蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法
蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法
【技术领域】
[0001] 本申请属于生物化学，具体地说，设及一种蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备 方法。
【背景技术】
[0002] 随着人类基因组计划的全面实施与推进，生命科学已经进入了后基因组时代，其 主要研究对象已转变为功能基因组学的研究。
[0003] 蛋白质组学(Proteomics) W活细胞内基因组编码的全部蛋白质为研究对象，是研 究生物体在特定时间或特定空间内所表达的全部蛋白质的特征，包括蛋白表达水平，翻译 后修饰，蛋白质与蛋白质或与其他生物分子的相互作用等，是掲示植物与环境之间相互作 用分子机制的一种新手段，其研究被认为是后基因组时代生命科学研究的核屯、内容之一且 日趋成为研究热点而备受关注。
[0004] 双向电泳（two-dimensional electro地oresis，2-DE)可W对生物细胞或组织全 蛋白质表达进行定性或定量的综合分析，尤其是用于掲示不同条件下蛋白质表达的变化。 作为蛋白组学研究中的核屯、技术之一，是对蛋白质组分辨率最高、重复性最好的分离技术， 也是目前常用的唯一一种能够连续在一块胶上分离数千种蛋白质的方法，广泛应用于生物 学研究的各个方面。然而双向电泳步骤繁琐，影响因素较多，蛋白质样品的制备是双向电泳 的第一步，也是最重要的一步，样品制备的好坏直接影响到随后蛋白的分离及最后分析结 果的可靠性。目前并没有一个通用的制备方法，样品制备方法要根据不同实验材料进行选 择，不同的材料所适用的方法也不同。样品制备分为蛋白质的提取、裂解液配方的选择、杂 质的去除等步骤，在处理某种样品的时候，如果运些步骤中的任何一步没有充分完成，分离 可能不完全或失败，并且，一些信息也可能丢失。因此建立有效的样品制备方法，高分辨地 分离蛋白质一直是植物蛋白质组学研究中双向凝胶电泳技术不断改进的方向。
[0005] 双向电泳技术早期主要应用于细菌、动物组织和细胞全蛋白质组分的分析，近年 来在植物中的应用亦有不少报道，但大多集中于水稻、小麦等模式植物或其它一些草本植 物上，在豆科植物中报道较少，研究多集中在油料作物大豆、牧草植物黄花首猜、截形首猜、 菜饲兼用作物魏豆等植物上，但设及蚕豆蛋白质组的研究鲜见报道。
[0006] 蚕豆能适应冷凉气候和多种±地条件，与根瘤菌形成固氮共生体为自身和后作作 物提供无偿可利用的氮源，有生物固氮之王的美誉，具有高蛋白含量，易消化吸收，粮、饲、 菜兼用和深加工增值等特点，是种植业结构调整中重要的间套作和养地作物。蚕豆关于蛋 白方面研究起步较晚，主要研究集中在食品加工级别的蛋白提取、分离、功能特性研究等方 面，而在蛋白质组学方面只有理论综述，而没有实质性的工作进展。开展蚕豆蛋白质组学研 究对于深入研究蚕豆生长发育机理，抗逆性研究、遗传育种都具有重要的理论意义和实用 价值。因此，为了加快蚕豆蛋白质组学研究步伐，为蚕豆蛋白质组学研究奠定理论基础和技 术指导需要尽快着手建立一种适合于蚕豆蛋白质组学分析的样品制备方法，为深入开展蚕 豆蛋白质组学研究提供技术支撑，迈出开展蚕豆双向电泳技术的第一步。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本申请所要解决的技术问题是现有技术中没有通用、有效、适合于蚕豆 的蛋白质组学分析样品的制备方法。提供一种适合蛋白质组学分析的蚕豆叶片样品制备方 法。
[0008] 为了解决上述技术问题，本申请公开了一种蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备 方法，包括W下步骤：
[0009] 1)取新鲜蚕豆幼苗叶片。
[0010] 2)将所述新鲜蚕豆幼苗叶片用液氮快速冷却并研磨成粉末。
[0011] 3)向步骤2)所述粉末中加入提取缓冲液，满旋混匀后-20°c过夜沉淀，过夜后的样 品弃去沉淀，取上清液离屯、，离屯、后弃去上清液，得到沉淀。
[0012] 4)向步骤3)得到的沉淀中加入含0.07%β-琉基乙醇的-20°c预冷丙酬溶液，捣碎 沉淀，使所述沉淀与丙酬溶液充分接触，然后将沉淀满旋混匀，静置，然后离屯、，弃去上清 液，得到沉淀。为了尽可能地去除蛋白沉淀中的干扰物质，得到符合双向电泳要求的蛋白质 样品，可重复此步骤1次。
[0013] 5)向步骤4)得到的沉淀中加入含0.07 %β-琉基乙醇的-20°C预冷的90 %丙酬溶 液，满旋混匀后捣碎沉淀，静置，然后离屯、，弃去上清液，得到沉淀。为了尽可能地去除蛋白 沉淀中的干扰物质，得到符合双向电泳要求的蛋白质样品，可重复此步骤1次。
[0014] 6)将步骤5)得到的沉淀干燥，得到粉末。
[0015] 7)向所述粉末中加入裂解液，23°C静置2.化，然后满旋混匀，得到样品裂解溶液。
[0016] 8)将步骤7)得到的样品裂解溶液离屯、，吸取上清液，将所述上清液再次离屯、，取上 清液作为待分析溶液。
[0017] 9)绘制蛋白浓度标准曲线，取待分析溶液与考马斯亮蓝蛋白试剂反应，测定吸光 度值，根据所述蛋白浓度标准曲线计算得到待分析溶液中蛋白质的浓度。
[0018] 10)按电泳上样量9(K)yg，计算蛋白体积，并分装到化1的小管中，然后于-80°c保 存；
[0019] 蛋白体积(μ1 )= 90化g/待分析溶液中蛋白质浓度。
[0020] 11)从-80°c取出蛋白样品，自然融化后按上样总体35化1和蛋白体积，计算出水化 液体积，加入蛋白样品水化液，在4°C、12000 X g下离屯、15min，即得；
[0021] 水化液体积=35化^蛋白体积。
[0022] 进一步的，所述步骤2)中，将新鲜蚕豆幼苗叶片用液氮快速冷却后置于-20°C预冷 后的研鉢中研磨。
[0023] 进一步的，步骤3)中，所述提取缓冲液为含0.07%β-琉基乙醇的10%Ξ氯乙酸丙 酬溶液;所述提取缓冲液加入前先进行预冷;所述离屯、条件为4°C、20000 X g下离屯、20min。
[0024] 进一步的，步骤4)中，所述静置条件为-20°C条件下静置20min;所述离屯、条件为4 °C、20000Xg下离屯、20min。
[0025] 进一步的，步骤5)中，所述静置条件为-20°C条件下静置20min;所述离屯、条件为4 °C、20000Xg下离屯、20min。
[00%]进一步的，步骤6)中，所述干燥方法为真空干燥化;所述粉末为乳白色。
[0027] 进一步的，步骤7)中，所述裂解液为8mol/L尿素、2%聚乙二醇辛基苯基酸(Triton X-100)和60mol/L二硫苏糖醇(DTT)的混合溶液;所述裂解液加入体积与所述新鲜蚕豆幼苗 叶片质量比为1:1。
[0028] 进一步的，步骤8)中，所述离屯、条件为4°C、12000 X g下离屯、15min;再次离屯、条件 为 4°C、12000Xg下离屯、lmin。
[0029] 进一步的，步骤9)中，所述蛋白浓度标准曲线W牛血清蛋白为标准蛋白，参考 化a壯ord的方法绘制。
[0030] 进一步的，所述考马斯亮蓝蛋白试剂包括：质量浓度为0.01 %的考马斯亮蓝G-250，质量浓度为4.75 %的乙醇和质量浓度为8.5 %的憐酸;所述反应时间为5min，检测波长 为595nm。
[0031] 进一步的，所述蛋白样品水化液包括:7mol/L尿素，2mol/L硫脈，4%的3-3-胆酷胺 基丙基二甲基锭基-1-丙横酸盐(CHAPS)，65mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，0.2%载体两性电解 质αPGbuffer)和0.001%漠酪蓝。
[0032] 与现有技术相比，本申请可W获得包括W下技术效果：
[0033] 1)本申请W蚕豆叶片为实验材料，W获得符合蛋白质组学分析的样品制备方法为 目的，填补了蚕豆叶片双向电泳技术的空白，为深入开展蚕豆蛋白质组学提供技术支持。
[0034] 2)本申请的技术方案，步骤简单，易于操作，重复性好，技术人员易学、易掌握。
[0035] 3)本申请中选用的实验试剂均为双向电泳常规试剂，无昂贵、稀有试剂，实验运作 成本低。
[0036] 当然，实施本申请的任一产品必不一定需要同时达到W上所述的所有技术效果。
【附图说明】
[0037] 此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申 请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
[0038] 图1为本申请蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法实施例1的蛋白浓度标准 曲线图；
[0039] 图2为本申请蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法实施例1得到的蛋白样品 的2-DE电泳图。
【具体实施方式】
[0040] W下将配合附图及实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用 技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据W实施。
[0041] 实施例一本申请的蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法
[0042] 本申请公开的蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法，包括W下步骤:称取蚕 豆幼苗叶片^液氮研磨^提取缓冲液^离屯、弃上清^丙酬沉淀^真空干燥沉淀^加入裂 解液^离屯、取上清^蛋白定量^分装冷冻^样品水化^样品制备完成。
[0043] (1)用电子天平准确称取蚕豆叶片鲜样2. Og。
[0044] (2)将研鉢提前放置-20°C冰箱预冷，将步骤（1)称量好的蚕豆叶片鲜样放置在预 冷的研鉢中用液氮快速冷冻并充分研磨至细粉。
[0045] (3)将步骤(2)研磨好的粉末快速转移到50ml离屯、管中，加入预冷的25ml提取缓冲 液(10%TCA/丙酬+0.07%β-琉基乙醇），满旋混匀后放置在-20°C环境下过夜沉淀。
[0046] (4)取出步骤(3)过夜沉淀后的样品，弃去沉淀，取上清液，按1ml/管分装成24管， 在4°C、20000 X g下离屯、20min，弃去上清液。
[0047] (5)向步骤(4)得到的沉淀中加入25ml含0.07%β-琉基乙醇的-20°C预冷丙酬，然 后用剪去尖头的1ml枪头将沉淀轻轻捣碎，使沉淀与丙酬充分接触后，转移使其减少至12 管。满旋混匀后在-20°C条件下静置20min，静置结束后在4°C、20000Xg下离屯、20min，弃去 上清液，重复此步骤1次，同时转移使其减少至6管。
[004引 （6)向步骤（5)得到的6管沉淀中加入40ml含0.07 % β-琉基乙醇的90 %预冷的丙 酬，满旋混匀后用剪去尖头的枪头将沉淀捣碎，并减少样管至4管后-20°C静置lOmin，静置 结束后在4°C、20000Xg下离屯、20min，弃去上清液，重复此步骤1次，同时转移使其减少至2 管。
[0049] (7)将步骤(6)得到的2管沉淀真空干燥化，得到2管乳白色粉末。
[0050] (8)向步骤(7)得到的2管粉末中各自加入2ml裂解液(8mol/L尿素、2%化iton X-100和60mol/L DTT的混合溶液)在23°C环境下放置2.化，期间满旋混匀2-3次，使沉淀裂解 充分。
[0051] (9)裂解结束后，将步骤(8)得到的2管样品裂解溶液分别在4°C、12000Xg下离屯、 15min，吸取上清液，并将2管上清液转移至1管后在4°C、12000 X g下离屯、Imin，吸取上清液， 作为待分析样品溶液。
[0052] (10)参考化adford的方法进行蛋白定量，W牛血清蛋白为标准蛋白绘制标准曲 线，取待分析样品溶液与CBB蛋白试剂(质量浓度为0.01 %的G-250，质量浓度为4.75 %的乙 醇和质量浓度为8.5 %的憐酸)反应5min，在595nm波长下测定吸光值，根据标准曲线测定上 清液中蛋白质的浓度。制作标准曲线的数据如表1所示，标准曲线图如图1所示。
[0053] 表1标准曲线的制作 [0化4]
[0化5]样品蛋白含量 X(yg) = (Y-〇. 0108)/0.015
[0056]样品蛋白浓度(ygM)=X/样品体积(μ1)
[0化7] (11)按叶片蛋白总上样量90化邑，上样总体35化1，计算蛋白体积，并分装后-80°c 保存。
[005引样品蛋白体积(μ 1 )= 90化g/样品蛋白浓度
[0059] (12)从-80°C取出蛋白样品，自然溶解后按蛋白体积计算出水化液体积(水化液体 积=350μ 1-蛋白体积），加入适量体积的蛋白样品水化液（7mo 1 /L尿素，2mo 1 /L硫脈，4% CHAPS，65mmo 1/L DTT，0.2 % IPCibuf f er，0.001 % 漠酪蓝），在4°C、12000 X g下离屯、15min。
[0060] 将本申请制备方法中蛋白提取方法与现有技术进行比较。现有技术中的两种提取 方法一-直接提取法和丙酬提取法的具体提取方法如下：
[0061] (1)直接提取法
[0062] 取蚕豆叶片30化旨，液氮研磨至细粉状，加入30mg水不溶性PVP用于色素吸附，悬浮 于900μ1 的蛋白质提取液(50mmo 1 · [1，Tri S-HCL，P册.8，10 % 甘油，0.5 % SDS，5 %β-琉基乙 醇）中，4°C浸提化，4°C，13000r · min-i离屯、15min，取上清，分装，直接用于电泳或-80°C保 存。
[0063] (2)丙酬沉淀法
[0064] 在直接提取法得到的上清液中加入3倍体积的含0.07%β-琉基乙醇的预冷的丙 酬，混匀，-20°C沉淀蛋白质1.化，4°C，15300r · min-i离屯、15min，弃上清，沉淀用80 %、100% 的丙酬各洗1次，-20°C放置，待丙酬完全挥发后收集蛋白质干粉，小量分装，冻存于-80°C。
[0065] 表2 Ξ种提取方法提取结果比较
[0066]
[0067] 从表2可W看出，本申请的蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法，提取的蛋白 浓度和蛋白总产量均远远高于传统的直接提取法和丙酬提取法，其中蛋白浓度是传统方法 的1.5倍左右;蛋白总产量是传统方法的3倍左右。
[0068] 本申请采用方法制备得到的蛋白样品进行双向电泳，结果如图2所示。本申请采用 方法提取的蛋白样品符合双向电泳蛋白浓度6-化g/μL的浓度范围，获得的双向电泳图谱蛋 白质点多且清晰。
[0069] 本申请W蚕豆叶片为实验材料，W获得符合蛋白质组学分析的样品制备方法为目 的，填补了蚕豆叶片双向电泳技术的空白，为深入开展蚕豆蛋白质组学提供技术支持。本申 请的技术方案，步骤简单，易于操作，重复性好，技术人员易学、易掌握。选用的实验试剂均 为双向电泳常规试剂，无昂贵、稀有试剂，实验运作成本低。
[0070] 如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术 人员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不 W名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的"包含"为 一开放式用语，故应解释成"包含但不限定于"。"大致"是指在可接收的误差范围内，本领域 技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续 描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃W说明本申请的一般原则为目的，并非 用W限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
[0071] 还需要说明的是，术语"包括"、"包含"或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的 包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确 列出的其他要素，或者是还包括为运种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情 况下，由语句"包括一个……"限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还 存在另外的相同要素。
[0072]上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请 并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、 修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识 进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申 请所附权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 取新鲜蚕豆幼苗叶片； 2) 将所述新鲜蚕豆幼苗叶片用液氮快速冷却并研磨成粉末； 3) 向步骤2)所述粉末中加入提取缓冲液，涡旋混匀后-20°C过夜沉淀，过夜后的样品弃 去沉淀，取上清液离心，离心后弃去上清液，得到沉淀； 4) 向步骤3)得到的沉淀中加入含0.07%β-巯基乙醇的-20°C预冷丙酮溶液，捣碎沉淀， 使所述沉淀与丙酮溶液充分接触，然后将沉淀涡旋混匀，静置，然后离心，弃去上清液，得到 沉淀； 5) 向步骤4)得到的沉淀中加入含0.07 %β-巯基乙醇的-20°C预冷的90 %丙酮溶液，涡 旋混匀后捣碎沉淀，静置，然后离心，弃去上清液，得到沉淀； 6) 将步骤5)得到的沉淀干燥，得到粉末； 7) 向所述粉末中加入裂解液，23°C静置2.5h，然后涡旋混匀； 8) 将步骤7)得到的样品裂解溶液离心，吸取上清液，再次离心，取上清液作为待分析溶 液； 9) 绘制蛋白浓度标准曲线，取待分析溶液与考马斯亮蓝蛋白试剂反应，测定吸光度值， 根据所述蛋白浓度标准曲线计算得到待分析溶液中蛋白质的浓度； 10) 按叶片蛋白上样量900yg，计算蛋白体积，分装后-80°C保存； 蛋白体积(μL)=9〇〇yg/待分析溶液中蛋白质浓度； 11) 从-80°C取出蛋白样品，自然融化后按上样总体350μ1和蛋白体积，计算出水化液体 积，加入蛋白样品水化液，在4°C、12000Xg下离心15min，即得； 水化液体积=350μ1-蛋白体积。2. 如权利要求1所述的蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，步骤7) 中，所述裂解液为8mo1/L尿素、2 %聚乙二醇辛基苯基醚和60mo1 /L二硫苏糖醇的混合溶液； 所述裂解液加入体积与所述新鲜蚕豆幼苗叶片质量比为1:1。3. 如权利要求1或2任一项所述的蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在 于，步骤9)中，所述蛋白浓度标准曲线以牛血清蛋白为标准蛋白，以Bradford方法绘制。4. 如权利要求3所述的蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，所述考 马斯亮蓝蛋白试剂包括:质量浓度为0.01 %的考马斯亮蓝G-250，质量浓度为4.75%的乙醇 和质量浓度为8.5 %的磷酸;所述反应时间为5min，检测波长为595nm。5. 如权利要求4所述的蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，所述蛋 白样品水化液包括:7mo1 /L尿素，2mo1 /L硫脲，4 %CHAPS，65mmo1 /L二硫苏糖醇，0.2 %载体 两性电解质和0.001 %溴酚蓝。6. 如权利要求5所述的蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，步骤3) 中，所述提取缓冲液为含〇.〇7%β-巯基乙醇的10%三氯乙酸丙酮溶液;所述提取缓冲液加 入前先进行预冷;所述离心条件为4°C、20000Xg下离心20min。7. 如权利要求6所述的蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，步骤4) 和步骤5)中，所述静置条件均为-20°C条件下静置20min;所述离心条件均为4°C、20000Xg 下离心20min。8. 如权利要求7所述的蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，步骤8) 中，所述离心条件为4°C、12000Xg下离心15min;再次离心条件为4°C、12000Xg下离心lmin〇9. 如权利要求8所述的蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，所述步 骤2)中，将新鲜蚕豆幼苗叶片用液氮快速冷却后置于-20°C预冷后的研钵中研磨。10. 如权利要求9所述的蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，步骤 6)中，所述干燥方法为真空干燥lh;所述粉末为乳白色。
【专利摘要】本申请公开了蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法：取新鲜蚕豆幼苗叶片；液氮冷却研磨成粉；加入提取缓冲液，沉淀后取上清液离心，离心后弃上清液得到沉淀；再加入丙酮溶液，静置离心，弃上清液得到沉淀；干燥沉淀得到粉末；向粉末中加入裂解液；离心，取上清液再次离心，取上清液作为待分析溶液；测定待分析溶液中蛋白质的浓度；计算蛋白体积，分装保存；加入蛋白样品水化液水化，离心后即得。本申请填补了蚕豆叶片双向电泳技术的空白，为深入开展蚕豆蛋白质组学提供技术支持。本申请的技术方案，步骤简单，易于操作，重复性好，技术人员易学、易掌握。选用的实验试剂均为双向电泳常规试剂，无昂贵、稀有试剂，实验运作成本低。
【IPC分类】G01N1/28
【公开号】CN105486561
【申请号】CN201610024145
【发明人】李萍, 张雁霞, 刘玉皎
【申请人】青海省农林科学院
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年1月14日
【技术领域】
[0001] 本申请属于生物化学，具体地说，设及一种蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备 方法。
【背景技术】
[0002] 随着人类基因组计划的全面实施与推进，生命科学已经进入了后基因组时代，其 主要研究对象已转变为功能基因组学的研究。
[0003] 蛋白质组学(Proteomics) W活细胞内基因组编码的全部蛋白质为研究对象，是研 究生物体在特定时间或特定空间内所表达的全部蛋白质的特征，包括蛋白表达水平，翻译 后修饰，蛋白质与蛋白质或与其他生物分子的相互作用等，是掲示植物与环境之间相互作 用分子机制的一种新手段，其研究被认为是后基因组时代生命科学研究的核屯、内容之一且 日趋成为研究热点而备受关注。
[0004] 双向电泳（two-dimensional electro地oresis，2-DE)可W对生物细胞或组织全 蛋白质表达进行定性或定量的综合分析，尤其是用于掲示不同条件下蛋白质表达的变化。 作为蛋白组学研究中的核屯、技术之一，是对蛋白质组分辨率最高、重复性最好的分离技术， 也是目前常用的唯一一种能够连续在一块胶上分离数千种蛋白质的方法，广泛应用于生物 学研究的各个方面。然而双向电泳步骤繁琐，影响因素较多，蛋白质样品的制备是双向电泳 的第一步，也是最重要的一步，样品制备的好坏直接影响到随后蛋白的分离及最后分析结 果的可靠性。目前并没有一个通用的制备方法，样品制备方法要根据不同实验材料进行选 择，不同的材料所适用的方法也不同。样品制备分为蛋白质的提取、裂解液配方的选择、杂 质的去除等步骤，在处理某种样品的时候，如果运些步骤中的任何一步没有充分完成，分离 可能不完全或失败，并且，一些信息也可能丢失。因此建立有效的样品制备方法，高分辨地 分离蛋白质一直是植物蛋白质组学研究中双向凝胶电泳技术不断改进的方向。
[0005] 双向电泳技术早期主要应用于细菌、动物组织和细胞全蛋白质组分的分析，近年 来在植物中的应用亦有不少报道，但大多集中于水稻、小麦等模式植物或其它一些草本植 物上，在豆科植物中报道较少，研究多集中在油料作物大豆、牧草植物黄花首猜、截形首猜、 菜饲兼用作物魏豆等植物上，但设及蚕豆蛋白质组的研究鲜见报道。
[0006] 蚕豆能适应冷凉气候和多种±地条件，与根瘤菌形成固氮共生体为自身和后作作 物提供无偿可利用的氮源，有生物固氮之王的美誉，具有高蛋白含量，易消化吸收，粮、饲、 菜兼用和深加工增值等特点，是种植业结构调整中重要的间套作和养地作物。蚕豆关于蛋 白方面研究起步较晚，主要研究集中在食品加工级别的蛋白提取、分离、功能特性研究等方 面，而在蛋白质组学方面只有理论综述，而没有实质性的工作进展。开展蚕豆蛋白质组学研 究对于深入研究蚕豆生长发育机理，抗逆性研究、遗传育种都具有重要的理论意义和实用 价值。因此，为了加快蚕豆蛋白质组学研究步伐，为蚕豆蛋白质组学研究奠定理论基础和技 术指导需要尽快着手建立一种适合于蚕豆蛋白质组学分析的样品制备方法，为深入开展蚕 豆蛋白质组学研究提供技术支撑，迈出开展蚕豆双向电泳技术的第一步。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本申请所要解决的技术问题是现有技术中没有通用、有效、适合于蚕豆 的蛋白质组学分析样品的制备方法。提供一种适合蛋白质组学分析的蚕豆叶片样品制备方 法。
[0008] 为了解决上述技术问题，本申请公开了一种蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备 方法，包括W下步骤：
[0009] 1)取新鲜蚕豆幼苗叶片。
[0010] 2)将所述新鲜蚕豆幼苗叶片用液氮快速冷却并研磨成粉末。
[0011] 3)向步骤2)所述粉末中加入提取缓冲液，满旋混匀后-20°c过夜沉淀，过夜后的样 品弃去沉淀，取上清液离屯、，离屯、后弃去上清液，得到沉淀。
[0012] 4)向步骤3)得到的沉淀中加入含0.07%β-琉基乙醇的-20°c预冷丙酬溶液，捣碎 沉淀，使所述沉淀与丙酬溶液充分接触，然后将沉淀满旋混匀，静置，然后离屯、，弃去上清 液，得到沉淀。为了尽可能地去除蛋白沉淀中的干扰物质，得到符合双向电泳要求的蛋白质 样品，可重复此步骤1次。
[0013] 5)向步骤4)得到的沉淀中加入含0.07 %β-琉基乙醇的-20°C预冷的90 %丙酬溶 液，满旋混匀后捣碎沉淀，静置，然后离屯、，弃去上清液，得到沉淀。为了尽可能地去除蛋白 沉淀中的干扰物质，得到符合双向电泳要求的蛋白质样品，可重复此步骤1次。
[0014] 6)将步骤5)得到的沉淀干燥，得到粉末。
[0015] 7)向所述粉末中加入裂解液，23°C静置2.化，然后满旋混匀，得到样品裂解溶液。
[0016] 8)将步骤7)得到的样品裂解溶液离屯、，吸取上清液，将所述上清液再次离屯、，取上 清液作为待分析溶液。
[0017] 9)绘制蛋白浓度标准曲线，取待分析溶液与考马斯亮蓝蛋白试剂反应，测定吸光 度值，根据所述蛋白浓度标准曲线计算得到待分析溶液中蛋白质的浓度。
[0018] 10)按电泳上样量9(K)yg，计算蛋白体积，并分装到化1的小管中，然后于-80°c保 存；
[0019] 蛋白体积(μ1 )= 90化g/待分析溶液中蛋白质浓度。
[0020] 11)从-80°c取出蛋白样品，自然融化后按上样总体35化1和蛋白体积，计算出水化 液体积，加入蛋白样品水化液，在4°C、12000 X g下离屯、15min，即得；
[0021] 水化液体积=35化^蛋白体积。
[0022] 进一步的，所述步骤2)中，将新鲜蚕豆幼苗叶片用液氮快速冷却后置于-20°C预冷 后的研鉢中研磨。
[0023] 进一步的，步骤3)中，所述提取缓冲液为含0.07%β-琉基乙醇的10%Ξ氯乙酸丙 酬溶液;所述提取缓冲液加入前先进行预冷;所述离屯、条件为4°C、20000 X g下离屯、20min。
[0024] 进一步的，步骤4)中，所述静置条件为-20°C条件下静置20min;所述离屯、条件为4 °C、20000Xg下离屯、20min。
[0025] 进一步的，步骤5)中，所述静置条件为-20°C条件下静置20min;所述离屯、条件为4 °C、20000Xg下离屯、20min。
[00%]进一步的，步骤6)中，所述干燥方法为真空干燥化;所述粉末为乳白色。
[0027] 进一步的，步骤7)中，所述裂解液为8mol/L尿素、2%聚乙二醇辛基苯基酸(Triton X-100)和60mol/L二硫苏糖醇(DTT)的混合溶液;所述裂解液加入体积与所述新鲜蚕豆幼苗 叶片质量比为1:1。
[0028] 进一步的，步骤8)中，所述离屯、条件为4°C、12000 X g下离屯、15min;再次离屯、条件 为 4°C、12000Xg下离屯、lmin。
[0029] 进一步的，步骤9)中，所述蛋白浓度标准曲线W牛血清蛋白为标准蛋白，参考 化a壯ord的方法绘制。
[0030] 进一步的，所述考马斯亮蓝蛋白试剂包括：质量浓度为0.01 %的考马斯亮蓝G-250，质量浓度为4.75 %的乙醇和质量浓度为8.5 %的憐酸;所述反应时间为5min，检测波长 为595nm。
[0031] 进一步的，所述蛋白样品水化液包括:7mol/L尿素，2mol/L硫脈，4%的3-3-胆酷胺 基丙基二甲基锭基-1-丙横酸盐(CHAPS)，65mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，0.2%载体两性电解 质αPGbuffer)和0.001%漠酪蓝。
[0032] 与现有技术相比，本申请可W获得包括W下技术效果：
[0033] 1)本申请W蚕豆叶片为实验材料，W获得符合蛋白质组学分析的样品制备方法为 目的，填补了蚕豆叶片双向电泳技术的空白，为深入开展蚕豆蛋白质组学提供技术支持。
[0034] 2)本申请的技术方案，步骤简单，易于操作，重复性好，技术人员易学、易掌握。
[0035] 3)本申请中选用的实验试剂均为双向电泳常规试剂，无昂贵、稀有试剂，实验运作 成本低。
[0036] 当然，实施本申请的任一产品必不一定需要同时达到W上所述的所有技术效果。
【附图说明】
[0037] 此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申 请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
[0038] 图1为本申请蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法实施例1的蛋白浓度标准 曲线图；
[0039] 图2为本申请蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法实施例1得到的蛋白样品 的2-DE电泳图。
【具体实施方式】
[0040] W下将配合附图及实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用 技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据W实施。
[0041] 实施例一本申请的蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法
[0042] 本申请公开的蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法，包括W下步骤:称取蚕 豆幼苗叶片^液氮研磨^提取缓冲液^离屯、弃上清^丙酬沉淀^真空干燥沉淀^加入裂 解液^离屯、取上清^蛋白定量^分装冷冻^样品水化^样品制备完成。
[0043] (1)用电子天平准确称取蚕豆叶片鲜样2. Og。
[0044] (2)将研鉢提前放置-20°C冰箱预冷，将步骤（1)称量好的蚕豆叶片鲜样放置在预 冷的研鉢中用液氮快速冷冻并充分研磨至细粉。
[0045] (3)将步骤(2)研磨好的粉末快速转移到50ml离屯、管中，加入预冷的25ml提取缓冲 液(10%TCA/丙酬+0.07%β-琉基乙醇），满旋混匀后放置在-20°C环境下过夜沉淀。
[0046] (4)取出步骤(3)过夜沉淀后的样品，弃去沉淀，取上清液，按1ml/管分装成24管， 在4°C、20000 X g下离屯、20min，弃去上清液。
[0047] (5)向步骤(4)得到的沉淀中加入25ml含0.07%β-琉基乙醇的-20°C预冷丙酬，然 后用剪去尖头的1ml枪头将沉淀轻轻捣碎，使沉淀与丙酬充分接触后，转移使其减少至12 管。满旋混匀后在-20°C条件下静置20min，静置结束后在4°C、20000Xg下离屯、20min，弃去 上清液，重复此步骤1次，同时转移使其减少至6管。
[004引 （6)向步骤（5)得到的6管沉淀中加入40ml含0.07 % β-琉基乙醇的90 %预冷的丙 酬，满旋混匀后用剪去尖头的枪头将沉淀捣碎，并减少样管至4管后-20°C静置lOmin，静置 结束后在4°C、20000Xg下离屯、20min，弃去上清液，重复此步骤1次，同时转移使其减少至2 管。
[0049] (7)将步骤(6)得到的2管沉淀真空干燥化，得到2管乳白色粉末。
[0050] (8)向步骤(7)得到的2管粉末中各自加入2ml裂解液(8mol/L尿素、2%化iton X-100和60mol/L DTT的混合溶液)在23°C环境下放置2.化，期间满旋混匀2-3次，使沉淀裂解 充分。
[0051] (9)裂解结束后，将步骤(8)得到的2管样品裂解溶液分别在4°C、12000Xg下离屯、 15min，吸取上清液，并将2管上清液转移至1管后在4°C、12000 X g下离屯、Imin，吸取上清液， 作为待分析样品溶液。
[0052] (10)参考化adford的方法进行蛋白定量，W牛血清蛋白为标准蛋白绘制标准曲 线，取待分析样品溶液与CBB蛋白试剂(质量浓度为0.01 %的G-250，质量浓度为4.75 %的乙 醇和质量浓度为8.5 %的憐酸)反应5min，在595nm波长下测定吸光值，根据标准曲线测定上 清液中蛋白质的浓度。制作标准曲线的数据如表1所示，标准曲线图如图1所示。
[0053] 表1标准曲线的制作 [0化4]
[0化5]样品蛋白含量 X(yg) = (Y-〇. 0108)/0.015
[0056]样品蛋白浓度(ygM)=X/样品体积(μ1)
[0化7] (11)按叶片蛋白总上样量90化邑，上样总体35化1，计算蛋白体积，并分装后-80°c 保存。
[005引样品蛋白体积(μ 1 )= 90化g/样品蛋白浓度
[0059] (12)从-80°C取出蛋白样品，自然溶解后按蛋白体积计算出水化液体积(水化液体 积=350μ 1-蛋白体积），加入适量体积的蛋白样品水化液（7mo 1 /L尿素，2mo 1 /L硫脈，4% CHAPS，65mmo 1/L DTT，0.2 % IPCibuf f er，0.001 % 漠酪蓝），在4°C、12000 X g下离屯、15min。
[0060] 将本申请制备方法中蛋白提取方法与现有技术进行比较。现有技术中的两种提取 方法一-直接提取法和丙酬提取法的具体提取方法如下：
[0061] (1)直接提取法
[0062] 取蚕豆叶片30化旨，液氮研磨至细粉状，加入30mg水不溶性PVP用于色素吸附，悬浮 于900μ1 的蛋白质提取液(50mmo 1 · [1，Tri S-HCL，P册.8，10 % 甘油，0.5 % SDS，5 %β-琉基乙 醇）中，4°C浸提化，4°C，13000r · min-i离屯、15min，取上清，分装，直接用于电泳或-80°C保 存。
[0063] (2)丙酬沉淀法
[0064] 在直接提取法得到的上清液中加入3倍体积的含0.07%β-琉基乙醇的预冷的丙 酬，混匀，-20°C沉淀蛋白质1.化，4°C，15300r · min-i离屯、15min，弃上清，沉淀用80 %、100% 的丙酬各洗1次，-20°C放置，待丙酬完全挥发后收集蛋白质干粉，小量分装，冻存于-80°C。
[0065] 表2 Ξ种提取方法提取结果比较
[0066]
[0067] 从表2可W看出，本申请的蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法，提取的蛋白 浓度和蛋白总产量均远远高于传统的直接提取法和丙酬提取法，其中蛋白浓度是传统方法 的1.5倍左右;蛋白总产量是传统方法的3倍左右。
[0068] 本申请采用方法制备得到的蛋白样品进行双向电泳，结果如图2所示。本申请采用 方法提取的蛋白样品符合双向电泳蛋白浓度6-化g/μL的浓度范围，获得的双向电泳图谱蛋 白质点多且清晰。
[0069] 本申请W蚕豆叶片为实验材料，W获得符合蛋白质组学分析的样品制备方法为目 的，填补了蚕豆叶片双向电泳技术的空白，为深入开展蚕豆蛋白质组学提供技术支持。本申 请的技术方案，步骤简单，易于操作，重复性好，技术人员易学、易掌握。选用的实验试剂均 为双向电泳常规试剂，无昂贵、稀有试剂，实验运作成本低。
[0070] 如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术 人员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不 W名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的"包含"为 一开放式用语，故应解释成"包含但不限定于"。"大致"是指在可接收的误差范围内，本领域 技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续 描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃W说明本申请的一般原则为目的，并非 用W限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
[0071] 还需要说明的是，术语"包括"、"包含"或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的 包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确 列出的其他要素，或者是还包括为运种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情 况下，由语句"包括一个……"限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还 存在另外的相同要素。
[0072]上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请 并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、 修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识 进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申 请所附权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 取新鲜蚕豆幼苗叶片； 2) 将所述新鲜蚕豆幼苗叶片用液氮快速冷却并研磨成粉末； 3) 向步骤2)所述粉末中加入提取缓冲液，涡旋混匀后-20°C过夜沉淀，过夜后的样品弃 去沉淀，取上清液离心，离心后弃去上清液，得到沉淀； 4) 向步骤3)得到的沉淀中加入含0.07%β-巯基乙醇的-20°C预冷丙酮溶液，捣碎沉淀， 使所述沉淀与丙酮溶液充分接触，然后将沉淀涡旋混匀，静置，然后离心，弃去上清液，得到 沉淀； 5) 向步骤4)得到的沉淀中加入含0.07 %β-巯基乙醇的-20°C预冷的90 %丙酮溶液，涡 旋混匀后捣碎沉淀，静置，然后离心，弃去上清液，得到沉淀； 6) 将步骤5)得到的沉淀干燥，得到粉末； 7) 向所述粉末中加入裂解液，23°C静置2.5h，然后涡旋混匀； 8) 将步骤7)得到的样品裂解溶液离心，吸取上清液，再次离心，取上清液作为待分析溶 液； 9) 绘制蛋白浓度标准曲线，取待分析溶液与考马斯亮蓝蛋白试剂反应，测定吸光度值， 根据所述蛋白浓度标准曲线计算得到待分析溶液中蛋白质的浓度； 10) 按叶片蛋白上样量900yg，计算蛋白体积，分装后-80°C保存； 蛋白体积(μL)=9〇〇yg/待分析溶液中蛋白质浓度； 11) 从-80°C取出蛋白样品，自然融化后按上样总体350μ1和蛋白体积，计算出水化液体 积，加入蛋白样品水化液，在4°C、12000Xg下离心15min，即得； 水化液体积=350μ1-蛋白体积。2. 如权利要求1所述的蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，步骤7) 中，所述裂解液为8mo1/L尿素、2 %聚乙二醇辛基苯基醚和60mo1 /L二硫苏糖醇的混合溶液； 所述裂解液加入体积与所述新鲜蚕豆幼苗叶片质量比为1:1。3. 如权利要求1或2任一项所述的蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在 于，步骤9)中，所述蛋白浓度标准曲线以牛血清蛋白为标准蛋白，以Bradford方法绘制。4. 如权利要求3所述的蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，所述考 马斯亮蓝蛋白试剂包括:质量浓度为0.01 %的考马斯亮蓝G-250，质量浓度为4.75%的乙醇 和质量浓度为8.5 %的磷酸;所述反应时间为5min，检测波长为595nm。5. 如权利要求4所述的蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，所述蛋 白样品水化液包括:7mo1 /L尿素，2mo1 /L硫脲，4 %CHAPS，65mmo1 /L二硫苏糖醇，0.2 %载体 两性电解质和0.001 %溴酚蓝。6. 如权利要求5所述的蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，步骤3) 中，所述提取缓冲液为含〇.〇7%β-巯基乙醇的10%三氯乙酸丙酮溶液;所述提取缓冲液加 入前先进行预冷;所述离心条件为4°C、20000Xg下离心20min。7. 如权利要求6所述的蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，步骤4) 和步骤5)中，所述静置条件均为-20°C条件下静置20min;所述离心条件均为4°C、20000Xg 下离心20min。8. 如权利要求7所述的蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，步骤8) 中，所述离心条件为4°C、12000Xg下离心15min;再次离心条件为4°C、12000Xg下离心lmin〇9. 如权利要求8所述的蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，所述步 骤2)中，将新鲜蚕豆幼苗叶片用液氮快速冷却后置于-20°C预冷后的研钵中研磨。10. 如权利要求9所述的蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，步骤 6)中，所述干燥方法为真空干燥lh;所述粉末为乳白色。
【专利摘要】本申请公开了蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法：取新鲜蚕豆幼苗叶片；液氮冷却研磨成粉；加入提取缓冲液，沉淀后取上清液离心，离心后弃上清液得到沉淀；再加入丙酮溶液，静置离心，弃上清液得到沉淀；干燥沉淀得到粉末；向粉末中加入裂解液；离心，取上清液再次离心，取上清液作为待分析溶液；测定待分析溶液中蛋白质的浓度；计算蛋白体积，分装保存；加入蛋白样品水化液水化，离心后即得。本申请填补了蚕豆叶片双向电泳技术的空白，为深入开展蚕豆蛋白质组学提供技术支持。本申请的技术方案，步骤简单，易于操作，重复性好，技术人员易学、易掌握。选用的实验试剂均为双向电泳常规试剂，无昂贵、稀有试剂，实验运作成本低。
【IPC分类】G01N1/28
【公开号】CN105486561
【申请号】CN201610024145
【发明人】李萍, 张雁霞, 刘玉皎
【申请人】青海省农林科学院
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年1月14日
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