩取一级菌种划线接种普通肉汤琼脂扁瓶，37t:培养24后，用40%灭菌葡萄糖溶液冲洗菌苔后接入装量为3000ml—万瓶中，37t:培养20_22h，纯粹检查合格后，即可作为二级种子。在2-8t:保存，应不超过3日。3、菌液培养将二级菌种按培养基总量的3%接种于两份含1%-1.5%蛋白胨的普通肉汤和一份合成培养基中(2:1)，用智能微生物发酵罐37t:通气培养15h，培养过程中要采用逐渐加大通气量进行培养，并根据PH升高情况加入适量灭菌40%葡萄糖液以控制pH值为7.4-7.6。培养结束后立即加入经过灭菌及预热至37°C的稳定剂，使疫苗含1.5%明胶及5%蔗糖，充分混匀后按规定头份定量分装。每头份活菌达到40亿个。实施例21、一级菌种的制备将猪霍乱沙门氏菌菌种(请给出猪霍乱沙门氏菌菌种的商业购买途径)用普通肉5汤稀释或经普通肉汤培养繁殖后，接种普通琼脂平板，37t:培养18-20h，选取菌落为圆形、边缘整齐、突起、半透明、略湿润的光滑型中等大小菌落5-10个，混合接种于普通琼脂斜面若干支，37t:培养24h经纯粹检验，并用1/500吖啶黄溶液做玻片凝集试验检查合格，作为一级菌种，在2-『C保存，应不超过2个月此间可移植1-2次，在培养基上继代，不超过5代。2、二级菌种的制备钩取一级菌种划线接种普通肉汤琼脂扁瓶，37t:培养24后，纯粹检查合格后，即可作为二级种子。在2-『C保存，应不超过3日。3、菌液培养将二级菌种按培养基总量的3%接种于两份含1%-1.5%蛋白胨的普通肉汤和一份合成培养基中(2:1)，用智能微生物发酵罐37t:通气培养15h，培养过程中采用逐渐加大通气量进行培养，并根据PH升高情况加入适量灭菌40%葡萄糖液以控制pH值为7.4-7.6;培养结束后立即加入经过灭菌及预热至37°C的稳定剂，使疫苗含1.5%明胶及5%蔗糖，充分混匀后按规定头份定量分装。每头份活菌不少于30亿个。实施例31、一级菌种的制备将猪霍乱沙门氏菌菌种(请给出猪霍乱沙门氏菌菌种的商业购买途径)用普通肉汤稀释或经普通肉汤培养繁殖后，接种普通琼脂平板，37t:培养18-20h，选取菌落为圆形、边缘整齐、突起、半透明、略湿润的光滑型中等大小菌落5-10个，混合接种于普通琼脂斜面若干支，37t:培养24h经纯粹检验，并用1/500吖啶黄溶液做玻片凝集试验检查合格，作为一级菌种，在2-『C保存，应不超过2个月此间可移植1-2次，在培养基上继代，不超过5代。2、二级菌种的制备钩取一级菌种划线接种普通肉汤琼脂扁瓶，37t:培养24后，用40%灭菌葡萄糖溶液冲洗菌苔后接入装量为3000ml—万瓶中，37t:培养20_22h，纯粹检查合格后，即可作为二级种子。在2-8t:保存，应不超过3日。3、菌液培养将二级菌种按培养基总量的3%接种于两份含1%-1.5%蛋白胨的普通肉汤和一份合成培养基中(2:1)，用智能微生物发酵罐37t:通气培养20h，并根据pH升高情况加入适量灭菌40%葡萄糖液以控制pH值为7.4-7.6。培养结束后立即加入经过灭菌及预热至37t:的稳定剂，使疫苗含1.5%明胶及5%蔗糖，充分混匀后按规定头份定量分装。每头份活菌不少于30亿个。试验例1—、试验材料供试疫苗实施例1-3所制备的活疫苗；共分为15个批次；对照疫苗按照《兽用生物制品规程》所生产的仔猪副伤寒活疫苗；分为9个批次；二、试验方法及结果供试疫苗和对照疫苗采用相同冻干曲线，冻干曲线为-15°〇入箱，预冻-40°C4h，升华干燥-2t:25h，解吸干燥32t:7h。细菌计数用培养基为普通肉汤琼脂(普通肉汤加1.5%琼脂)，采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，供试疫苗和对照疫苗的培养菌数和冻6干死亡率对比见表1。表1供试疫苗和对照疫苗的培养菌数及冻干死亡率对比表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>从试验结果可见，采用本发明生产方法所制备的活疫苗的培养菌数突破500亿/ml，最高达到580亿/ml，冻干死亡率降至20-40%;《兽用生物制品规程》规格为20头份/瓶、30头份/瓶、40头份/瓶；采用本发明方法共计生产仔猪副伤寒活疫苗15个批次，其中11个批次达到30头份/瓶，4个批次达到40头份/瓶。权利要求一种仔猪副伤寒活疫苗的生产方法，包括(1)一级菌种的制备将猪霍乱沙门氏菌菌种用普通肉汤稀释或经普通肉汤培养繁殖后，接种普通琼脂平板，37℃培养18-20h，选取菌落5-10个，混合接种于普通琼脂斜面，37℃培养24h，检验合格后作为一级菌种；(2)二级菌种的制备取一级菌种接种普通肉汤琼脂扁瓶，37℃培养24h后用40％灭菌葡萄糖溶液冲洗菌苔后接入装量为3000ml一万瓶中，37℃培养，检查合格后，作为二级种子；(3)菌液培养将二级菌种接种到培养基中培养；培养结束后立即加入经过灭菌及预热至37℃的稳定剂，使疫苗含1.5wt％明胶及5wt％蔗糖，充分混匀；其特征在于步骤(3)中所述的培养基由普通肉汤培养基和合成培养基按照2∶1的体积比例所组成。2.按照权利要求1所述的生产方法，其特征在于所述普通肉汤培养基组成为牛肉500g，蛋白胨10-15g，氯化钠5g，蒸馏水或去离子水1000ml;所述的合成培养基的组成为牛肉浸粉10g，蛋白胨10g，酵母粉10g，葡萄糖2g，氯化钠5g;加水至1000ml。3.按照权利要求1所述的生产方法，其特征在于步骤(2)中取一级菌种接种普通肉汤琼脂扁瓶，37t:培养24h后用40X灭菌葡萄糖溶液冲洗菌苔后接入装量为3000ml—万瓶中，37t:培养20-22h;检查合格后，再作为二级种子。4.按照权利要求l所述的生产方法，其特征在于步骤(3)中按培养基总重量的3%接种量将二级种子接种到培养基中。5.按照权利要求1所述的生产方法，其特征在于所述的培养为在37t:条件下通气培养15h。6.按照权利要求1所述的生产方法，其特征在于所述的培养是在37t:温度下逐渐加大通气培养15h。7.权利要求1-6任何一项生产方法所生产得到的活疫苗。8.权利要求7所述的活疫苗在制备预防或治疗仔猪副伤寒药物中的用途。9.一种预防或治疗仔猪副伤寒的药物组合物，其特征在于由权利要求7所述的活疫苗和药学上可接受的载体或赋型剂组成。全文摘要本发明公开了一种仔猪副伤寒活疫苗的生产方法及其产品，包括(1)一级菌种的制备；(2)二级菌种的制备；(3)菌液培养将二级菌种接种到培养基中培养；培养结束后立即加入经过灭菌及预热至37℃的稳定剂，使疫苗含1.5％明胶及5％蔗糖，充分混匀，即得；其中步骤(3)中所述的培养基由普通肉汤培养基和合成培养基按照2∶1的体积比例所组成。本发明方法所生产的仔猪副伤寒活疫苗，培养菌数突破500亿/ml，最高达到580亿/ml，冻干死亡率降至20-40％。本发明生产方法具有活疫苗菌数高，冻干死亡率低，容易生产，产量高，生产成本低等优点。文档编号A61P31/00GK101732706SQ20091026170公开日2010年6月16日申请日期2009年12月28日优先权日2009年12月28日发明者付丽杰,刘洪斌,左颖,张继东,李尊江,杨万秋,王静,邬立权申请人:哈药集团生物疫苗有限公司