用于快速检测苯并(a)芘的纳米免疫传感器的制备方法及其检测方法
用于快速检测苯并(a)芘的纳米免疫传感器的制备方法及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种用于苯并(a)巧快速检测的纳米免疫传感器的制备方法，W及利 用该纳米免疫传感器检测肉制品中的苯并(a)巧的检测方法。
【背景技术】
[0002] 苯并(a)巧是一种由4个苯环构成的多环芳控，常溫下为无色至淡黄色针状晶体， 性质稳定。在煎烤、烧烤、油炸动物性肉制品的过程中，食品会产生苯并(a)巧，人和动物摄 入苯并(a)巧超出限量的肉制品后会导致肿瘤和癌变，对健康造成潜在的威胁。目前，由食 品污染引起的疾病是引起人们广泛关注的食品安全问题之一，许多国家已将苯并(a)巧为 食品有害物质监测的重要内容之一，如德国限定肉制品中苯并(a)巧的残留量为化g/kg，我 国国标限定肉制品中苯并(a)巧的残留量应在化g/kg W下。已报道的苯并(a)巧检测方法有 液相色谱法、气相-质谱联用法、薄层层析法等，但色谱法、层析法等检测方法存在操作繁 琐、耗时长、结果分辨性差等缺点。因此，目前许多工作研究者致力于开发更为快速、准确的 苯并(a)巧检测方法，W提高食品中苯并(a)巧的检测效率，同时要避免出现假阴性或假阳 性的现象。
【发明内容】
[0003] 本发明为解决上述技术的不足，提供一种用于苯并(a)巧快速检测的纳米免疫传 感器的制备方法，还提供一种利用该纳米免疫传感器检测食品中苯并(a)巧的方法，本发明 既具备更加灵敏、快速、易微型化、便于携带和现场检测的优势，同时也具备免疫反应抗原-抗体结合的特异性。
[0004] 为解决W上问题，本发明采用W下技术方案：
[0005] 本发明一种用于苯并(a)巧快速检测的纳米免疫传感器的制备方法，其特征是，W 玻碳电极为基础电极，采用聚酷胺-胺树枝状大分子结合聚二締丙基二甲基氯化锭功能化 的石墨締修饰玻碳电极，然后滴涂纳米金溶液，纳米金经静电吸附作用固定于修饰电极上， 再经戊二醒偶联固定多环芳控抗体制备成纳米免疫传感器。
[0006] 所述的用于苯并(a)巧快速检测的纳米免疫传感器的制备方法，包括W下步骤：
[0007] a.电极预处理
[0008] 将玻碳电极用粒径为0.05皿的氧化侣抛光粉抛光打磨至电极表面呈镜面，然后用 蒸馈水冲洗干净，再依次置于体积分数为50%的硝酸、丙酬、去离子水中超声清洗2min~ 6min，氮气吹干，备用；
[0009] b.聚酷胺-胺-P孤A功能化石墨締复合物的制备
[0010] 准确称取0.2g石墨締加入到lOmL聚二締丙基二甲基氯化锭水溶液(PDDA，体积分 数为0.25 % )中，超声处理25min~35min，水洗Ξ次去除过量的石墨締，制得PDDA功能化的 石墨締，取O.Olg P孤A功能化的石墨締加入到lOmL N，N-二甲基甲酯胺中，使其浓度为Img/ mL，超声处理lOmin~20min，得到均匀一致的P孤A功能化石墨締的N，N-二甲基甲酯胺悬浮 液，备用；
[00川准确称取0.02g聚酷胺-胺溶于10m巧醇中，使其浓度为2mg/mL，超声处理15min~ 25min，得到均匀透明的聚酷胺-胺的甲醇溶液，然后将聚酷胺-胺的甲醇溶液与PDDA功能化 石墨締的N，N-二甲基甲酯胺悬浮液按1:1混合均匀，超声处理30min~40min，制得聚酷胺-胺-P孤A功能化石墨締复合物；
[001^ C.纳米金的制备
[0013] 准确量取50mL O.lmg/血的氯金酸溶液置于烧杯中，用玻璃棒揽拌下加热至沸腾， 迅速加入2.5mL质量分数为1 %的巧樣酸钢溶液，持续揽拌至溶液颜色变为酒红色，得到纳 米金溶液；（注：制备纳米金使用的玻璃器皿在使用前需经铭酸洗液浸泡2地，并冲洗，烘干 处理）。
[0014] d.纳米免疫传感器的制备
[0015] 将步骤a中得到的玻碳电极应用Ξ电极系统，即W玻碳电极为工作电极、Ag/AgCl 电极为参比电极、销丝电极为辅助电极，在-0.2V~+0.6V的电位区间，采用LK98BII型微机 电化学分析系统W50mV · 的扫描速度在新配制的0.05mol/L硫酸溶液中进行循环伏安扫 描10圈，对玻碳电极表面进行活化处理。冲洗玻碳电极后，用移液枪移取3~化L步骤b得到 的聚酷胺-胺-PDDA功能化石墨締复合物滴涂到玻碳电极表面，于室溫惊干，再移取2~化L 纳米金溶液滴涂到修饰的电极表面，于室溫惊干，然后在修饰电极表面滴涂3~化L质量分 数为0.5%的戊二醒溶液活化修饰的电极表面，于4°C条件下活化25~35min，然后用pH为 7.4的0.2111〇1/1憐酸盐缓冲液冲洗电极，再滴涂3~化1^多环芳控抗体，并于4°0条件下固定 2h，再滴涂3~扣L质量分数为2 %牛血清白蛋白溶液于4°C下封闭化，用抑为7.4的0.2mol/L 憐酸盐缓冲液反复冲洗干净，得到苯并(a)巧纳米免疫传感器，于4°C条件下保存备用。
[0016] 优选的，所述步骤b中聚酷胺-胺-PDDA功能化石墨締复合物的制备的具体步骤内 容为：
[0017] 准确称取0.2g石墨締加入到lOmL聚二締丙基二甲基氯化锭水溶液(PDDA，体积分 数为0.25% )中，超声处理30min，水洗Ξ次去除过量的石墨締，制得PDDA功能化的石墨締， 取O.Olg P孤A功能化的石墨締加入到lOmL N，N-二甲基甲酯胺中，使其浓度为Img/mL，超声 处理15min，得到均匀一致的P孤A功能化石墨締的N，N-二甲基甲酯胺悬浮液，备用；
[0018] 准确称取0.0?聚酷胺-胺溶于lOmL甲醇中，使其浓度为2mg/mL，超声处理20min， 得到均匀透明的聚酷胺-胺的甲醇溶液，然后将聚酷胺-胺的甲醇溶液与PDDA功能化石墨締 的N，N-二甲基甲酯胺悬浮液按1:1混合均匀，超声处理35min，制得聚酷胺-胺-PDDA功能化 石墨締复合物。
[0019] 优选的，所述步骤d中纳米免疫传感器的制备的具体步骤内容为：
[0020] 将步骤a中得到的玻碳电极应用Ξ电极系统，即W玻碳电极为工作电极、Ag/AgCl 电极为参比电极、销丝电极为辅助电极，在-0.2V~+0.6V的电位区间，采用LK98BII型微机 电化学分析系统W50mV · 的扫描速度在新配制的0.05mol/L硫酸溶液中进行循环伏安扫 描10圈，对玻碳电极表面进行活化处理。冲洗玻碳电极后，用移液枪移取扣L步骤b得到的聚 酷胺-胺-P孤A功能化石墨締复合物滴涂到玻碳电极表面，于室溫惊干，再移取化L纳米金溶 液滴涂到修饰的电极表面，于室溫惊干，然后在修饰电极表面滴涂化L质量分数为0.5 %的 戊二醒溶液活化修饰的电极表面，于4°C条件下活化30min，然后用抑为7.4的ο. 2mol/L憐酸 盐缓冲液冲洗电极，再滴涂化L多环芳控抗体，并于4°C条件下固定化，再滴涂化L质量分数 为2%牛血清白蛋白溶液于4°C下封闭化，用抑为7.4的0.2mol/L憐酸盐缓冲液反复冲洗干 净，得到苯并(a)巧纳米免疫传感器，于4°C条件下保存备用。
[0021] 使用所述的用于苯并(a)巧快速检测的纳米免疫传感器的检测方法，包括W下具 体步骤：
[0022] a.标准曲线
[0023] 取苯并(a)巧标准品加入到lOmL二甲基亚讽中，再用抑为7.4的憐酸盐缓冲溶液稀 释至不同浓度梯度，在苯并(a)巧纳米免疫传感器上涂上各个梯度的上述苯并(a)巧标准品 溶液，室溫下解育15~25min，WAg/AgCl电极为参比电极、销丝(片）电极为辅助电极，苯并 (a)巧纳米免疫传感器为工作电极，组成Ξ电极测试系统，在l.Ommol/L K3[Fe(CN)6] + 0.1mol/L KCl+0.2mol/L憐酸盐缓冲溶液(pH为7.0)进行差分脉冲伏安法的检测（扫描速度 为50mV · ，电压范围为-0.2V~+0.6V); W苯并(a)巧浓度为零时电流值和各浓度梯度的 电流值的差值为纵坐标，苯并(a)巧浓度的对数为横坐标，得到苯并(a)巧的免疫响应电流 差值与其浓度之间的线性曲线，即标准曲线及线性回归方程式，实验在室溫条件下进行。 [0024] b.测定
[0025] 将检测样品（肉制品1、11)分别粉碎，肉制品I和II各取lOg样品，进行W下处理，即 加入50mL环己烧，超声处理lOmin后过滤到浓缩瓶中，在70°C旋蒸至20血，移入分液漏斗，用 50血二甲基亚讽萃取，再用30血环己烧提取，弃去环己烧层，把提取液旋蒸至10血，用5血二 甲基亚讽洗涂浓缩瓶，合并二甲基亚讽，加入15mL水，摇匀后过活化后的Cl姻相萃取小柱抽 干，用30mL正己烧洗脱，收集洗脱液，蒸干后用2mL甲醇定容，经0.45皿滤膜过滤，备用；用 LK98BII型微机电化学分析系统来测定所述的差分脉冲伏安图，分别进行Ξ次测量并记录 差分脉冲伏安图，按线性回归方程式计算其苯并(a)巧的浓度，此过程在室溫条件下下进 行。
[0026] 优选的，所述的用于苯并(a)巧快速检测的纳米免疫传感器的检测方法，所述步骤 a中，在苯并(a)巧纳米免疫传感器上涂上各个梯度的苯并(a)巧标准品溶液后，室溫下解育 时间为20min。
[0027] 本发明与现有技术相比具有W下显著的优点：
[0028] ①本发明的纳米免疫传感器用于检测肉制品中的苯并(a)巧法与国标法相比，缩 短了苯并(a)巧的检验时间，提高了检测效率。
[0029] ②简化了样品前处理步骤，同时不限制样品提取液的颜色。
[0030] ③利用PDDA功能化石墨締与纳米金间正负电荷吸引，提高 了纳米免疫传感器的稳 定性。
[0031] ④制备简单、操作简便、成本较低等优点，降低了检验苯并(a)巧的成本。
【附图说明】
[0032] 图1为不同电极修饰材料的循环伏安表征图。
[0033] 图2为基于本专利构建的纳米免疫传感器用于苯并(a)巧检测的响应电流图。
[0034] 图3为肉制品I中苯并(a)巧检测的差分脉冲伏安图。
[0035] 图4为肉制品II中苯并(a)巧检测的差分脉冲伏安图。
【具体实施方式】
[0036] 下面参照附图对本发明【具体实施方式】进行详细说明。
[0037] 参见图1、图2、图3、图4。
[003引实施例1
[0039] 用纳米免疫传感器检测肉制品I中苯并(a)巧
[0040] 1.-种用于苯并(a)巧快速检测的纳米免疫传感器的制备方法 [0041 ] a.电极预处理
[0042] 将玻碳电极用粒径为0.05皿的氧化侣抛光粉抛光打磨至电极表面呈镜面，然后用 蒸馈水冲洗干净，再依次置于体积分数为50%的硝酸、丙酬、去离子水中超声清洗3min，氮 气吹干，备用；
[0043] b.聚酷胺-胺-P孤A功能化石墨締复合物的制备
[0044] 准确称取0.2g石墨締加入到lOmL聚二締丙基二甲基氯化锭水溶液(PDDA，体积分 数为0.25% )中，超声处理30min，水洗Ξ次去除过量的石墨締，制得PDDA功能化的石墨締， 取O.Olg P孤A功能化的石墨締加入到lOmL N，N-二甲基甲酯胺中，使其浓度为Img/mL，超声 处理15min，得到均匀一致的P孤A功能化石墨締的N，N-二甲基甲酯胺悬浮液，备用；
[0045] 准确称取0.0?聚酷胺-胺溶于lOmL甲醇中，使其浓度为2mg/mL，超声处理20min， 得到均匀透明的聚酷胺-胺的甲醇溶液，然后将聚酷胺-胺的甲醇溶液与PDDA功能化石墨締 的N，N-二甲基甲酯胺悬浮液按1:1混合均匀，超声处理35min，制得聚酷胺-胺-PDDA功能化 石墨締复合物；
[0046] C.纳米金的制备
[0047] 准确量取50mL 0.1 mg/血的氯金酸溶液置于烧杯中，用玻璃棒揽拌下加热至沸腾， 迅速加入2.5mL质量分数为1 %的巧樣酸钢溶液，持续揽拌至溶液颜色变为酒红色，得到纳 米金溶液。（注：制备纳米金使用的玻璃器皿在使用前需经铭酸洗液浸泡2地，并冲洗，烘干 处理）
[004引d.纳米免疫传感器的制备
[0049] 将步骤a中得到的玻碳电极应用Ξ电极系统，即W玻碳电极为工作电极、Ag/AgCl 电极为参比电极、销丝电极为辅助电极，在-0.2V~+0.6V的电位区间，采用LK98BII型微机 电化学分析系统W50mV · 的扫描速度在新配制的0.05mol/L硫酸溶液中进行循环伏安扫 描10圈，对玻碳电极表面进行活化处理。冲洗玻碳电极后，用移液枪移取化L步骤b得到的聚 酷胺-胺-P孤A功能化石墨締复合物滴涂到玻碳电极表面，于室溫惊干，再移取化L纳米金溶 液滴涂到修饰的电极表面，于室溫惊干，然后在修饰电极表面滴涂化L质量分数为0.5 %的 戊二醒溶液活化修饰的电极表面，于4°C条件下活化30min，然后用抑为7.4的0.2mol/L憐酸 盐缓冲液冲洗电极，再滴涂化L多环芳控抗体，并于4°C条件下固定化，再滴涂化L质量分数 为2%牛血清白蛋白溶液于4°C下封闭化，用抑为7.4的0.2mol/L憐酸盐缓冲液反复冲洗干 净，得到苯并(a)巧纳米免疫传感器，于4°C条件下保存备用。
[0050] 图1为不同修饰阶段电极的循环伏安图，a为玻碳电极，b为聚酷胺-胺-PDDA功能化 石墨締-纳米金修饰后的电极，C为在制备的纳米免疫传感器上滴加苯并(a)巧后的电极。由 图可知，a电极(玻碳电极)在电解质溶液中出现一对可逆的氧化还原峰，当电极修饰后，氧 化还原峰电流值增大，运是因为修饰物具有快速的电子传递能力。而滴加苯并(a)巧后(进 行免疫反应后），氧化还原峰电流值大幅降低，表面抗原-抗体免疫反应后生成的免疫复合 物在部分空间上阻碍了媒介体和底物的扩散，电子传递受到了阻碍所致。
[0051] 2.上述纳米免疫传感器用于肉制品中苯并(a)巧的快速检测
[0052] 取50mg苯并(a)巧标准品加入到lOmL二甲基亚讽中，再用抑为7.4的憐酸盐缓冲溶 液定容至 lOOmL，然后取该液依次稀释为 0ng/mL、0.01ng/mL、lng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、 10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL浓度梯度，备用。在权利要求2所述的纳米免疫传感器上涂上各 个梯度的上述苯并(a)巧标准品溶液，室溫下解育20min"WAg/AgCl电极为参比电极、销丝 (片）电极为辅助电极，苯并（a)巧纳米免疫传感器为工作电极，组成Ξ电极测试系统，在 l.Ommol/L K3[Fe(CN)6]+0.1mol/L KCl+0.2mol/L憐酸盐缓冲溶液(抑=7.0)进行差分脉冲 伏安法的检测。差分脉冲伏安法的检测参数如下，扫描速度为50mV · S-1，电压范围为-0.2V ~+0.6V。^苯并(a)巧浓度为零时电流值和各浓度梯度的差值为纵坐标，苯并(a)巧浓度的 对数为横坐标，得到苯并(a)巧的免疫响应电流差值与其浓度之间的线性曲线，即标准曲线 及线性回归方程式 AIpc(μA)=4.09621g[C/(ng/mL)]+2.3733，相关系数R2 = 0.9925。其中 A Ipc(μΑ)为不同浓度苯并(a)巧的电流响应差值值，μΑ，C为苯并(a)巧的浓度，ng/mL。
[005；3] b.测定
[0化4] 将肉制品I粉碎，取1 Og样品，进行W下的处理，即加入50mL环己烧，超声处理1 Omiη 后过滤到浓缩瓶中，在7〇°C旋蒸至20mL，移入分液漏斗，用50mL二甲基亚讽萃取，再用30mL 环己烧提取，弃去环己烧层，把提取液旋蒸至lOmL，用5mL二甲基亚讽洗涂浓缩瓶，合并二甲 基亚讽，加入15血水，摇匀后过活化后的Cl姻相萃取小柱抽干，用30mL正己烧洗脱，收集洗 脱液，蒸干后用2m巧醇定容，经0.45μπι滤膜过滤，备用。
[0055] 将上述纳米免疫传感器在与步骤a中的电解质溶液相同的溶液中进行差分脉冲伏 安检测，扫描速度为50mV · s^，电压范围为-0.2V~+0.6V。得到差分脉冲伏安图曰。然后取出 纳米免疫传感器，用去离子水冲洗去除电极表面的电解质，备用。
[0056] 在上述纳米免疫传感器上滴涂上述提取液化L，室溫下解育20miruWAg/AgCl电极 为参比电极、销丝(片）电极为辅助电极，苯并(a)巧纳米免疫传感器为工作电极，组成Ξ电 极测试系统，在与步骤a电解质溶液相同的溶液中进行差分脉冲伏安法的检测，扫描速度为 50mV · s^，电压范围为-0.2V~+0.6V。得到差分脉冲伏安图b。将图a与图b叠加后得到图3。 由图3得到，b图的响应电流值与a图相比，响应电流值变小，说明抗原与抗体产生了结合，也 就是说，肉制品中有苯并(a)巧被检测出来。分别进行Ξ次测量，求其平均值，按线性回归方 程式计算其苯并(a)巧的浓度。该肉制品样品中含有苯并(a)巧，其浓度为4.4ng/mL。
[0化7]实施例2
[0058] 用纳米免疫传感器检测肉制品II中苯并(a)巧
[0059] 1. 一种用于苯并(a)巧快速检测的纳米免疫传感器的制备方法
[0060] a.电极预处理
[0061] 同实施例1
[0062] b.聚酷胺-胺-石墨締复合物的制备
[0063] 同实施例1
[0064] c.纳米金的制备 [00化]同实施例1
[0066] d.纳米免疫传感器的制备
[0067] 将步骤a中得到的玻碳电极应用Ξ电极系统，即W玻碳电极为工作电极、Ag/AgCl 电极为参比电极、销丝电极为辅助电极，在-0.2V~+0.6V的电位区间，采用LK98BII型微机 电化学分析系统W50mV · 的扫描速度在新配制的0.05mol/L硫酸溶液中进行循环伏安扫 描10圈，对玻碳电极表面进行活化处理。冲洗玻碳电极后，用移液枪移取扣L步骤b得到的聚 酷胺-胺-P孤A功能化石墨締复合物滴涂到玻碳电极表面，于室溫惊干，再移取扣L纳米金溶 液滴涂到修饰的电极表面，于室溫惊干，然后在修饰电极表面滴涂扣L质量分数为0.5 %的 戊二醒溶液活化修饰的电极表面，于4°C条件下活化30min，然后用抑为7.4的0.2mol/L憐酸 盐缓冲液冲洗电极，再滴涂化L多环芳控抗体，并于4°C条件下固定化，再滴涂扣L质量分数 为2%牛血清白蛋白溶液于4°C下封闭化，用抑为7.4的0.2mol/L憐酸盐缓冲液反复冲洗干 净，得到苯并(a)巧纳米免疫传感器，于4°C条件下保存备用。
[0068] 2.上述纳米免疫传感器用于肉制品中苯并(a)巧的快速检测
[0069] 将肉制品II粉碎，取1 Og样品，进行W下的处理，即加入50mL环己烧，超声处理 lOmin后过滤到浓缩瓶中，在70°C旋蒸至20mL左右，移入分液漏斗，用50mL二甲基亚讽萃取， 再用30mL环己烧提取，弃去环己烧层，把提取液旋蒸至lOmL，用5mL二甲基亚讽洗涂浓缩瓶， 合并二甲基亚讽，加入15mL水，摇匀后过活化后的Ci8固相萃取小柱抽干，用30mL正己烧洗 脱，收集洗脱液，蒸干后用2mL甲醇定容，经0.45WI1滤膜过滤，备用。
[0070] 将上述纳米免疫传感器在与步骤a中的电解质溶 液相同的溶液中进行差分脉冲伏 安检测，扫描速度为50mV · s^，电压范围为-0.2V~+0.6V。得到差分脉冲伏安图曰。然后取出 纳米免疫传感器，用去离子水冲洗去除电极表面的电解质，备用。
[0071] 在上述纳米免疫传感器上滴涂上述提取液化L，室溫下解育20min"WAg/AgCl电极 为参比电极、销丝(片）电极为辅助电极，苯并(a)巧纳米免疫传感器为工作电极，组成Ξ电 极测试系统，在与步骤a电解质溶液相同的溶液中进行差分脉冲伏安法的检测，扫描速度为 50mV · s^，电压范围为-0.2V~+0.6V。得到差分脉冲伏安图b。将图a与图b叠加后得到图4。 由图3得到，b图的响应电流值与a图相比，响应电流值发生变化，说明抗原与抗体产生了结 合，也就是说，肉制品中有苯并(a)巧被检测出来。分别进行Ξ次测量，求其平均值，按线性 回归方程式计算其苯并(a)巧的浓度。该肉制品样品中含有苯并(a)巧，其浓度为2.化g/mL。
[0072] 为了验证该方法的有效性，同时利用高效液相色谱方法测定肉制品中的苯并(a) 巧。
[0073] 表1高效液相色谱法和免疫电极法对肉制品样品的检测结果
[0074]
[0075] ~该方法测得的苯并(a)巧的准确率达到96.3%，可W说明此方法在检验苯并(3)巧~ 上具有有效性。
【主权项】
1. 一种用于苯并(a)芘快速检测的纳米免疫传感器的制备方法，其特征是，以玻碳电极 为基础电极，采用聚酰胺-胺树枝状大分子结合聚二烯丙基二甲基氯化铵功能化的石墨烯 修饰玻碳电极，然后滴涂纳米金溶液，纳米金经静电吸附作用固定于修饰电极上，再经戊二 醛偶联固定多环芳烃抗体制备成纳米免疫传感器。2. 如权利要求1所述的用于苯并(a)芘快速检测的纳米免疫传感器的制备方法，其特征 是包括以下步骤： a. 电极预处理 将玻碳电极用粒径为〇.〇5μπι的氧化铝抛光粉抛光打磨至电极表面呈镜面，然后用蒸馏 水冲洗干净，再依次置于体积分数为50%的硝酸、丙酮、去离子水中超声清洗2min~6min， 氮气吹干，备用； b. 聚酰胺-胺-PDDA功能化石墨烯复合物的制备 准确称取〇.2g石墨烯加入到10mL聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液(PDDA，体积分数为 0.25% )中，超声处理25min~35min，水洗三次去除过量的石墨稀，制得PDDA功能化的石墨 稀，取O.OlgFODA功能化的石墨稀加入到10mLN，N-二甲基甲酰胺中，使其浓度为lmg/mL， 超声处理lOmin~20min，得到均勾一致的PDDA功能化石墨稀的N，N-二甲基甲酰胺悬浮液， 备用； 准确称取0.02g聚酰胺-胺溶于10mL甲醇中，使其浓度为2mg/mL，超声处理15min~ 25min，得到均匀透明的聚酰胺-胺的甲醇溶液，然后将聚酰胺-胺的甲醇溶液与PDDA功能化 石墨稀的N，N-二甲基甲酰胺悬浮液按1:1混合均勾，超声处理30min~40min，制得聚酰胺-胺-PDDA功能化石墨烯复合物； c. 纳米金的制备 准确量取50mL0.lmg/mL的氯金酸溶液置于烧杯中，用玻璃棒搅拌下加热至沸腾，迅速 加入2.5mL质量分数为1 %的柠檬酸钠溶液，持续搅拌至溶液颜色变为酒红色，得到纳米金 溶液； d. 纳米免疫传感器的制备 将步骤a中得到的玻碳电极应用三电极系统，即以玻碳电极为工作电极、Ag/AgCl电极 为参比电极、铂丝电极为辅助电极，在-0.2V~+0.6V的电位区间，采用LK98BII型微机电化 学分析系统以50mV·?Γ1的扫描速度在新配制的0.05mol/L硫酸溶液中进行循环伏安扫描10 圈，对玻碳电极表面进行活化处理。冲洗玻碳电极后，用移液枪移取3~6yL步骤b得到的聚 酰胺-胺-PDDA功能化石墨烯复合物滴涂到玻碳电极表面，于室温晾干，再移取2~5yL纳米 金溶液滴涂到修饰的电极表面，于室温晾干，然后在修饰电极表面滴涂3~5yL质量分数为 0.5 %的戊二醛溶液活化修饰的电极表面，于4°C条件下活化25~35min，然后用pH为7.4的 0.2mol/L磷酸盐缓冲液冲洗电极，再滴涂3~6yL多环芳烃抗体，并于4°C条件下固定2h，再 滴涂3~5yL质量分数为2%牛血清白蛋白溶液于4°C下封闭lh，用pH为7.4的0.2mol/L磷酸 盐缓冲液反复冲洗干净，得到苯并(a)芘纳米免疫传感器，于4°C条件下保存备用。3. 如权利要求2所述的用于苯并(a)芘快速检测的纳米免疫传感器的制备方法，其特征 是，所述步骤b中聚酰胺-胺-PDDA功能化石墨稀复合物的制备的具体步骤内容为： 准确称取〇.2g石墨烯加入到10mL聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液(PDDA，体积分数为 0.25% )中，超声处理30min，水洗三次去除过量的石墨稀，制得PDDA功能化的石墨稀，取 O.OlgPDDA功能化的石墨稀加入到lOmLN，N-二甲基甲酰胺中，使其浓度为lmg/mL，超声处 理15min，得到均匀一致的TODA功能化石墨烯的N，N-二甲基甲酰胺悬浮液，备用； 准确称取〇.〇2g聚酰胺-胺溶于10mL甲醇中，使其浓度为2mg/mL，超声处理20min，得到 均匀透明的聚酰胺-胺的甲醇溶液，然后将聚酰胺-胺的甲醇溶液与TODA功能化石墨烯的N， N-二甲基甲酰胺悬浮液按1:1混合均匀，超声处理35min，制得聚酰胺-胺-PDDA功能化石墨 烯复合物。4. 如权利要求2所述的用于苯并(a)芘快速检测的纳米免疫传感器的制备方法，其特征 是，所述步骤d中纳米免疫传感器的制备的具体步骤内容为： 将步骤a中得到的玻碳电极应用三电极系统，即以玻碳电极为工作电极、Ag/AgCl电极 为参比电极、铂丝电极为辅助电极，在-0.2V~+0.6V的电位区间，采用LK98BII型微机电化 学分析系统以50mV·?Γ1的扫描速度在新配制的0.05mol/L硫酸溶液中进行循环伏安扫描10 圈，对玻碳电极表面进行活化处理。冲洗玻碳电极后，用移液枪移取5yL步骤b得到的聚酰 胺-胺-PDDA功能化石墨烯复合物滴涂到玻碳电极表面，于室温晾干，再移取3yL纳米金溶液 滴涂到修饰的电极表面，于室温晾干，然后在修饰电极表面滴涂4yL质量分数为0.5%的戊 二醛溶液活化修饰的电极表面，于4°C条件下活化30min，然后用pH为7.4的0.2mol/L磷酸盐 缓冲液冲洗电极，再滴涂5yL多环芳烃抗体，并于4°C条件下固定2h，再滴涂4yL质量分数为 2 %牛血清白蛋白溶液于4°C下封闭lh，用pH为7.4的0.2mol/L磷酸盐缓冲液反复冲洗干净， 得到苯并(a)芘纳米免疫传感器，于4°C条件下保存备用。5. 使用权利要求1或2择一所述的用于苯并(a)芘快速检测的纳米免疫传感器的检测方 法，其特征是包括以下具体步骤： a. 标准曲线 取苯并(a)芘标准品加入到10mL二甲基亚砜中，再用pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液稀释至 不同浓度梯度，在苯并(a)芘纳米免疫传感器上涂上各个梯度的上述苯并(a)芘标准品溶 液，室温下孵育15~25min，以Ag/AgCl电极为参比电极、铂丝(片）电极为辅助电极，苯并(a) 芘纳米免疫传感器为工作电极，组成三电极测试系统，在1.0mm〇l/LK3[Fe(CN)6]+0.1mol/L KC1+0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH为7.0)进行差分脉冲伏安法的检测（扫描速度为50mV· s<，电压范围为-0.2V~+0.6V);以苯并(a)芘浓度为零时电流值和各浓度梯度的电流值的 差值为纵坐标，苯并(a)芘浓度的对数为横坐标，得到苯并(a)芘的免疫响应电流差值与其 浓度之间的线性曲线，即标准曲线及线性回归方程式，实验在室温条件下进行。 b. 测定 将检测样品（肉制品Ι、π)分别粉碎，肉制品I和II各取l〇g样品，进行以下处理，即加入 50mL环己烧，超声处理lOmin后过滤到浓缩瓶中，在70°C旋蒸至20mL，移入分液漏斗，用50mL 二甲基亚砜萃取，再用30mL环己烷提取，弃去环己烷层，把提取液旋蒸至10mL，用5mL二甲基 亚砜洗涤浓缩瓶，合并二甲基亚砜，加入15mL水，摇匀后过活化后的C18固相萃取小柱抽干， 用30mL正己烧洗脱，收集洗脱液，蒸干后用2mL甲醇定容，经0.45μηι滤膜过滤，备用；用 LK98BII型微机电化学分析系统来测定所述的差分脉冲伏安图，分别进行三次测量并记录 差分脉冲伏安图，按线性回归方程式计算其苯并(a)芘的浓度，此过程在室温条件下下进 行。6. 如权利要求5所述的用于苯并(a)芘快速检测的纳米免疫传感器的检测方法，其特征 是，所述步骤a中，在苯并(a)芘纳米免疫传感器上涂上各个梯度的苯并(a)芘标准品溶液 后，室温下孵育时间为20min。
【专利摘要】本发明属于食品安全快速检测技术领域，具体涉及用于苯并(a)芘快速检测的纳米免疫传感器的制备方法及其检测方法，包括：以玻碳电极为基础电极，采用聚酰胺-胺树枝状大分子结合聚二烯丙基二甲基氯化铵功能化的石墨烯修饰玻碳电极，然后滴涂纳米金溶液，纳米金经静电吸附作用固定于修饰电极上，再经戊二醛偶联固定多环芳烃抗体制备成纳米免疫传感器；将该纳米免疫传感器用于食品中苯并(a)芘的检测，其结果与国标方法结果一致，但该方法灵敏度高、精确度高、检测时间短，是一种简便快速、精确度较高的苯并(a)芘的检测方法，具有广阔的应用前景。
【IPC分类】G01N27/48
【公开号】CN105486741
【申请号】CN201510919410
【发明人】李书国, 王瑞鑫, 冯亚净, 张云焕
【申请人】河北科技大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月11日
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种用于苯并(a)巧快速检测的纳米免疫传感器的制备方法，W及利 用该纳米免疫传感器检测肉制品中的苯并(a)巧的检测方法。
【背景技术】
[0002] 苯并(a)巧是一种由4个苯环构成的多环芳控，常溫下为无色至淡黄色针状晶体， 性质稳定。在煎烤、烧烤、油炸动物性肉制品的过程中，食品会产生苯并(a)巧，人和动物摄 入苯并(a)巧超出限量的肉制品后会导致肿瘤和癌变，对健康造成潜在的威胁。目前，由食 品污染引起的疾病是引起人们广泛关注的食品安全问题之一，许多国家已将苯并(a)巧为 食品有害物质监测的重要内容之一，如德国限定肉制品中苯并(a)巧的残留量为化g/kg，我 国国标限定肉制品中苯并(a)巧的残留量应在化g/kg W下。已报道的苯并(a)巧检测方法有 液相色谱法、气相-质谱联用法、薄层层析法等，但色谱法、层析法等检测方法存在操作繁 琐、耗时长、结果分辨性差等缺点。因此，目前许多工作研究者致力于开发更为快速、准确的 苯并(a)巧检测方法，W提高食品中苯并(a)巧的检测效率，同时要避免出现假阴性或假阳 性的现象。
【发明内容】
[0003] 本发明为解决上述技术的不足，提供一种用于苯并(a)巧快速检测的纳米免疫传 感器的制备方法，还提供一种利用该纳米免疫传感器检测食品中苯并(a)巧的方法，本发明 既具备更加灵敏、快速、易微型化、便于携带和现场检测的优势，同时也具备免疫反应抗原-抗体结合的特异性。
[0004] 为解决W上问题，本发明采用W下技术方案：
[0005] 本发明一种用于苯并(a)巧快速检测的纳米免疫传感器的制备方法，其特征是，W 玻碳电极为基础电极，采用聚酷胺-胺树枝状大分子结合聚二締丙基二甲基氯化锭功能化 的石墨締修饰玻碳电极，然后滴涂纳米金溶液，纳米金经静电吸附作用固定于修饰电极上， 再经戊二醒偶联固定多环芳控抗体制备成纳米免疫传感器。
[0006] 所述的用于苯并(a)巧快速检测的纳米免疫传感器的制备方法，包括W下步骤：
[0007] a.电极预处理
[0008] 将玻碳电极用粒径为0.05皿的氧化侣抛光粉抛光打磨至电极表面呈镜面，然后用 蒸馈水冲洗干净，再依次置于体积分数为50%的硝酸、丙酬、去离子水中超声清洗2min~ 6min，氮气吹干，备用；
[0009] b.聚酷胺-胺-P孤A功能化石墨締复合物的制备
[0010] 准确称取0.2g石墨締加入到lOmL聚二締丙基二甲基氯化锭水溶液(PDDA，体积分 数为0.25 % )中，超声处理25min~35min，水洗Ξ次去除过量的石墨締，制得PDDA功能化的 石墨締，取O.Olg P孤A功能化的石墨締加入到lOmL N，N-二甲基甲酯胺中，使其浓度为Img/ mL，超声处理lOmin~20min，得到均匀一致的P孤A功能化石墨締的N，N-二甲基甲酯胺悬浮 液，备用；
[00川准确称取0.02g聚酷胺-胺溶于10m巧醇中，使其浓度为2mg/mL，超声处理15min~ 25min，得到均匀透明的聚酷胺-胺的甲醇溶液，然后将聚酷胺-胺的甲醇溶液与PDDA功能化 石墨締的N，N-二甲基甲酯胺悬浮液按1:1混合均匀，超声处理30min~40min，制得聚酷胺-胺-P孤A功能化石墨締复合物；
[001^ C.纳米金的制备
[0013] 准确量取50mL O.lmg/血的氯金酸溶液置于烧杯中，用玻璃棒揽拌下加热至沸腾， 迅速加入2.5mL质量分数为1 %的巧樣酸钢溶液，持续揽拌至溶液颜色变为酒红色，得到纳 米金溶液；（注：制备纳米金使用的玻璃器皿在使用前需经铭酸洗液浸泡2地，并冲洗，烘干 处理）。
[0014] d.纳米免疫传感器的制备
[0015] 将步骤a中得到的玻碳电极应用Ξ电极系统，即W玻碳电极为工作电极、Ag/AgCl 电极为参比电极、销丝电极为辅助电极，在-0.2V~+0.6V的电位区间，采用LK98BII型微机 电化学分析系统W50mV · 的扫描速度在新配制的0.05mol/L硫酸溶液中进行循环伏安扫 描10圈，对玻碳电极表面进行活化处理。冲洗玻碳电极后，用移液枪移取3~化L步骤b得到 的聚酷胺-胺-PDDA功能化石墨締复合物滴涂到玻碳电极表面，于室溫惊干，再移取2~化L 纳米金溶液滴涂到修饰的电极表面，于室溫惊干，然后在修饰电极表面滴涂3~化L质量分 数为0.5%的戊二醒溶液活化修饰的电极表面，于4°C条件下活化25~35min，然后用pH为 7.4的0.2111〇1/1憐酸盐缓冲液冲洗电极，再滴涂3~化1^多环芳控抗体，并于4°0条件下固定 2h，再滴涂3~扣L质量分数为2 %牛血清白蛋白溶液于4°C下封闭化，用抑为7.4的0.2mol/L 憐酸盐缓冲液反复冲洗干净，得到苯并(a)巧纳米免疫传感器，于4°C条件下保存备用。
[0016] 优选的，所述步骤b中聚酷胺-胺-PDDA功能化石墨締复合物的制备的具体步骤内 容为：
[0017] 准确称取0.2g石墨締加入到lOmL聚二締丙基二甲基氯化锭水溶液(PDDA，体积分 数为0.25% )中，超声处理30min，水洗Ξ次去除过量的石墨締，制得PDDA功能化的石墨締， 取O.Olg P孤A功能化的石墨締加入到lOmL N，N-二甲基甲酯胺中，使其浓度为Img/mL，超声 处理15min，得到均匀一致的P孤A功能化石墨締的N，N-二甲基甲酯胺悬浮液，备用；
[0018] 准确称取0.0?聚酷胺-胺溶于lOmL甲醇中，使其浓度为2mg/mL，超声处理20min， 得到均匀透明的聚酷胺-胺的甲醇溶液，然后将聚酷胺-胺的甲醇溶液与PDDA功能化石墨締 的N，N-二甲基甲酯胺悬浮液按1:1混合均匀，超声处理35min，制得聚酷胺-胺-PDDA功能化 石墨締复合物。
[0019] 优选的，所述步骤d中纳米免疫传感器的制备的具体步骤内容为：
[0020] 将步骤a中得到的玻碳电极应用Ξ电极系统，即W玻碳电极为工作电极、Ag/AgCl 电极为参比电极、销丝电极为辅助电极，在-0.2V~+0.6V的电位区间，采用LK98BII型微机 电化学分析系统W50mV · 的扫描速度在新配制的0.05mol/L硫酸溶液中进行循环伏安扫 描10圈，对玻碳电极表面进行活化处理。冲洗玻碳电极后，用移液枪移取扣L步骤b得到的聚 酷胺-胺-P孤A功能化石墨締复合物滴涂到玻碳电极表面，于室溫惊干，再移取化L纳米金溶 液滴涂到修饰的电极表面，于室溫惊干，然后在修饰电极表面滴涂化L质量分数为0.5 %的 戊二醒溶液活化修饰的电极表面，于4°C条件下活化30min，然后用抑为7.4的ο. 2mol/L憐酸 盐缓冲液冲洗电极，再滴涂化L多环芳控抗体，并于4°C条件下固定化，再滴涂化L质量分数 为2%牛血清白蛋白溶液于4°C下封闭化，用抑为7.4的0.2mol/L憐酸盐缓冲液反复冲洗干 净，得到苯并(a)巧纳米免疫传感器，于4°C条件下保存备用。
[0021] 使用所述的用于苯并(a)巧快速检测的纳米免疫传感器的检测方法，包括W下具 体步骤：
[0022] a.标准曲线
[0023] 取苯并(a)巧标准品加入到lOmL二甲基亚讽中，再用抑为7.4的憐酸盐缓冲溶液稀 释至不同浓度梯度，在苯并(a)巧纳米免疫传感器上涂上各个梯度的上述苯并(a)巧标准品 溶液，室溫下解育15~25min，WAg/AgCl电极为参比电极、销丝(片）电极为辅助电极，苯并 (a)巧纳米免疫传感器为工作电极，组成Ξ电极测试系统，在l.Ommol/L K3[Fe(CN)6] + 0.1mol/L KCl+0.2mol/L憐酸盐缓冲溶液(pH为7.0)进行差分脉冲伏安法的检测（扫描速度 为50mV · ，电压范围为-0.2V~+0.6V); W苯并(a)巧浓度为零时电流值和各浓度梯度的 电流值的差值为纵坐标，苯并(a)巧浓度的对数为横坐标，得到苯并(a)巧的免疫响应电流 差值与其浓度之间的线性曲线，即标准曲线及线性回归方程式，实验在室溫条件下进行。 [0024] b.测定
[0025] 将检测样品（肉制品1、11)分别粉碎，肉制品I和II各取lOg样品，进行W下处理，即 加入50mL环己烧，超声处理lOmin后过滤到浓缩瓶中，在70°C旋蒸至20血，移入分液漏斗，用 50血二甲基亚讽萃取，再用30血环己烧提取，弃去环己烧层，把提取液旋蒸至10血，用5血二 甲基亚讽洗涂浓缩瓶，合并二甲基亚讽，加入15mL水，摇匀后过活化后的Cl姻相萃取小柱抽 干，用30mL正己烧洗脱，收集洗脱液，蒸干后用2mL甲醇定容，经0.45皿滤膜过滤，备用；用 LK98BII型微机电化学分析系统来测定所述的差分脉冲伏安图，分别进行Ξ次测量并记录 差分脉冲伏安图，按线性回归方程式计算其苯并(a)巧的浓度，此过程在室溫条件下下进 行。
[0026] 优选的，所述的用于苯并(a)巧快速检测的纳米免疫传感器的检测方法，所述步骤 a中，在苯并(a)巧纳米免疫传感器上涂上各个梯度的苯并(a)巧标准品溶液后，室溫下解育 时间为20min。
[0027] 本发明与现有技术相比具有W下显著的优点：
[0028] ①本发明的纳米免疫传感器用于检测肉制品中的苯并(a)巧法与国标法相比，缩 短了苯并(a)巧的检验时间，提高了检测效率。
[0029] ②简化了样品前处理步骤，同时不限制样品提取液的颜色。
[0030] ③利用PDDA功能化石墨締与纳米金间正负电荷吸引，提高 了纳米免疫传感器的稳 定性。
[0031] ④制备简单、操作简便、成本较低等优点，降低了检验苯并(a)巧的成本。
【附图说明】
[0032] 图1为不同电极修饰材料的循环伏安表征图。
[0033] 图2为基于本专利构建的纳米免疫传感器用于苯并(a)巧检测的响应电流图。
[0034] 图3为肉制品I中苯并(a)巧检测的差分脉冲伏安图。
[0035] 图4为肉制品II中苯并(a)巧检测的差分脉冲伏安图。
【具体实施方式】
[0036] 下面参照附图对本发明【具体实施方式】进行详细说明。
[0037] 参见图1、图2、图3、图4。
[003引实施例1
[0039] 用纳米免疫传感器检测肉制品I中苯并(a)巧
[0040] 1.-种用于苯并(a)巧快速检测的纳米免疫传感器的制备方法 [0041 ] a.电极预处理
[0042] 将玻碳电极用粒径为0.05皿的氧化侣抛光粉抛光打磨至电极表面呈镜面，然后用 蒸馈水冲洗干净，再依次置于体积分数为50%的硝酸、丙酬、去离子水中超声清洗3min，氮 气吹干，备用；
[0043] b.聚酷胺-胺-P孤A功能化石墨締复合物的制备
[0044] 准确称取0.2g石墨締加入到lOmL聚二締丙基二甲基氯化锭水溶液(PDDA，体积分 数为0.25% )中，超声处理30min，水洗Ξ次去除过量的石墨締，制得PDDA功能化的石墨締， 取O.Olg P孤A功能化的石墨締加入到lOmL N，N-二甲基甲酯胺中，使其浓度为Img/mL，超声 处理15min，得到均匀一致的P孤A功能化石墨締的N，N-二甲基甲酯胺悬浮液，备用；
[0045] 准确称取0.0?聚酷胺-胺溶于lOmL甲醇中，使其浓度为2mg/mL，超声处理20min， 得到均匀透明的聚酷胺-胺的甲醇溶液，然后将聚酷胺-胺的甲醇溶液与PDDA功能化石墨締 的N，N-二甲基甲酯胺悬浮液按1:1混合均匀，超声处理35min，制得聚酷胺-胺-PDDA功能化 石墨締复合物；
[0046] C.纳米金的制备
[0047] 准确量取50mL 0.1 mg/血的氯金酸溶液置于烧杯中，用玻璃棒揽拌下加热至沸腾， 迅速加入2.5mL质量分数为1 %的巧樣酸钢溶液，持续揽拌至溶液颜色变为酒红色，得到纳 米金溶液。（注：制备纳米金使用的玻璃器皿在使用前需经铭酸洗液浸泡2地，并冲洗，烘干 处理）
[004引d.纳米免疫传感器的制备
[0049] 将步骤a中得到的玻碳电极应用Ξ电极系统，即W玻碳电极为工作电极、Ag/AgCl 电极为参比电极、销丝电极为辅助电极，在-0.2V~+0.6V的电位区间，采用LK98BII型微机 电化学分析系统W50mV · 的扫描速度在新配制的0.05mol/L硫酸溶液中进行循环伏安扫 描10圈，对玻碳电极表面进行活化处理。冲洗玻碳电极后，用移液枪移取化L步骤b得到的聚 酷胺-胺-P孤A功能化石墨締复合物滴涂到玻碳电极表面，于室溫惊干，再移取化L纳米金溶 液滴涂到修饰的电极表面，于室溫惊干，然后在修饰电极表面滴涂化L质量分数为0.5 %的 戊二醒溶液活化修饰的电极表面，于4°C条件下活化30min，然后用抑为7.4的0.2mol/L憐酸 盐缓冲液冲洗电极，再滴涂化L多环芳控抗体，并于4°C条件下固定化，再滴涂化L质量分数 为2%牛血清白蛋白溶液于4°C下封闭化，用抑为7.4的0.2mol/L憐酸盐缓冲液反复冲洗干 净，得到苯并(a)巧纳米免疫传感器，于4°C条件下保存备用。
[0050] 图1为不同修饰阶段电极的循环伏安图，a为玻碳电极，b为聚酷胺-胺-PDDA功能化 石墨締-纳米金修饰后的电极，C为在制备的纳米免疫传感器上滴加苯并(a)巧后的电极。由 图可知，a电极(玻碳电极)在电解质溶液中出现一对可逆的氧化还原峰，当电极修饰后，氧 化还原峰电流值增大，运是因为修饰物具有快速的电子传递能力。而滴加苯并(a)巧后(进 行免疫反应后），氧化还原峰电流值大幅降低，表面抗原-抗体免疫反应后生成的免疫复合 物在部分空间上阻碍了媒介体和底物的扩散，电子传递受到了阻碍所致。
[0051] 2.上述纳米免疫传感器用于肉制品中苯并(a)巧的快速检测
[0052] 取50mg苯并(a)巧标准品加入到lOmL二甲基亚讽中，再用抑为7.4的憐酸盐缓冲溶 液定容至 lOOmL，然后取该液依次稀释为 0ng/mL、0.01ng/mL、lng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、 10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL浓度梯度，备用。在权利要求2所述的纳米免疫传感器上涂上各 个梯度的上述苯并(a)巧标准品溶液，室溫下解育20min"WAg/AgCl电极为参比电极、销丝 (片）电极为辅助电极，苯并（a)巧纳米免疫传感器为工作电极，组成Ξ电极测试系统，在 l.Ommol/L K3[Fe(CN)6]+0.1mol/L KCl+0.2mol/L憐酸盐缓冲溶液(抑=7.0)进行差分脉冲 伏安法的检测。差分脉冲伏安法的检测参数如下，扫描速度为50mV · S-1，电压范围为-0.2V ~+0.6V。^苯并(a)巧浓度为零时电流值和各浓度梯度的差值为纵坐标，苯并(a)巧浓度的 对数为横坐标，得到苯并(a)巧的免疫响应电流差值与其浓度之间的线性曲线，即标准曲线 及线性回归方程式 AIpc(μA)=4.09621g[C/(ng/mL)]+2.3733，相关系数R2 = 0.9925。其中 A Ipc(μΑ)为不同浓度苯并(a)巧的电流响应差值值，μΑ，C为苯并(a)巧的浓度，ng/mL。
[005；3] b.测定
[0化4] 将肉制品I粉碎，取1 Og样品，进行W下的处理，即加入50mL环己烧，超声处理1 Omiη 后过滤到浓缩瓶中，在7〇°C旋蒸至20mL，移入分液漏斗，用50mL二甲基亚讽萃取，再用30mL 环己烧提取，弃去环己烧层，把提取液旋蒸至lOmL，用5mL二甲基亚讽洗涂浓缩瓶，合并二甲 基亚讽，加入15血水，摇匀后过活化后的Cl姻相萃取小柱抽干，用30mL正己烧洗脱，收集洗 脱液，蒸干后用2m巧醇定容，经0.45μπι滤膜过滤，备用。
[0055] 将上述纳米免疫传感器在与步骤a中的电解质溶液相同的溶液中进行差分脉冲伏 安检测，扫描速度为50mV · s^，电压范围为-0.2V~+0.6V。得到差分脉冲伏安图曰。然后取出 纳米免疫传感器，用去离子水冲洗去除电极表面的电解质，备用。
[0056] 在上述纳米免疫传感器上滴涂上述提取液化L，室溫下解育20miruWAg/AgCl电极 为参比电极、销丝(片）电极为辅助电极，苯并(a)巧纳米免疫传感器为工作电极，组成Ξ电 极测试系统，在与步骤a电解质溶液相同的溶液中进行差分脉冲伏安法的检测，扫描速度为 50mV · s^，电压范围为-0.2V~+0.6V。得到差分脉冲伏安图b。将图a与图b叠加后得到图3。 由图3得到，b图的响应电流值与a图相比，响应电流值变小，说明抗原与抗体产生了结合，也 就是说，肉制品中有苯并(a)巧被检测出来。分别进行Ξ次测量，求其平均值，按线性回归方 程式计算其苯并(a)巧的浓度。该肉制品样品中含有苯并(a)巧，其浓度为4.4ng/mL。
[0化7]实施例2
[0058] 用纳米免疫传感器检测肉制品II中苯并(a)巧
[0059] 1. 一种用于苯并(a)巧快速检测的纳米免疫传感器的制备方法
[0060] a.电极预处理
[0061] 同实施例1
[0062] b.聚酷胺-胺-石墨締复合物的制备
[0063] 同实施例1
[0064] c.纳米金的制备 [00化]同实施例1
[0066] d.纳米免疫传感器的制备
[0067] 将步骤a中得到的玻碳电极应用Ξ电极系统，即W玻碳电极为工作电极、Ag/AgCl 电极为参比电极、销丝电极为辅助电极，在-0.2V~+0.6V的电位区间，采用LK98BII型微机 电化学分析系统W50mV · 的扫描速度在新配制的0.05mol/L硫酸溶液中进行循环伏安扫 描10圈，对玻碳电极表面进行活化处理。冲洗玻碳电极后，用移液枪移取扣L步骤b得到的聚 酷胺-胺-P孤A功能化石墨締复合物滴涂到玻碳电极表面，于室溫惊干，再移取扣L纳米金溶 液滴涂到修饰的电极表面，于室溫惊干，然后在修饰电极表面滴涂扣L质量分数为0.5 %的 戊二醒溶液活化修饰的电极表面，于4°C条件下活化30min，然后用抑为7.4的0.2mol/L憐酸 盐缓冲液冲洗电极，再滴涂化L多环芳控抗体，并于4°C条件下固定化，再滴涂扣L质量分数 为2%牛血清白蛋白溶液于4°C下封闭化，用抑为7.4的0.2mol/L憐酸盐缓冲液反复冲洗干 净，得到苯并(a)巧纳米免疫传感器，于4°C条件下保存备用。
[0068] 2.上述纳米免疫传感器用于肉制品中苯并(a)巧的快速检测
[0069] 将肉制品II粉碎，取1 Og样品，进行W下的处理，即加入50mL环己烧，超声处理 lOmin后过滤到浓缩瓶中，在70°C旋蒸至20mL左右，移入分液漏斗，用50mL二甲基亚讽萃取， 再用30mL环己烧提取，弃去环己烧层，把提取液旋蒸至lOmL，用5mL二甲基亚讽洗涂浓缩瓶， 合并二甲基亚讽，加入15mL水，摇匀后过活化后的Ci8固相萃取小柱抽干，用30mL正己烧洗 脱，收集洗脱液，蒸干后用2mL甲醇定容，经0.45WI1滤膜过滤，备用。
[0070] 将上述纳米免疫传感器在与步骤a中的电解质溶 液相同的溶液中进行差分脉冲伏 安检测，扫描速度为50mV · s^，电压范围为-0.2V~+0.6V。得到差分脉冲伏安图曰。然后取出 纳米免疫传感器，用去离子水冲洗去除电极表面的电解质，备用。
[0071] 在上述纳米免疫传感器上滴涂上述提取液化L，室溫下解育20min"WAg/AgCl电极 为参比电极、销丝(片）电极为辅助电极，苯并(a)巧纳米免疫传感器为工作电极，组成Ξ电 极测试系统，在与步骤a电解质溶液相同的溶液中进行差分脉冲伏安法的检测，扫描速度为 50mV · s^，电压范围为-0.2V~+0.6V。得到差分脉冲伏安图b。将图a与图b叠加后得到图4。 由图3得到，b图的响应电流值与a图相比，响应电流值发生变化，说明抗原与抗体产生了结 合，也就是说，肉制品中有苯并(a)巧被检测出来。分别进行Ξ次测量，求其平均值，按线性 回归方程式计算其苯并(a)巧的浓度。该肉制品样品中含有苯并(a)巧，其浓度为2.化g/mL。
[0072] 为了验证该方法的有效性，同时利用高效液相色谱方法测定肉制品中的苯并(a) 巧。
[0073] 表1高效液相色谱法和免疫电极法对肉制品样品的检测结果
[0074]
[0075] ~该方法测得的苯并(a)巧的准确率达到96.3%，可W说明此方法在检验苯并(3)巧~ 上具有有效性。
【主权项】
1. 一种用于苯并(a)芘快速检测的纳米免疫传感器的制备方法，其特征是，以玻碳电极 为基础电极，采用聚酰胺-胺树枝状大分子结合聚二烯丙基二甲基氯化铵功能化的石墨烯 修饰玻碳电极，然后滴涂纳米金溶液，纳米金经静电吸附作用固定于修饰电极上，再经戊二 醛偶联固定多环芳烃抗体制备成纳米免疫传感器。2. 如权利要求1所述的用于苯并(a)芘快速检测的纳米免疫传感器的制备方法，其特征 是包括以下步骤： a. 电极预处理 将玻碳电极用粒径为〇.〇5μπι的氧化铝抛光粉抛光打磨至电极表面呈镜面，然后用蒸馏 水冲洗干净，再依次置于体积分数为50%的硝酸、丙酮、去离子水中超声清洗2min~6min， 氮气吹干，备用； b. 聚酰胺-胺-PDDA功能化石墨烯复合物的制备 准确称取〇.2g石墨烯加入到10mL聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液(PDDA，体积分数为 0.25% )中，超声处理25min~35min，水洗三次去除过量的石墨稀，制得PDDA功能化的石墨 稀，取O.OlgFODA功能化的石墨稀加入到10mLN，N-二甲基甲酰胺中，使其浓度为lmg/mL， 超声处理lOmin~20min，得到均勾一致的PDDA功能化石墨稀的N，N-二甲基甲酰胺悬浮液， 备用； 准确称取0.02g聚酰胺-胺溶于10mL甲醇中，使其浓度为2mg/mL，超声处理15min~ 25min，得到均匀透明的聚酰胺-胺的甲醇溶液，然后将聚酰胺-胺的甲醇溶液与PDDA功能化 石墨稀的N，N-二甲基甲酰胺悬浮液按1:1混合均勾，超声处理30min~40min，制得聚酰胺-胺-PDDA功能化石墨烯复合物； c. 纳米金的制备 准确量取50mL0.lmg/mL的氯金酸溶液置于烧杯中，用玻璃棒搅拌下加热至沸腾，迅速 加入2.5mL质量分数为1 %的柠檬酸钠溶液，持续搅拌至溶液颜色变为酒红色，得到纳米金 溶液； d. 纳米免疫传感器的制备 将步骤a中得到的玻碳电极应用三电极系统，即以玻碳电极为工作电极、Ag/AgCl电极 为参比电极、铂丝电极为辅助电极，在-0.2V~+0.6V的电位区间，采用LK98BII型微机电化 学分析系统以50mV·?Γ1的扫描速度在新配制的0.05mol/L硫酸溶液中进行循环伏安扫描10 圈，对玻碳电极表面进行活化处理。冲洗玻碳电极后，用移液枪移取3~6yL步骤b得到的聚 酰胺-胺-PDDA功能化石墨烯复合物滴涂到玻碳电极表面，于室温晾干，再移取2~5yL纳米 金溶液滴涂到修饰的电极表面，于室温晾干，然后在修饰电极表面滴涂3~5yL质量分数为 0.5 %的戊二醛溶液活化修饰的电极表面，于4°C条件下活化25~35min，然后用pH为7.4的 0.2mol/L磷酸盐缓冲液冲洗电极，再滴涂3~6yL多环芳烃抗体，并于4°C条件下固定2h，再 滴涂3~5yL质量分数为2%牛血清白蛋白溶液于4°C下封闭lh，用pH为7.4的0.2mol/L磷酸 盐缓冲液反复冲洗干净，得到苯并(a)芘纳米免疫传感器，于4°C条件下保存备用。3. 如权利要求2所述的用于苯并(a)芘快速检测的纳米免疫传感器的制备方法，其特征 是，所述步骤b中聚酰胺-胺-PDDA功能化石墨稀复合物的制备的具体步骤内容为： 准确称取〇.2g石墨烯加入到10mL聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液(PDDA，体积分数为 0.25% )中，超声处理30min，水洗三次去除过量的石墨稀，制得PDDA功能化的石墨稀，取 O.OlgPDDA功能化的石墨稀加入到lOmLN，N-二甲基甲酰胺中，使其浓度为lmg/mL，超声处 理15min，得到均匀一致的TODA功能化石墨烯的N，N-二甲基甲酰胺悬浮液，备用； 准确称取〇.〇2g聚酰胺-胺溶于10mL甲醇中，使其浓度为2mg/mL，超声处理20min，得到 均匀透明的聚酰胺-胺的甲醇溶液，然后将聚酰胺-胺的甲醇溶液与TODA功能化石墨烯的N， N-二甲基甲酰胺悬浮液按1:1混合均匀，超声处理35min，制得聚酰胺-胺-PDDA功能化石墨 烯复合物。4. 如权利要求2所述的用于苯并(a)芘快速检测的纳米免疫传感器的制备方法，其特征 是，所述步骤d中纳米免疫传感器的制备的具体步骤内容为： 将步骤a中得到的玻碳电极应用三电极系统，即以玻碳电极为工作电极、Ag/AgCl电极 为参比电极、铂丝电极为辅助电极，在-0.2V~+0.6V的电位区间，采用LK98BII型微机电化 学分析系统以50mV·?Γ1的扫描速度在新配制的0.05mol/L硫酸溶液中进行循环伏安扫描10 圈，对玻碳电极表面进行活化处理。冲洗玻碳电极后，用移液枪移取5yL步骤b得到的聚酰 胺-胺-PDDA功能化石墨烯复合物滴涂到玻碳电极表面，于室温晾干，再移取3yL纳米金溶液 滴涂到修饰的电极表面，于室温晾干，然后在修饰电极表面滴涂4yL质量分数为0.5%的戊 二醛溶液活化修饰的电极表面，于4°C条件下活化30min，然后用pH为7.4的0.2mol/L磷酸盐 缓冲液冲洗电极，再滴涂5yL多环芳烃抗体，并于4°C条件下固定2h，再滴涂4yL质量分数为 2 %牛血清白蛋白溶液于4°C下封闭lh，用pH为7.4的0.2mol/L磷酸盐缓冲液反复冲洗干净， 得到苯并(a)芘纳米免疫传感器，于4°C条件下保存备用。5. 使用权利要求1或2择一所述的用于苯并(a)芘快速检测的纳米免疫传感器的检测方 法，其特征是包括以下具体步骤： a. 标准曲线 取苯并(a)芘标准品加入到10mL二甲基亚砜中，再用pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液稀释至 不同浓度梯度，在苯并(a)芘纳米免疫传感器上涂上各个梯度的上述苯并(a)芘标准品溶 液，室温下孵育15~25min，以Ag/AgCl电极为参比电极、铂丝(片）电极为辅助电极，苯并(a) 芘纳米免疫传感器为工作电极，组成三电极测试系统，在1.0mm〇l/LK3[Fe(CN)6]+0.1mol/L KC1+0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH为7.0)进行差分脉冲伏安法的检测（扫描速度为50mV· s<，电压范围为-0.2V~+0.6V);以苯并(a)芘浓度为零时电流值和各浓度梯度的电流值的 差值为纵坐标，苯并(a)芘浓度的对数为横坐标，得到苯并(a)芘的免疫响应电流差值与其 浓度之间的线性曲线，即标准曲线及线性回归方程式，实验在室温条件下进行。 b. 测定 将检测样品（肉制品Ι、π)分别粉碎，肉制品I和II各取l〇g样品，进行以下处理，即加入 50mL环己烧，超声处理lOmin后过滤到浓缩瓶中，在70°C旋蒸至20mL，移入分液漏斗，用50mL 二甲基亚砜萃取，再用30mL环己烷提取，弃去环己烷层，把提取液旋蒸至10mL，用5mL二甲基 亚砜洗涤浓缩瓶，合并二甲基亚砜，加入15mL水，摇匀后过活化后的C18固相萃取小柱抽干， 用30mL正己烧洗脱，收集洗脱液，蒸干后用2mL甲醇定容，经0.45μηι滤膜过滤，备用；用 LK98BII型微机电化学分析系统来测定所述的差分脉冲伏安图，分别进行三次测量并记录 差分脉冲伏安图，按线性回归方程式计算其苯并(a)芘的浓度，此过程在室温条件下下进 行。6. 如权利要求5所述的用于苯并(a)芘快速检测的纳米免疫传感器的检测方法，其特征 是，所述步骤a中，在苯并(a)芘纳米免疫传感器上涂上各个梯度的苯并(a)芘标准品溶液 后，室温下孵育时间为20min。
【专利摘要】本发明属于食品安全快速检测技术领域，具体涉及用于苯并(a)芘快速检测的纳米免疫传感器的制备方法及其检测方法，包括：以玻碳电极为基础电极，采用聚酰胺-胺树枝状大分子结合聚二烯丙基二甲基氯化铵功能化的石墨烯修饰玻碳电极，然后滴涂纳米金溶液，纳米金经静电吸附作用固定于修饰电极上，再经戊二醛偶联固定多环芳烃抗体制备成纳米免疫传感器；将该纳米免疫传感器用于食品中苯并(a)芘的检测，其结果与国标方法结果一致，但该方法灵敏度高、精确度高、检测时间短，是一种简便快速、精确度较高的苯并(a)芘的检测方法，具有广阔的应用前景。
【IPC分类】G01N27/48
【公开号】CN105486741
【申请号】CN201510919410
【发明人】李书国, 王瑞鑫, 冯亚净, 张云焕
【申请人】河北科技大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月11日
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