荧光增敏剂的制作方法

荧光增敏剂的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于化学分析领域，具体涉及一种用于黄曲霉毒素Mi荧光分析的荧光增敏剂。
【背景技术】
[0002]黄曲霉毒素MjAflatoxin MbAFM!)是哺乳动物摄入黄曲霉毒素BjAflatoxin Βι,AFBi)污染的食物后，经肝脏细胞色素P450等相关酶代谢，发生II相反应形成的羟基化代谢产物，毒性仅次于AFBi。1993年，六?11被世界卫生组织(WT0)国际癌症研究机构(IARC)列为2B类致癌物质，2002年被提至I类致癌物，其严重威胁到人体的健康。AFMi主要存在于哺乳动物的乳汁、尿液等排泄物中，通常动物在摄入AFBd2?24小时后即可检测出AFMi AFMr污染主要存在于乳及乳制品中，而人类尤其是婴幼儿对乳制品的接触率极高，危害极大，因此世界各国对AFMi的限量标准一直非常严格。CAC国际标准规定牛奶中的AFMi限量为0.5yg/kg，我国、美国和日本等很多国家也规定乳及乳制品中AFMi限量标准为0.5yg/kg，欧盟制定的标准更为严格，乳及乳制品中限量为0.05yg/kg，婴幼儿配方奶以及改进配方奶中限量为
0.025yg/kg，具有特殊医疗目的的婴幼儿食品中限量为0.025yg/kg。为保障乳品安全，AFMi检测技术的灵敏度和准确性一直要求极高。
[0003]目前对于黄曲霉毒素的荧光增敏主要是对AFB^AFGi等黄曲霉毒素借助光化学等衍生设备或三氟乙酸等强酸、卤族元素等强氧化剂、环糊精(CDs)等增强AFB^AFGd^荧光强度或降低基质屏蔽、干扰作用达到提高灵敏度的目的，同时兼顾准确定量和快速检测，在常规实验室或者现场实地可以进行应用推广。其中，三氟乙酸通常作为高效液相色谱法柱前衍生试剂，具有毒性、强腐蚀性和极易挥发性，需要较严格的衍生条件和操作技术(如避光、高温等)；卤族元素等强氧化剂(饱和碘溶液、溴水、过溴化吡啶溴等)和光化学在线衍生的设备，通过衍生设备和一定的衍生条件将AFB^AFGi这两种黄曲霉毒素的不饱和双键结构转化成饱和结构(AFBi转化成AFB2a，AFG1转化成AFG2a)，衍生物富含大量羟基，且电子云与芳环上的η轨道平行，扩大了共轭双键体系，增强了 AFs的天然荧光值，提高了检测的灵敏度，用于高效液相色谱在线检测或柱后衍生技术。AFMi本身性质和结构与AFB^AFGi存在较大差异，缺少双键不饱和结构，这些技术无法对AFMi实现衍生和荧光增敏效应。
[0004]环糊精具有巨大的空穴尺寸和内腔的疏水性，可对AFs客体分子进行分子识别，形成超分子复合物，避免荧光分子与水性溶剂接触发生淬灭的特性，具有荧光增强作用，检测灵敏度被大大提高。近几年有一些此类报道对AFMi进行荧光增强和基质屏蔽继而增强分析的灵敏度的应用研究报道。刘雪芬等(Liu X.F..ffu'han,Chinese Academy ofAgricultural Sciences(武汉:中国农业科学院),2011.)得出2，6-二甲基-β-环糊精使AFMi的焚光强度增加0.5倍，C.Cucci等(Cucci C.,Mignani A.G.，Dal 1 ’ Asta C , etal.Chem.,2007,126(2) ,467-472)将丁二酰化-β-环糊精(β-CD-SU)应用于测定微量的AFMi，结果显示荧光强度可增强1.5倍，但应用过程和测定速度受到温度和待测介质的影响，不能稳定应用，且测定时间常随温度的变化而变化。因此，有必要对AFMi的荧光分析方法进行改进完善。

【发明内容】

[0005]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种黄曲霉毒素见的荧光增敏剂，所述荧光增敏剂能够显著提高AFMi荧光检测的强度。
[0006]本发明采取的技术方案如下:
[0007]1、黄曲霉毒素施荧光增敏剂，由甲基-β_环糊精和含Hg2+的溶液组成，甲基-β-环糊精^?]?1摩尔比为5.8\105:1，取2+:六?]\11的摩尔比为6.6\104:1。
[0008]优选的，所述荧光增敏剂的加入顺序为先加入Hg2+，混匀后再加入甲基-β_环糊精。[0009 ] 2、含有黄曲霉毒素施的荧光增敏剂的黄曲霉素施待测溶液。
[0010]优选的，所述黄曲霉毒素Μι待测溶液为含有黄曲霉毒素施的荧光增敏剂的甲醇/水溶液，所述甲醇/水溶液中甲醇的体积百分数为20 %。
[0011]3、检测黄曲霉素见待测溶液体系荧光强度的方法，将所述黄曲霉毒素施待测溶液在激发波长为365nm，发射波长为410nm的条件下测量荧光强度，并计算黄曲霉毒素见的含量。
[0012]本发明的有益效果在于:本发明的AFMi荧光增敏剂是β-环糊精及其衍生物与金属离子共同作用于AFMiB成三元络合物，不受AFB^AFGj^双键不饱和结构制约和限制，且不受温度等影响，可以快速灵敏、准确稳定的增强AFMi的荧光强度。
[0013]本发明所述Hg2+-M-13_CD荧光增敏剂对黄曲霉毒素施荧光增强的效果显著，且反应快速。AFM^测溶液体系在0.01?2yg/L浓度范围内相关系数R可达至1」0.999以上，检出限为
0.0026yg/L，这低于一般衍生方法的检出限。本发明所述一种快速、灵敏、经济的荧光增强剂有望直接用于检测奶制品中的AFMi，为AFMi的快速检测提供了新思路和新途径。本试验建立了一种针对AFMi检测的新型衍生方法，与以前的衍生方法相比，该衍生试剂具有寿命长、腐蚀性低、不挥发、反应迅速、荧光增强效果好等优点。
【附图说明】
[0014]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图:
[0015]图1不同β-CD对黄曲霉毒素施待测溶液荧光体系的影响；
[0016]图2Μ-β-⑶、HgCl2与AFM^质的量比对体系荧光强度的影响；
[0017]图3不同甲醇/水比例对体系荧光强度的影响；
[0018]图4衍生顺序对AFMi体系荧光强度的影响；
[0019]图5AFMi标准曲线与荧光增强后的标准曲线。
【具体实施方式】
[0020]下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0021 ] 1、仪器与试剂
[0022]F-2500荧光分光光度仪(日本日立公司)；分析天平(精度0.0OOlg，上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂)；超纯水发生器(Mill1-QAlOSystem Millipore公司，法国)。
[0023]AFMi标准品(sigma);甲醇(色谱纯，天津四友精细化学品有限公司)；乙腈(色谱纯，天津四友精细化学品有限公司);β-环糊精(β-⑶)、甲基-β-环糊精(Μ-β-⑶)、羟丙基-β-环糊精(ΗΡ-β-CD)、羟乙基-β-环糊精(ΗΕ-β-CD)、磺丁基-β-环糊精(SBE-13-CD)、羧甲基-β-环糊精(CM-13-CD)、聚合-β-环糊精(β-CDP)(分析纯，山东智源生物科技有限公司)。
[0024]氯化汞(HgCl2，分析纯，贵州铜仁汞试剂公司)；氯化钠(NaCl)、氯化钾(KC1)、氯化镁(MgCl2)、氯化钙(CaCl2)、氯化铁(FeCl3)(分析纯，成都市科龙化工有限公司)。
[0025]2、溶液的配置
[0026]AFMiS液配制:将lmg AFM^lmL乙腈溶解，配制成质量浓度为lOtg/L的AFM^液，再取10yL 106yg/L AFMi溶液，加甲醇到lmL，配成lOtg/l的标准储备液，密封后于4°C下避光保存。使用时，准确移取lOOyL标准储备液于25mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成质量浓度为40yg/L的标准工作液。
[0027]3、荧光光谱扫描方法
[0028]取lmL混合均匀的AFMi样液，用1.0cm荧光石英比色皿放置在荧光分光光度计中进行荧光发射光谱、激发光谱的扫描(激发光源为150W氙弧灯；响应时间自动 ；扫描速度:1500nm/min;扫描光谱进行仪器自动校正)，狭缝均置为5nm。固定365nm波长，扫描样液的荧光发射光谱(EM);固定410nm波长，扫描样液的最佳激发光谱(EX)。
[0029]4、荧光值测定方法
[0030]根据荧光光谱扫描的结果固定最佳激发波长和最佳发射波长，狭缝宽均为5nm，取lmL待测液，用1.0cm荧光用石英比色皿测荧光强度。
[0031 ] 5、不同β_⑶对体系荧光的影响
[0032]按荧光值测定方法先测50%甲醇水比例下0.004mol/Li3-⑶s的荧光本底值。再取500yL4yg/L AFMi，加入 100yL 0.01mol/L HgCh和400ul 0.0lmol/L β-CDs，混匀，放置lmin后，测其荧光值。结果见图1，由图1可看出浓度相同的不同β-CD对黄曲霉毒素见待测溶液(AFM1-Hgh-e-CDs)体系的荧光增强效果不同。CM-β-环糊精和聚合-β-环糊精荧光本底值较高，不符合做荧光增强剂的基本要求。另外五种环糊精体系的荧光值虽然相差不大，但是有极显著性差异(Ρ〈0.01)。考虑到要满足荧光本底值低，体系荧光强度高的要求，选用Μ-β-CD作为该体系的荧光增强剂，且Μ-β-CD具有在水中的溶解度高、低吸湿性和高表面活性等特性。
[0033]6、M-0_CD、HgCl2与AFMi摩尔比对体系荧光的影响
[0034]取50yL40yg/L AFM!，固定0.01mol/L HgCl2的用量，再分别加入 100、200、300、350、400、450、500、600yL 0.0lmol/L的Μ-β-CD;得出Μ-β-CD的最佳体积后，再利用该体积，加入10、20、30、40、50、60、70yL的0.0lmoVL的HgCl2，从而得出不同物质的量之比对荧光强度的影响，结果见图2。由于Hg是重金属，在环境中不易降解，要尽量减少HgCl2的用量，而包合反应是可逆反应，体系中反应物浓度高有利于化学反应快速完成，因此确定0.0lmol/LM-0-CD、HgCl2的加入量分别为350yL和4OyL，M-0-CD、HgCl2与AFM^物质量之比为5.8 X105:1、6.6 X 104:1，在该条件下黄曲霉毒素施待测溶液体系的荧光值达到最大且趋于稳定。
[0035]7、甲醇比例对体系荧光的影响
[0036]取6支试管，均加入50yL40yg/L AFMi,40yL 0.0lmol/L HgCl2，混匀后加入350μ1^).0111101/1^-0)8，再依次加入0、50、150、250、350、45(^1^甲醇，混匀后再依次加水到11^，采用荧光值测定方法测其荧光值，结果见图3 JFMi易溶于甲醇、乙腈、氯仿等少数有机溶剂，但在水中溶解度极低并易发生荧光淬灭。β-CDs易溶于水，可以增加AFM^水相中的溶解度，同时也可以保护AFMj^荧光不被淬灭。在实验过程中，选择合适的甲醇/水比例，可以达到更好的荧光增强效果。实验结果见图3，从图3可知，当甲醇比例为20%时，反应快速(几分钟就能完成)，反应稳定，荧光增强幅度最大，所以选择20%甲醇/水比例作为体系的最佳比例。
[0037]8、Hg2+和Μ-β-⑶加入顺序(衍生顺序)对体系荧光的影响
[0038]在AFMi荧光增强中，不同的衍生顺序可能会对体系荧光值有一定的影响，本试验按以下二种方法进彳丁衍生:①先加HgCl2，混勾后再加入M-β-⑶;②先加M-β-⑶，混勾后再加AHgCb ；③先将HgCl2和Μ-β-⑶混匀，再加入AFMjP—定的甲醇和水到lmL，按荧光值测定方法测定体系的荧光强度。
[0039]结果见图4，图4显示衍生方法①比②和③的荧光增强效果好，且能在较短时间内达到稳定。其原因可能是AFMi先与Hg2+形成配位体，该配位体分子在疏水作用力、范德华力以及氢键等作用力下进入Μ-β-⑶空腔中，被包合形成三元络合物。先加入Μ-β-⑶，Μ-β-CD空腔保护了AFMi，从而不能与HgCl2完全螯合，因此不能达到最大荧光增强效果。
[0040]9、AFMi 与加入 Hg2+-M-0-CD 后的线性
[0041 ] 在最佳条件下，采用荧光值测定方法测定AFMi以及AFM1-HgCh-M-β-⑶体系在不同浓度下的荧光强度，见图5。在扣除背景干扰后，在0.01?2yg/L浓度范围内，荧光增强前AFMi的线性方程为:F = 21.904Cafmi+156.74，R = 0.9994 ；加入荧光增强剂后，AFMj#测溶液体系的线性方程为:F = 300.86Cafmi+170.51，R = 0.9996。焚光增强前后的相关系数均达到
0.999以上。HgCl2-M-f3-⑶荧光增强剂对微量的AFMi检测有很好的效果，以空白测定值3倍信噪比(S/N)计算AFMj#测溶液体系的检出限为0.0026yg/L。
[0042]通过试验结果可得，Hg2+-M-13_CD对黄曲霉毒素沁荧光增强的效果显著，且反应快速。利用光谱法、Benes 1-Hi ldebrand法、热力学方法、KI淬灭法等对超分子体系焚光增强机理进行了探索，得出AFMi先与Hg2+形成金属螯合物，再与Μ-β-CD形成1:1的超分子包合物，从而减少AFMi的荧光淬灭，增强其荧光发射强度，为实际检测AFMi提供一定的数据基础和理论依据。超分子体系在0.01?2yg/L浓度范围内相关系数R可达到0.999以上，检出限为0.0026yg/L，这低于一般衍生方法的检出限。本发明所述一种快速、灵敏、经济的荧光增强剂有望直接用于检测奶制品中的AFMi，为AFM^快速检测提供了新思路和新途径。
[0043]本试验建立了一种针对AFMi检测的新型衍生方法，与以前的衍生方法相比，该衍生试剂具有寿命长、腐蚀性低、不挥发、反应迅速、荧光增强效果好等优点。
[0044]最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1.黄曲霉毒素Mi荧光增敏剂，其特征在于，由甲基-β-环糊精和含Hg2+的溶液组成，甲基-β-环糊精:AFM^尔比为5.8X105:l,Hg2+: AFMi 的摩尔比为6.6 X 104:1。2.根据权利要求1所述黄曲霉素施荧光增敏剂，其特征在于，所述荧光增敏剂的加入顺序为先加入Hg2+，混匀后再加入甲基-β_环糊精。3.含有权利要求1所述的黄曲霉毒素施的荧光增敏剂的黄曲霉素施待测溶液。4.根据权利要求3所述黄曲霉素见待测溶液，其特征在于，所述黄曲霉毒素仏待测溶液为含有黄曲霉毒素施的荧光增敏剂的甲醇/水溶液，所述甲醇/水溶液中甲醇的体积百分数为 20%。5.检测权利要求3或4所述黄曲霉素施待测溶液体系荧光强度的方法，其特征在于，将所述黄曲霉毒素见待测溶液在激发波长为365nm，发射波长为410nm的条件下测量荧光强度，并计算黄曲霉毒素施的含量。
【专利摘要】本发明公开了一种黄曲霉毒素M1荧光增敏剂，由甲基-β-环糊精和含Hg2+的溶液组成，甲基-β-环糊精：AFM1摩尔比为5.8×105:1，Hg2+：AFM1的摩尔比为6.6×104:1。本发明所述Hg2+-M-β-CD荧光增敏剂对黄曲霉毒素M1荧光增强的效果显著，且反应快速。AFM1待测溶液体系在0.01～2μg/L浓度范围内相关系数R可达到0.999以上，检出限为0.0026μg/L。本发明所述一种快速、灵敏、经济的荧光增强剂有望直接用于检测奶制品中的AFM1，为AFM1的快速检测提供了新思路和新途径。
【IPC分类】G01N21/64
【公开号】CN105486672
【申请号】CN201610036628
【发明人】马良, 张宇昊
【申请人】西南大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年1月20日