一种蛋白质快速检测试剂盒及其检测方法和应用
一种蛋白质快速检测试剂盒及其检测方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学检测的技术领域，具体设及一种蛋白质快速检测试剂盒及其 检测方法和应用。
【背景技术】
[0002] 蛋白质是一切生命的物质基础，是人体组织更新和修补的主要原料，蛋白质与各 种形式的生命活动紧密的联系在一起，具有极其重要的生理学意义。同时，蛋白质又是重要 的营养素之一，食物中的蛋白质是人体摄入氮的唯一来源，具有其他营养物质不可替代的 作用。近些年来，食物中蛋白质渗杂渗假事件时有发生，对人体造成极了严重的伤害，所W， 建立快速、准确、操作简单的蛋白质检测方法已迫在眉睫。
[0003] 目前，食品蛋白质检测的权威方法是凯氏定氮法，该方法也是食品蛋白质检测的 国家标准方法(GB5009.5)，但是该方法操作繁琐，时间长(4-8小时），并且反应过程中会产 生大量的有毒气体，不利于环境安全，对操作环境、设备W及操作人员的技能要求较高。在 生物医学领域，关于分光光度法测定蛋白质的研究有很多，其中的双缩脈分光光度法应用 于蛋白质的测定已有近百年的历史，该法作为我国农业标准(NY/T1678)乳与乳制品中蛋白 质的测定方法，对蛋白质的检出限为5 X l(T5g/100g。双缩脈法测定蛋白质的原理是当物质 中含有两个或者两个W上肤键时会和碱性的硫酸铜溶液发生反应，生成紫色的大分子络合 物，该产物是肤键中的氮原子和铜离子配价结合的结果，其颜色深浅与物质中所含的蛋白 质含量成正比，所W可W根据产物吸光值的变化来测定蛋白质含量。双缩脈分光光度法具 有操作简单，重复性好，反应所用试剂单一、稳定，不同种类的蛋白质产物颜色深浅相近，并 且干扰物质少，受溫度影响极小等优点，可W快速地测定蛋白质含量。但是双缩脈分光光度 法存在一些较为严重的缺陷，该方法虽然检测时间较短（20~30分钟），但是检测灵敏度较 差，在测量低蛋白含量的样品时有一定的困难。
【发明内容】
[0004] 为解决上述蛋白质检测技术存在不足的技术问题，本发明提供了一种检测迅速、 检测灵敏度高的蛋白质快速检测试剂盒及其制备方法和应用。
[0005] 本发明提供了一种蛋白质快速检测试剂盒，该检测试剂盒包括双缩脈试剂、表面 活性剂和助表面活性剂。
[0006] 优选的，表面活性剂为吐溫60、吐溫80、聚乙二醇辛基苯基酸、十二烷基苯横酸钢 中的一种。
[0007] 优选的，助表面活性剂为无水乙醇、正丙醇、正下醇、正己醇、正辛醇、乙二醇、丙二 醇、甘油、聚甘油醋中的一种或两种W上。
[000引本发明还提供了一种蛋白质快速检测试剂盒的检测方法，该检测方法包括W下步 骤：
[0009] (1)将表面活性剂和助表面活性剂按质量比1-100:1混合均匀，得到混合表面活性 剂;将混合表面活性剂和油相按质量比1-10:1-10混合后，加入去离子充分溶解，制得微乳 液；
[0010] (2)将上述制得的微乳液和双缩脈试剂按体积比1:1-100混合均匀，得到双缩脈-微乳体系显色液；
[0011] (3)在标准蛋白质溶液各梯度样品和待测样品中加入上述制得的双缩脈-微乳体 系显色液，测定其吸光值，W标准蛋白质溶液各梯度样品的浓度和吸光值拟合标准曲线，将 待测样品的吸光值代入标准曲线中计算蛋白质含量。
[0012] 优选的，表面活性剂为吐溫60、吐溫80、聚乙二醇辛基苯基酸、十二烷基苯横酸钢 中的一种。
[0013] 优选的，助表面活性剂为无水乙醇、正丙醇、正下醇、正己醇、正辛醇、乙二醇、丙二 醇、甘油、聚甘油醋中的一种或两种W上。
[0014] 优选的，油相为大豆油、橄揽油、甲酸乙醋、乙酸乙醋、丙酸乙醋、下酸乙醋、甘油Ξ 酸醋、油酸乙醋中的一种或两种W上。
[001引步骤(2)中双缩脈试剂包含:5-80g/L的氨氧化钟或氨氧化钢、1.0-6.0g/L的硫酸 铜、3-12g/L的酒石酸钟钢或乙二胺四乙酸二钢。
[0016] 本发明还提供了一种蛋白质快速检测试剂盒的应用，所述检测试剂盒用于检测含 蛋白质样品中的蛋白质含量。
[0017] 本发明的有益效果:本发明在双缩脈试剂中添加微乳液，微乳液具有增溶、增敏的 特性，使得改进后的双缩脈法具有灵敏度高、操作简单、干扰物少、重复性好的优点。该检测 方法对蛋白质的检测灵敏度与传统方法相比提高5-10倍，可W应用于微量蛋白质样品的检 巧。，与国标凯氏定氮法比较，其相对误差在0.28-0.60%之间，本发明的检测方法具有良好 的精确度与准确度。
【附图说明】
[0018] 图1为本发明制备的双缩脈-微乳体系与传统双缩脈溶液的吸收光谱比较，其中A 为双缩脈-微乳体系的吸收光谱;B为传统双缩脈溶液的吸收光谱。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例对本发明进行详细地解释说明。
[0020] 实施例1
[0021] 采用本发明的检测试剂盒，配制吐溫80微乳体系-双缩脈显色液，进行样品蛋白质 的测定。
[0022] (1)吐溫80微乳液体系溶液的制备
[0023] ①混合表面活性剂溶液的制备
[0024] 准确称取0.25g吐溫80非离子表面活性剂和0.25g无水乙醇两者混合制成混合表 面活性剂。
[0025] ②混合表面活性剂与油相混合溶液的制备
[0026] 选择下酸乙醋为乳液体系的油相，向上述混合表面活性剂中加入0.05g的下酸乙 醋。
[0027]③混合表面活性剂/油相与水相微乳液体系的制备
[00%]将上述吐溫80、无水乙醇和下酸乙醋的混合液，室溫下揽拌，边揽拌边滴加去离子 水，当混合液由浑浊变为澄清透明溶液时停止滴加去离子水。
[0029] (2)双缩脈试剂的制备
[0030] 称取硫酸铜（CuS〇4 · 5此0)1.5g和酒石酸钟钢化化C4H4O6 · 4此0)6.0g，用500mL蒸 馈水溶解，在揽拌下加300mL质量百分数10%化0H，用水稀释到lOOOmL，储存于塑料瓶中（或 内壁涂有石蜡的瓶中），此试剂可长期保存。若储存瓶中有黑色沉淀出现，则需重新配制。
[0031] (3)双缩脈-微乳体系显色液的制备
[0032] 选取上述制备的吐溫80微乳体系溶液和双缩脈溶液按照体积比1:100配制成吐溫 80微乳体系-双缩脈显色液显色液。
[0033] (4)样品测定
[0034] 在标准蛋白质溶液各梯度样品和待测样品中加入上述制得的双缩脈-微乳体系显 色液(每毫升蛋白质样品中加入4mL的双缩脈-微乳体系显色液），测定其吸光值，W标准蛋 白质溶液各梯度样品的浓度和吸光值拟合标准曲线，将待测样品的吸光值代入标准曲线中 计算蛋白质含量。称取酪蛋白溶解于蒸馈水中，配制浓度为2mg/mL的标准蛋白质溶液，将配 制好的标准蛋白质溶液按照二倍稀释法稀释成不同浓度，即得标准蛋白质溶液各梯度样 品。
[0035] 实施例2
[0036] 采用本发明的检测试剂盒，配制Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基酸，非离子)微 乳体系-双缩脈显色液，进行样品蛋白质的测定。
[0037] (l)Triton X-100微乳液体系溶液的制备 [003引①混合表面活性剂溶液的的制备
[0039] 准确称取0.75g Triton X-100表面活性剂和0.25g正丙醇两者混合制成混合表面 活性剂。
[0040] ②混合表面活性剂与油相混合溶液的制备
[0041] 选择下酸乙醋为微乳液体系的油相，向上述混合表面活性剂中加入O.lg的下酸乙 醋。
[0042] ③混合表面活性剂/油相与水相微乳液体系的制备
[0043] 将上述Triton X-100、正丙醇和下酸乙醋的混合液，室溫下揽拌，边揽拌边滴加去 离子水，当混合液由浑浊变为澄清透明溶液时停止滴加去离子水。
[0044] (2)双缩脈试剂的制备
[0045] 称取硫酸铜（CuS〇4 · 5H2〇)3.0g，溶于500mL新鲜蒸馈水中，加酒石酸钟钢 化NaC4H4〇6 · 4出0)9. Og，舰化钟化I)5. Og，待完全溶解后，加 入6mol/L氨氧化钢溶液100血， 最后加蒸馈水至1L。
[0046] (3)双缩脈-微乳体系显色液的制备
[0047] 选取上述制备的化iton X-100微乳体系溶液和双缩脈溶液按照体积比3:11配制 成Triton X-100微乳体系-双缩脈显色液显色液。
[004引（4)样品测定
[0049]在标准蛋白质溶液各梯度样品和待测样品中加入上述制得的双缩脈-微乳体系显 色液(每毫升蛋白质样品中加入4mL的双缩脈-微乳体系显色液），测定其吸光值，W标准蛋 白质溶液各梯度样品的浓度和吸光值拟合标准曲线，将待测样品的吸光值代入标准曲线中 计算蛋白质含量。称取酪蛋白溶解于蒸馈水中，配制浓度为2mg/mL的标准蛋白质溶液，将配 制好的标准蛋白质溶液按照二倍稀释法稀释成不同浓度，即得标准蛋白质溶液各梯度样 品。
[00加]实施例3
[0051] 采用本发明的检测试剂盒，配制微乳体系-双缩脈显色液，进行样品蛋白质的测 定。
[0052] (1)微乳液体系溶液的制备
[0053] ①混合表面活性剂溶液的的制备
[0054] 准确称取25g SDS(十二烷基苯横酸钢)或吐溫60、0.25g正下醇，两者混合制成混 合表面活性剂。
[0055] ②混合表面活性剂与油相混合溶液的制备
[0056] 选择下酸乙醋为乳液体系的油相，向上述混合表面活性剂中加入252.5g的下酸乙 醋。
[0057] ③混合表面活性剂/油相与水相微乳液体系的制备
[005引将上述SDS或吐溫60、正下醇、下酸乙醋的混合液，室溫下揽拌，边揽拌边滴加去离 子水，当混合液由浑浊变为澄清透明溶液时停止滴加去离子水。
[0059] (2)双缩脈试剂的制备
[0060] 称取硫酸铜（CuS〇4 · 5此0)3.8g，乙二胺四乙酸二钢化DTA-化2 · 2此0)5.7g，甘氨 酸17.5g，氯化钢14.Og，溶解于750.OmL蒸馈水中后加氨氧化钢40.Og，并W蒸馈水稀释至 1L。
[0061] 也可W使用W下方法：
[0062] 称取硫酸铜（CuS〇4 · 5H2〇)3.0g，溶于500mL新鲜蒸馈水中，加酒石酸钟钢 化Na私Η地6 · 4出0)9. Og，舰化钟化I)5. Og，待完全溶解后，加入6mol/L氨氧化钟溶液100血， 最后加蒸馈水至1L。
[0063] (3)双缩脈-微乳体系显色液的制备
[0064] 选取上述制备的SDS-微乳体系溶液或吐溫60-微乳体系溶液和双缩脈溶液按照体 积比1:1配制成微乳体系-双缩脈显色液。
[0065] (4)样品测定
[0066] 在标准蛋白质溶液各梯度样品和待测样品中加入上述制得的双缩脈-微乳体系显 色液(每毫升蛋白质样品中加入4mL的双缩脈-微乳体系显色液），测定其吸光值，W标准蛋 白质溶液各梯度样品的浓度和吸光值拟合标准曲线，将待测样品的吸光值代入标准曲线中 计算蛋白质含量。称取酪蛋白溶解于蒸馈水中，配制浓度为2mg/mL的标准蛋白质溶液，将配 制好的标准蛋白质溶液按照二倍稀释法稀释成不同浓度，即得标准蛋白质溶液各梯度样 品。
[0067] 对比实施例1
[0068] 分别采用国标凯氏定氮法、双缩脈法、本发明的微乳体系-双缩脈法对A、B、C、D、E 五种样品进行测定，每种样品重复测定5次，分别计算蛋白质含量(g/lOOg)，取5次平均值， 对测量结果进行比较，并根据测试结果对本发明的检测方法进行τ检验(双尾)和方差分析。
[0069] 实验结果如表1所示，结果表明：微乳体系-双缩脈法(本发明的方法)测定蛋白含 量与凯氏定氮法测定的蛋白质值比较，相对误差在0.28-0.60 %范围内；标准双缩脈法测定 蛋白质含量与凯氏定氮法测定的蛋白质相比，相对误差在0.74-1.31 %范围内。微乳体系-双缩脈分光光度法的相对误差远小于传统双缩脈分光光度法，说明微乳体系-双缩脈分光 光度法比标准双缩脈分光光度法测定的蛋白质含量更接近蛋白质的真实含量，可知，该方 法的灵敏度明显高于标准双缩脈分光光度法。
[0070] 表1本发明的方法、国标凯氏定氮法、双缩脈法对样品测定结果
[0071]
[0072] 对比实施例2
[0073] 采用传统双缩脈分光光度法和本发明的微乳体系-双缩脈分光光度法，在相同条 件下，对同一蛋白样品进行吸光值的测定，对比其吸收曲线。
[0074] 结果如附图1所示，结果分析显示，本发明方法测定的蛋白质的吸光度最大值为 0.30,计算的其表观摩尔吸光系数为7.5X 105L/mol · cm,而传统的双缩脈分光光度法测定 蛋白质的吸光度最大值为0.105，计算的表观摩尔吸光系数为1.22X 105L/mol·cm，所W， 本发明的方法增敏作用显著，同等条件下，灵敏度比普通双缩脈试剂增加了大约6.15倍。
[0075] 本发明的较佳实施例而已，并不用W限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的 任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种蛋白质快速检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒包括双缩脲试剂、表面活性 剂和助表面活性剂。2. 根据权利要求1所述的蛋白质快速检测试剂盒，其特征在于，表面活性剂为吐温60、 吐温80、聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基苯磺酸钠中的一种。3. 根据权利要求1所述的蛋白质快速检测试剂盒，其特征在于，助表面活性剂为无水乙 醇、正丙醇、正丁醇、正己醇、正辛醇、乙二醇、丙二醇、甘油、聚甘油酯中的一种或两种以上。4. 一种蛋白质含量的快速检测方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤： (1) 将表面活性剂和助表面活性剂按质量比1-100:1混合均匀，得到混合表面活性剂； 将混合表面活性剂和油相按质量比1-10:1-10混合后，加入去离子充分溶解，制得微乳液； (2) 将上述制得的微乳液和双缩脲试剂按体积比1:1-100混合均匀，得到双缩脲-微乳 体系显色液； (3) 在标准蛋白质溶液各梯度样品和待测样品中加入上述制得的双缩脲-微乳体系显 色液，测定其吸光值，以标准蛋白质溶液各梯度样品的浓度和吸光值拟合标准曲线，将待测 样品的吸光值代入标准曲线中计算蛋白质含量。5. 根据权利要求4所述的蛋白质含量的快速检测方法，其特征在于，表面活性剂为吐温 60、吐温80、聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基苯磺酸钠中的一种。6. 根据权利要求4所述的蛋白质含量的快速检测方法，其特征在于，助表面活性剂为无 水乙醇、正丙醇、正丁醇、正己醇、正辛醇、乙二醇、丙二醇、甘油、聚甘油酯中的一种或两种 以上。7. 根据权利要求4所述的蛋白质含量的快速检测方法，其特征在于，油相为大豆油、橄 榄油、甲酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、甘油三酸酯、油酸乙酯中的一种或两种以 上。8. 根据权利要求4所述的蛋白质含量的快速检测方法，其特征在于，步骤(2)中双缩脲 试剂包含:5-80g/L的氢氧化钾或氢氧化钠、1.0-6.Og/L的硫酸铜、3-12g/L的酒石酸钾钠或 乙二胺四乙酸二钠。9. 权利要求1-3任一项所述的蛋白质快速检测试剂盒的应用，其特征在于，所述检测试 剂盒用于检测含蛋白质样品中的蛋白质含量。
【专利摘要】本发明公开了一种蛋白质快速检测试剂盒及其检测方法和应用，该检测试剂盒包括双缩脲试剂、表面活性剂和助表面活性剂。本发明的检测方法通过在双缩脲试剂中添加表面活性剂和助表面活性剂，使制得的微乳液具有增溶、增敏的特性，使得改进后的双缩脲法具有灵敏度高、操作简单、干扰物少、重复性好的优点。该检测方法对蛋白质的检测灵敏度与传统方法相比提高5-10倍，可以应用于微量蛋白质样品的检测，与国标凯氏定氮法比较，其相对误差在0.28-0.60％之间，本发明的检测方法具有良好的精确度与准确度。
【IPC分类】G01N21/79
【公开号】CN105486682
【申请号】CN201511003463
【发明人】田波, 马丽华, 田然, 刘平平, 陈晨, 高宝玉, 李野
【申请人】东北农业大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月28日
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学检测的技术领域，具体设及一种蛋白质快速检测试剂盒及其 检测方法和应用。
【背景技术】
[0002] 蛋白质是一切生命的物质基础，是人体组织更新和修补的主要原料，蛋白质与各 种形式的生命活动紧密的联系在一起，具有极其重要的生理学意义。同时，蛋白质又是重要 的营养素之一，食物中的蛋白质是人体摄入氮的唯一来源，具有其他营养物质不可替代的 作用。近些年来，食物中蛋白质渗杂渗假事件时有发生，对人体造成极了严重的伤害，所W， 建立快速、准确、操作简单的蛋白质检测方法已迫在眉睫。
[0003] 目前，食品蛋白质检测的权威方法是凯氏定氮法，该方法也是食品蛋白质检测的 国家标准方法(GB5009.5)，但是该方法操作繁琐，时间长(4-8小时），并且反应过程中会产 生大量的有毒气体，不利于环境安全，对操作环境、设备W及操作人员的技能要求较高。在 生物医学领域，关于分光光度法测定蛋白质的研究有很多，其中的双缩脈分光光度法应用 于蛋白质的测定已有近百年的历史，该法作为我国农业标准(NY/T1678)乳与乳制品中蛋白 质的测定方法，对蛋白质的检出限为5 X l(T5g/100g。双缩脈法测定蛋白质的原理是当物质 中含有两个或者两个W上肤键时会和碱性的硫酸铜溶液发生反应，生成紫色的大分子络合 物，该产物是肤键中的氮原子和铜离子配价结合的结果，其颜色深浅与物质中所含的蛋白 质含量成正比，所W可W根据产物吸光值的变化来测定蛋白质含量。双缩脈分光光度法具 有操作简单，重复性好，反应所用试剂单一、稳定，不同种类的蛋白质产物颜色深浅相近，并 且干扰物质少，受溫度影响极小等优点，可W快速地测定蛋白质含量。但是双缩脈分光光度 法存在一些较为严重的缺陷，该方法虽然检测时间较短（20~30分钟），但是检测灵敏度较 差，在测量低蛋白含量的样品时有一定的困难。
【发明内容】
[0004] 为解决上述蛋白质检测技术存在不足的技术问题，本发明提供了一种检测迅速、 检测灵敏度高的蛋白质快速检测试剂盒及其制备方法和应用。
[0005] 本发明提供了一种蛋白质快速检测试剂盒，该检测试剂盒包括双缩脈试剂、表面 活性剂和助表面活性剂。
[0006] 优选的，表面活性剂为吐溫60、吐溫80、聚乙二醇辛基苯基酸、十二烷基苯横酸钢 中的一种。
[0007] 优选的，助表面活性剂为无水乙醇、正丙醇、正下醇、正己醇、正辛醇、乙二醇、丙二 醇、甘油、聚甘油醋中的一种或两种W上。
[000引本发明还提供了一种蛋白质快速检测试剂盒的检测方法，该检测方法包括W下步 骤：
[0009] (1)将表面活性剂和助表面活性剂按质量比1-100:1混合均匀，得到混合表面活性 剂;将混合表面活性剂和油相按质量比1-10:1-10混合后，加入去离子充分溶解，制得微乳 液；
[0010] (2)将上述制得的微乳液和双缩脈试剂按体积比1:1-100混合均匀，得到双缩脈-微乳体系显色液；
[0011] (3)在标准蛋白质溶液各梯度样品和待测样品中加入上述制得的双缩脈-微乳体 系显色液，测定其吸光值，W标准蛋白质溶液各梯度样品的浓度和吸光值拟合标准曲线，将 待测样品的吸光值代入标准曲线中计算蛋白质含量。
[0012] 优选的，表面活性剂为吐溫60、吐溫80、聚乙二醇辛基苯基酸、十二烷基苯横酸钢 中的一种。
[0013] 优选的，助表面活性剂为无水乙醇、正丙醇、正下醇、正己醇、正辛醇、乙二醇、丙二 醇、甘油、聚甘油醋中的一种或两种W上。
[0014] 优选的，油相为大豆油、橄揽油、甲酸乙醋、乙酸乙醋、丙酸乙醋、下酸乙醋、甘油Ξ 酸醋、油酸乙醋中的一种或两种W上。
[001引步骤(2)中双缩脈试剂包含:5-80g/L的氨氧化钟或氨氧化钢、1.0-6.0g/L的硫酸 铜、3-12g/L的酒石酸钟钢或乙二胺四乙酸二钢。
[0016] 本发明还提供了一种蛋白质快速检测试剂盒的应用，所述检测试剂盒用于检测含 蛋白质样品中的蛋白质含量。
[0017] 本发明的有益效果:本发明在双缩脈试剂中添加微乳液，微乳液具有增溶、增敏的 特性，使得改进后的双缩脈法具有灵敏度高、操作简单、干扰物少、重复性好的优点。该检测 方法对蛋白质的检测灵敏度与传统方法相比提高5-10倍，可W应用于微量蛋白质样品的检 巧。，与国标凯氏定氮法比较，其相对误差在0.28-0.60%之间，本发明的检测方法具有良好 的精确度与准确度。
【附图说明】
[0018] 图1为本发明制备的双缩脈-微乳体系与传统双缩脈溶液的吸收光谱比较，其中A 为双缩脈-微乳体系的吸收光谱;B为传统双缩脈溶液的吸收光谱。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例对本发明进行详细地解释说明。
[0020] 实施例1
[0021] 采用本发明的检测试剂盒，配制吐溫80微乳体系-双缩脈显色液，进行样品蛋白质 的测定。
[0022] (1)吐溫80微乳液体系溶液的制备
[0023] ①混合表面活性剂溶液的制备
[0024] 准确称取0.25g吐溫80非离子表面活性剂和0.25g无水乙醇两者混合制成混合表 面活性剂。
[0025] ②混合表面活性剂与油相混合溶液的制备
[0026] 选择下酸乙醋为乳液体系的油相，向上述混合表面活性剂中加入0.05g的下酸乙 醋。
[0027]③混合表面活性剂/油相与水相微乳液体系的制备
[00%]将上述吐溫80、无水乙醇和下酸乙醋的混合液，室溫下揽拌，边揽拌边滴加去离子 水，当混合液由浑浊变为澄清透明溶液时停止滴加去离子水。
[0029] (2)双缩脈试剂的制备
[0030] 称取硫酸铜（CuS〇4 · 5此0)1.5g和酒石酸钟钢化化C4H4O6 · 4此0)6.0g，用500mL蒸 馈水溶解，在揽拌下加300mL质量百分数10%化0H，用水稀释到lOOOmL，储存于塑料瓶中（或 内壁涂有石蜡的瓶中），此试剂可长期保存。若储存瓶中有黑色沉淀出现，则需重新配制。
[0031] (3)双缩脈-微乳体系显色液的制备
[0032] 选取上述制备的吐溫80微乳体系溶液和双缩脈溶液按照体积比1:100配制成吐溫 80微乳体系-双缩脈显色液显色液。
[0033] (4)样品测定
[0034] 在标准蛋白质溶液各梯度样品和待测样品中加入上述制得的双缩脈-微乳体系显 色液(每毫升蛋白质样品中加入4mL的双缩脈-微乳体系显色液），测定其吸光值，W标准蛋 白质溶液各梯度样品的浓度和吸光值拟合标准曲线，将待测样品的吸光值代入标准曲线中 计算蛋白质含量。称取酪蛋白溶解于蒸馈水中，配制浓度为2mg/mL的标准蛋白质溶液，将配 制好的标准蛋白质溶液按照二倍稀释法稀释成不同浓度，即得标准蛋白质溶液各梯度样 品。
[0035] 实施例2
[0036] 采用本发明的检测试剂盒，配制Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基酸，非离子)微 乳体系-双缩脈显色液，进行样品蛋白质的测定。
[0037] (l)Triton X-100微乳液体系溶液的制备 [003引①混合表面活性剂溶液的的制备
[0039] 准确称取0.75g Triton X-100表面活性剂和0.25g正丙醇两者混合制成混合表面 活性剂。
[0040] ②混合表面活性剂与油相混合溶液的制备
[0041] 选择下酸乙醋为微乳液体系的油相，向上述混合表面活性剂中加入O.lg的下酸乙 醋。
[0042] ③混合表面活性剂/油相与水相微乳液体系的制备
[0043] 将上述Triton X-100、正丙醇和下酸乙醋的混合液，室溫下揽拌，边揽拌边滴加去 离子水，当混合液由浑浊变为澄清透明溶液时停止滴加去离子水。
[0044] (2)双缩脈试剂的制备
[0045] 称取硫酸铜（CuS〇4 · 5H2〇)3.0g，溶于500mL新鲜蒸馈水中，加酒石酸钟钢 化NaC4H4〇6 · 4出0)9. Og，舰化钟化I)5. Og，待完全溶解后，加 入6mol/L氨氧化钢溶液100血， 最后加蒸馈水至1L。
[0046] (3)双缩脈-微乳体系显色液的制备
[0047] 选取上述制备的化iton X-100微乳体系溶液和双缩脈溶液按照体积比3:11配制 成Triton X-100微乳体系-双缩脈显色液显色液。
[004引（4)样品测定
[0049]在标准蛋白质溶液各梯度样品和待测样品中加入上述制得的双缩脈-微乳体系显 色液(每毫升蛋白质样品中加入4mL的双缩脈-微乳体系显色液），测定其吸光值，W标准蛋 白质溶液各梯度样品的浓度和吸光值拟合标准曲线，将待测样品的吸光值代入标准曲线中 计算蛋白质含量。称取酪蛋白溶解于蒸馈水中，配制浓度为2mg/mL的标准蛋白质溶液，将配 制好的标准蛋白质溶液按照二倍稀释法稀释成不同浓度，即得标准蛋白质溶液各梯度样 品。
[00加]实施例3
[0051] 采用本发明的检测试剂盒，配制微乳体系-双缩脈显色液，进行样品蛋白质的测 定。
[0052] (1)微乳液体系溶液的制备
[0053] ①混合表面活性剂溶液的的制备
[0054] 准确称取25g SDS(十二烷基苯横酸钢)或吐溫60、0.25g正下醇，两者混合制成混 合表面活性剂。
[0055] ②混合表面活性剂与油相混合溶液的制备
[0056] 选择下酸乙醋为乳液体系的油相，向上述混合表面活性剂中加入252.5g的下酸乙 醋。
[0057] ③混合表面活性剂/油相与水相微乳液体系的制备
[005引将上述SDS或吐溫60、正下醇、下酸乙醋的混合液，室溫下揽拌，边揽拌边滴加去离 子水，当混合液由浑浊变为澄清透明溶液时停止滴加去离子水。
[0059] (2)双缩脈试剂的制备
[0060] 称取硫酸铜（CuS〇4 · 5此0)3.8g，乙二胺四乙酸二钢化DTA-化2 · 2此0)5.7g，甘氨 酸17.5g，氯化钢14.Og，溶解于750.OmL蒸馈水中后加氨氧化钢40.Og，并W蒸馈水稀释至 1L。
[0061] 也可W使用W下方法：
[0062] 称取硫酸铜（CuS〇4 · 5H2〇)3.0g，溶于500mL新鲜蒸馈水中，加酒石酸钟钢 化Na私Η地6 · 4出0)9. Og，舰化钟化I)5. Og，待完全溶解后，加入6mol/L氨氧化钟溶液100血， 最后加蒸馈水至1L。
[0063] (3)双缩脈-微乳体系显色液的制备
[0064] 选取上述制备的SDS-微乳体系溶液或吐溫60-微乳体系溶液和双缩脈溶液按照体 积比1:1配制成微乳体系-双缩脈显色液。
[0065] (4)样品测定
[0066] 在标准蛋白质溶液各梯度样品和待测样品中加入上述制得的双缩脈-微乳体系显 色液(每毫升蛋白质样品中加入4mL的双缩脈-微乳体系显色液），测定其吸光值，W标准蛋 白质溶液各梯度样品的浓度和吸光值拟合标准曲线，将待测样品的吸光值代入标准曲线中 计算蛋白质含量。称取酪蛋白溶解于蒸馈水中，配制浓度为2mg/mL的标准蛋白质溶液，将配 制好的标准蛋白质溶液按照二倍稀释法稀释成不同浓度，即得标准蛋白质溶液各梯度样 品。
[0067] 对比实施例1
[0068] 分别采用国标凯氏定氮法、双缩脈法、本发明的微乳体系-双缩脈法对A、B、C、D、E 五种样品进行测定，每种样品重复测定5次，分别计算蛋白质含量(g/lOOg)，取5次平均值， 对测量结果进行比较，并根据测试结果对本发明的检测方法进行τ检验(双尾)和方差分析。
[0069] 实验结果如表1所示，结果表明：微乳体系-双缩脈法(本发明的方法)测定蛋白含 量与凯氏定氮法测定的蛋白质值比较，相对误差在0.28-0.60 %范围内；标准双缩脈法测定 蛋白质含量与凯氏定氮法测定的蛋白质相比，相对误差在0.74-1.31 %范围内。微乳体系-双缩脈分光光度法的相对误差远小于传统双缩脈分光光度法，说明微乳体系-双缩脈分光 光度法比标准双缩脈分光光度法测定的蛋白质含量更接近蛋白质的真实含量，可知，该方 法的灵敏度明显高于标准双缩脈分光光度法。
[0070] 表1本发明的方法、国标凯氏定氮法、双缩脈法对样品测定结果
[0071]
[0072] 对比实施例2
[0073] 采用传统双缩脈分光光度法和本发明的微乳体系-双缩脈分光光度法，在相同条 件下，对同一蛋白样品进行吸光值的测定，对比其吸收曲线。
[0074] 结果如附图1所示，结果分析显示，本发明方法测定的蛋白质的吸光度最大值为 0.30,计算的其表观摩尔吸光系数为7.5X 105L/mol · cm,而传统的双缩脈分光光度法测定 蛋白质的吸光度最大值为0.105，计算的表观摩尔吸光系数为1.22X 105L/mol·cm，所W， 本发明的方法增敏作用显著，同等条件下，灵敏度比普通双缩脈试剂增加了大约6.15倍。
[0075] 本发明的较佳实施例而已，并不用W限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的 任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种蛋白质快速检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒包括双缩脲试剂、表面活性 剂和助表面活性剂。2. 根据权利要求1所述的蛋白质快速检测试剂盒，其特征在于，表面活性剂为吐温60、 吐温80、聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基苯磺酸钠中的一种。3. 根据权利要求1所述的蛋白质快速检测试剂盒，其特征在于，助表面活性剂为无水乙 醇、正丙醇、正丁醇、正己醇、正辛醇、乙二醇、丙二醇、甘油、聚甘油酯中的一种或两种以上。4. 一种蛋白质含量的快速检测方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤： (1) 将表面活性剂和助表面活性剂按质量比1-100:1混合均匀，得到混合表面活性剂； 将混合表面活性剂和油相按质量比1-10:1-10混合后，加入去离子充分溶解，制得微乳液； (2) 将上述制得的微乳液和双缩脲试剂按体积比1:1-100混合均匀，得到双缩脲-微乳 体系显色液； (3) 在标准蛋白质溶液各梯度样品和待测样品中加入上述制得的双缩脲-微乳体系显 色液，测定其吸光值，以标准蛋白质溶液各梯度样品的浓度和吸光值拟合标准曲线，将待测 样品的吸光值代入标准曲线中计算蛋白质含量。5. 根据权利要求4所述的蛋白质含量的快速检测方法，其特征在于，表面活性剂为吐温 60、吐温80、聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基苯磺酸钠中的一种。6. 根据权利要求4所述的蛋白质含量的快速检测方法，其特征在于，助表面活性剂为无 水乙醇、正丙醇、正丁醇、正己醇、正辛醇、乙二醇、丙二醇、甘油、聚甘油酯中的一种或两种 以上。7. 根据权利要求4所述的蛋白质含量的快速检测方法，其特征在于，油相为大豆油、橄 榄油、甲酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、甘油三酸酯、油酸乙酯中的一种或两种以 上。8. 根据权利要求4所述的蛋白质含量的快速检测方法，其特征在于，步骤(2)中双缩脲 试剂包含:5-80g/L的氢氧化钾或氢氧化钠、1.0-6.Og/L的硫酸铜、3-12g/L的酒石酸钾钠或 乙二胺四乙酸二钠。9. 权利要求1-3任一项所述的蛋白质快速检测试剂盒的应用，其特征在于，所述检测试 剂盒用于检测含蛋白质样品中的蛋白质含量。
【专利摘要】本发明公开了一种蛋白质快速检测试剂盒及其检测方法和应用，该检测试剂盒包括双缩脲试剂、表面活性剂和助表面活性剂。本发明的检测方法通过在双缩脲试剂中添加表面活性剂和助表面活性剂，使制得的微乳液具有增溶、增敏的特性，使得改进后的双缩脲法具有灵敏度高、操作简单、干扰物少、重复性好的优点。该检测方法对蛋白质的检测灵敏度与传统方法相比提高5-10倍，可以应用于微量蛋白质样品的检测，与国标凯氏定氮法比较，其相对误差在0.28-0.60％之间，本发明的检测方法具有良好的精确度与准确度。
【IPC分类】G01N21/79
【公开号】CN105486682
【申请号】CN201511003463
【发明人】田波, 马丽华, 田然, 刘平平, 陈晨, 高宝玉, 李野
【申请人】东北农业大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月28日
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