一种坤灵丸的高效液相指纹图谱检测方法
一种坤灵丸的高效液相指纹图谱检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种坤灵丸的高效液相指纹图谱检测方法，属于药物分析技术领域。
【背景技术】
[0002] 坤灵丸是一种中药复方制剂，其功能主治为调经养血，逐癒生新。用于月经不调， 或多或少，行经腹痛，子宫寒冷，久不受孕，习惯性流产，赤白带下，崩漏不止，病久气虚，肾 亏腰痛。
[0003] 坤灵丸的处方如下：
[0004] 【处方】
[0005] ( -）香附（制）37g甘草7g白薇14g益母草14g黄茂14g鸡冠花14g麦冬 14g北五味子14g地黄14g红花14g木通lOg白术（炒）14g赤石脂14g巧冬14g厚朴 lOg肉巧蓉（制）14g白巧（酒炒）14g
[0006] (二）香附（制）37g荆芥lOg牡丹皮14g阿胶14g当归14g蔓本lOg红参14g 鹿角胶14g川贝母14g没药（炒）14g砂仁14g延胡索14g小茵香（盐制）14g龟甲胶 14g川写14g
[0007] 【制法】W上处方（一）十走味，加水煎煮二次，第一次3小时，第二次2小时，合并 煎液，滤过，滤液放置24小时，取上清液加入米醋280g，浓缩成稠膏。W上处方（二）十五 味，粉碎成中粉，加入上述稠膏中，混匀，干燥，粉碎成细粉，过筛，混匀，用黄酒泛丸，制成 1800丸，包糖衣或薄膜衣，打光，干燥，即得。
[0008] 由于中药化学成分复杂，作用机制不明确，致使现有中药制药技术难W确保中药 产品质量稳定性，中药指纹图谱建立的可W全面反映中药内在化学成分的种类与数量，进 而反映中药的质量。现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确，采用中药指纹图谱的方式， 将有效地表征中药质量。指纹图谱已为国际社会所认可，有利于中药及产品进入国际市场。
[0009] 坤灵丸现行标准收载于中华人民共和国卫生部药品标准《中药成方制剂》第十册， 标准中未涉及任何针对药味的定性定量控制项目，目前，没有对坤灵丸进行指纹图谱研究 的报道，而指纹图谱能充分表征中药制剂的整体性和复杂性，因此发明人对坤灵丸的有效 成分进行了研究。发现其中含有多种水溶性与醇溶性成分，本发明人有针对性的对送些成 分进行了研究，建立了一种坤灵丸的标准指纹图谱，利用该图谱对生产中的坤灵丸进行质 量监督，W确保产品质量。
【发明内容】
：
[0010] 本发明提供一种坤灵丸高效液相标准对照指纹图谱，其建立方法如下：
[0011] 1)供试品溶液制备：
[0012] 取坤灵丸，加入甲醇或己醇水溶液，超声溶解，再加入溶剂调整溶液浓度，微孔滤 膜滤过，取滤液，既得；
[001引。获得色谱图：
[0014] 供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图；
[0015] 3)生成对照指纹图谱
[0016] 选择合格的多批坤灵丸色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价 系统A版"软件，计算得相似度结果，并生成标准对照指纹图谱；
[0017] 其中高效液相色谱的色谱条件如下：
[0018] 色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填料，（4. 6巧50mm，5um);流动相为己 腊-0. 1 %~5%甲酸水溶液梯度洗脱，见表1 ;流速为0. 6~1. 5ml/min ;柱温为25~4(TC; 进样量为5~20 μ L ;检测波长为274皿。
[0019] 梯度洗脱表：
[0020]
[0024] 根据需要可W加入有效成分的标准对照品W作为参照物峰。
[00巧]其中，优选的标准对照指纹图谱的建立方法如下：
[002引1)供试品溶液的制备，方法如下：
[0027] 取坤灵丸适量（糖衣丸除去糖衣），研成细粉，精密称取0. 3~0. 7g至5~15ml 容量瓶中，加30%~70%甲醇适量，超声处理20~40min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀， 过0.45 μ m微孔滤膜，取续滤液即得。优选，取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精 密称取0. 5g至10ml容量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理30min，冷却至室温，定容至刻 度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液即得。
[002引 。W丹皮酪作为参照物制备标准对照品溶液，方法如下：
[0029] 精密称取丹皮酪对照品适量，加30%~70%甲醇溶解制成每1ml含8~20 μ g的 溶液，即得；优选加50%甲醇制成每1ml含15 μ g的溶液。
[0030] 扣标准对照指纹图谱的确定，方法如下：
[0031] 将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，
[0032] 将多批坤灵丸样品的指纹图谱中8个峰为共有峰，利用中药色谱指纹图谱相似度 评价系统（2. 0版），拟合确定坤灵丸对照指纹图谱，其中，与丹皮酪对照品峰保留时间相同 的色谱峰为6号峰，其他7个色谱峰的相对保留时间分别为；0. 08 (1)、0. 13 (2)、0. 14(3)、 0. 57 (4)、0. 79 巧）、1. 00 化）、1. 08 (7)、1. 13 (8)，各峰的相对保留时间在 ±3% ~±10%W 内
[0033] 本发明还提供一种坤灵丸的高效液相色谱指纹图谱检测方法，其特征在于，包括 如下步骤
[0034] 1)待测样品溶液的制备：
[0035] 取坤灵丸样品，加入甲醇或己醇水溶液，超声溶解，再加入溶剂调整溶液浓度，微 孔滤膜滤过；
[0036] 2)待测样品溶液指纹图谱的测定：
[0037] 取滤液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图：
[0038] 其中的色谱条件如下：
[0039] 色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填料（4. 6巧50mm，5um);流动相为己 腊-0. 1%~5%甲酸水溶液梯度洗脱，见表1 ;流速为0. 6~1. 5ml/min ;柱温为25~4(TC; 进样量为5-20 μ L ;检测波长为272-276皿。
[0040] 优选W己腊-1 %甲酸为流动相；流速1. 0ml/分钟；柱温30。进样量为10 μ L ;检 测波长；274皿。
[0041] 表1梯度洗脱表
[0042]
[0043] 洗脱表优选：
[0044]
[0045] 3)待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
[0046] 将待测样品的色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版"软件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度；
[0047] 其中，优选的本发明的待测样品溶液的制备如下：
[0048] 取坤灵丸适量（糖衣丸除去糖衣），研成细粉，精密称取0. 3~0. 7g至5~15ml 容量瓶中，加30%~70%甲醇适量，超声处理20~40min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀， 过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图；
[0049] 优选，；取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取0. 5g至10ml容量瓶 中，加50 %甲醇适量，超声处理30min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤 膜，取续滤液既得。
[0050] 其中，待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
[0051] 将待测样品的色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版"软件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度；相似度为0. 90 W上为合格， 相似度为0. 95 W上为相符，相似度为0. 98 W上为相同。
[0052] 本发明通过W上指纹图谱的建立，进一步的确立了坤灵丸的分析方法，采用该方 法可W隹确辨别坤灵丸，根据和标准指纹图谱的比较，得出鉴别结论，越和标准指纹图谱接 近，产品质量越好，相似度可W使用计算机方法确认，如相似度为0. 90 W上为合格，相似度 为0. 95 W上为相符，相似度为0. 98 W上为相同。
[0053] 上述方法特别是坤灵丸的标准对照指纹图谱的制备方法是经过筛选获得的，W下 为筛选过程：
[0054] 1. 1仪器与试药
[00巧]仪器；Waters2695-2996高效液相色谱仪；Empower II色谱工作站；Milli-Q超纯 水器；万分之一天平（赛多利斯）；十万分之一天平（赛多利斯）。
[0056] 色谱柱；Agilent Z0RBAX(4. 6巧50mm，5 μ m);
[0057] 试剂；甲醇（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）；己腊（色谱纯，天津市康科德 科技有限公司）；甲酸（分析纯，天津市化学试剂一厂）；水为超纯水。
[0058] 对照品；中国药品生物制品检定所；丹皮酪（批号：110708-200506,含量测定用，
[0059] 为中国药品生物制品检定所提供；
[0060] 样品；坤灵丸（天津天±力（迂宁）制药有限责任公司，共11化具体批号见表2， 均经质检中必检验合格。
[0061] 表2坤灵丸样品信息表
[0062]
[0063]
[0064] 1. 2分析条件的选择
[0065] 1. 2. 1检测波长的选择
[0066] 参照产品中丹皮酪含量测定色谱条件，选用色谱柱；Agilent Z0RBAX SB-Cis (4. 6 X 250mm，5 μ m)，W表3中梯度洗脱条件洗脱，进行检测波长的选择考察。
[0067] 表3梯度洗脱表
[0068]
[0069] 文献报道的检测波长常常是为测定某一特定成分的含量，不一定完全适合指纹图 谱的需要，为了获得多层次的信息，需要选择数个不同的检测波长，同时坤灵丸为大复方制 剂，含有31味中药材，其所含化学成分很多。因此，在试验中应使用DAD检测器全波长检测 获得3D指纹图谱，见图1。结果表明274nm处可W得到较多的化学信息，故选择274nm作为 检测波长，见 图2。
[0070] 1.2. 2提取溶剂的选择
[0071] 取坤灵丸适量，研成细粉，精密称取0. 5g，分别加水、30%甲醇溶液、50%甲醇溶 液、70%甲醇溶液、甲醇25血，超声处理30min，取上清液过0. 45 μ m滤膜，即得。
[0072] 由图3显示，50%甲醇与70%甲醇溶液提取样品得到谱峰信息较全且相似，从经 济及环境污染的角度考虑，最终选取50%甲醇做为供试品溶液制备的提取溶剂。
[0073] 1. 2. 3提取剂用量的选择
[0074] 取坤灵丸适量，研成细粉，精密称取0. 5g，分别加入50 %甲醇10ml、15ml、20ml、 25ml，超声处理30min，取上清液过0. 45 μ m滤膜，即得。比较不同用量的提取剂对色谱峰个 数及峰面积的影响，见图4。由图可W看出，提取剂用量并不影响色谱峰的个数，但除保留时 间42min左右的大峰的外其余色谱峰均较小，故考虑选择提取剂用量为10ml。
[00巧]1. 2. 4流动相系统的选择
[0076] 进行上述试验考察时，采用甲醇-水流动相体系，色谱柱使用一段时间后色谱柱 柱压升高明显，且色谱图中个别色谱峰峰形明显变差，故考察了己腊-水流动相体系、己 腊-0. 1%甲酸水流动相体系、己腊-0. 1%磯酸流动相体系。试验过程中，采用线性梯度洗 脱分离坤灵丸中的有效成分。结果表明，当流动相为己腊-0. 1%磯酸、己腊-水时，不能将 31分钟处的色谱峰分开，故最终选择流动相体系为：己腊-0. 1 %甲酸水溶液。
[0077] 1. 2. 4流动相梯度洗脱程序的选择
[0078] 选择比较了约20种不同洗脱梯度对坤灵丸指纹图谱色谱峰的影响，最终确定梯 度洗脱条件如表1所示：
[0079] 1. 3分析方法的确定
[0080] 综上分析，最终确定坤灵丸指纹图谱分析方法如下：
[0081] 取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取0. 5g至10ml容量瓶中，加 50%甲醇适量，超声处理30min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续 滤液即得。W十八烷基键合硅胶为填充剂；W己腊-1 %甲酸为流动相，梯度洗脱，见表2-3 ; 流速1. 0ml/分钟；柱温3(TC ;检测波长；274皿。
[0082] 1. 4化学成分定性研究及参照峰的选择
[0083] 为进一步明确坤灵丸中所含成分，采用对照品保留时间对比法暂定坤灵丸中可能 含有的化学成分。通过查阅文献，坤灵丸中可能含有的成分为丹皮酪、α-香附丽、松果菊 巧、和厚朴酪、延胡索己素、厚朴酪、山奈素、梓醇、甘草酸倭、k脯氨酸、黄茂甲巧、人参皂巧 Rf、人参皂巧Re、人参皂巧Rgl、盐酸益母草碱等。通过对比样品与对照品之间的保留时间 发现，在该色谱条件下，在样品中可W定位的化学成分有丹皮酪、松果菊巧，色谱图中丹皮 酪的含量最高，且为产品中含量测定项的指标成分，故选择丹皮酪为参照峰。详见图6。
[0084] 1. 5指纹图谱试验的方法学验证
[0085] 1. 5. 1精密度实验
[0086] 取坤灵丸样品（薄膜衣批号：20121002 ;糖衣批号：20120903)0. 5g，精密称定，按 "1. 3"项下液相指纹分析方法，连续进样6针，记录各共有色谱峰保留时间和峰面积。W参 照物丹皮酪的保留时间和峰面积为参照，计算出各共有峰的相对保留时间与相对峰面积比 值。
[0087] 结果见表4、5。
[0088]
[0089]
[0090] 结果显示；8个共有峰面积比值相对标准偏差在0. 00%~2. 76%范围内，保留时 间比值相对标准偏差在0.00%~0.25%范围内。符合指纹图谱技术标准的要求，结果显示 方法的精密度较好。
[0091] 1.5. 2重复性实验
[009引取坤灵丸样品（薄膜衣批号：20121002 ;糖衣批号：20120901)0. 5g，各六份，精密 称定，按"1. 3"项下液相指纹测定方法测定，记录各共有色谱峰保留时间和峰面积。W参 照物丹皮酪的保留时间和峰面积为参照，计算出各共有峰的相对保留时间与相对峰面积比 值。结果见表6、7。
[0093]
[0094]
[0095] 结果显示；8个共有峰面积比值相对标准偏差在0. 00%~2. 39%范围内，保留时 间比值相对标准偏差在0. 00%~0. 40%范围内。符合指纹图谱技术标准的要求，该方法的 重复性较好。
[009引 1. 5. 3稳定性实验
[0097] 取坤灵丸样品（薄膜衣批号：20121002 ;糖衣批号：20120903)0. 5g，精密称定，按 "1. 3"项下液相指纹测定方法，分别于0、1、2、4、6、8、16、24小时，测定一次，W参照物丹皮 酪的保留时间和峰面积为参照，计算出各共有峰的相对保留时间与相对峰面积比值。结果 见表8、9。
[0098]
[0099] 结果显示；8个共有峰面积比值相对标准偏差在0. 00%~5. 51 %范围内，保留时 间比值相对标准偏差在0. 00%~0. 55%范围内。符合指纹图谱技术标准的要求，该方法的 重复性较好。
[0100] 2.1指纹图谱方法分析
[0101] 2. 1. 1指纹图谱共有峰的确定
[0102] 选取坤灵丸薄膜衣丸7批、糖衣丸5批，按"1. 3"项下液相指纹测定方法分别测定， 根据12批坤灵丸供试品HPLC图谱所给出的相关参数，有8个色谱峰是各批共有的，见图7、 图8。
[0103] 另将12批样品中8个共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行分析，W 6号峰 丹皮酪为参照峰，计算其它7个共有峰的相对保留时间及峰面积比值，则11批样品的共 有峰平均相对保留时间（峰号）依次为；0. 08(1)、0. 13似、0. 14(3)、0. 57(4)、0. 79巧）、 1.00化）、1.08(7)、1.13(8)，其相对偏差均在±10%^内。见表10、11。
[0104] 表10 11批样品共有峰相对保留时间
[0105]
[010 引
[0109] 2. 1. 2对照指纹图谱的拟合
[0110] W上述12批样品的指纹图谱中8个峰为共有峰，利用中药色谱指纹图谱相似度评 价系统（2. 0版），拟合确定坤灵丸对照指纹图谱，见图9。
[0111] 2. 1.3指纹图谱的标准限定
[0112] 因目前迂宁天±力生产的产品批数较少，后续还需大量样品的质量跟踪，数据积 累，初步暂定坤灵丸的指纹图谱相似度在0. 90 W上为合格。
[0113] 本发明的有益效果在于：
[0114] 本发明通过尝试多种不同洗脱条件，最终确定了坤灵丸的指纹图谱分析的色谱条 件，考察确定了 8个共有峰的对照指纹图谱，方法简便、快速、重复性好，经方法学验证满足 相关要求。
[0115] 本发明建立的一种坤灵丸的指纹图谱分析方法适用性强，能够更全面反映产品的 质量状况。
【附图说明】
[0116] 图1坤灵丸200-400nm全波长扫描色谱图
[0117] 图2 274皿波长图谱图
[0118] 图3不同提取溶剂比较色谱图
[0119] 图4不同提取溶剂比较色谱图
[0120] 图5不同流动相体系比较色谱图
[0121] 图6化学成分定性比较色谱
[0122] 图7 11批坤灵丸样品的液相重叠图
[0123] 图8 11批坤灵丸样品的共有峰匹配图
[0124] 图9由12批坤灵丸样品拟合的对照指纹图谱
【具体实施方式】：
[0125] W下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
[0126] 实施例1，坤灵丸的指纹图谱测定
[0127] 取批号为20121102的坤灵丸薄膜衣丸
[0128] 步骤1，供试品溶液的制备
[0129] 取坤灵薄膜衣丸适量，研成细粉，精密称取0. 5g至10ml容量瓶中，加50%甲醇适 量，超声处理30min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液即得。 步骤2,指纹图谱的建立
[0130] 采用高效液相色谱法，色谱条件为；色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填 料，Agilent Z0RBAX(4. 6巧50mm，5um);流动相为己腊-1%甲酸水溶液梯度洗脱；流速为 1.0ml/min ;柱温为3(TC ;进样量为10μ L，；检测波长为274nm。在此条件下分析供试品溶 液，得到待测坤灵丸的指纹图谱。
[0131] 梯度洗脱表
[0132]
[0133] 按照本发明提供的方法，W坤灵丸建立的HPLC对照指纹图谱为对照，采用中药色 谱指纹图谱相似度评价系统（2. 0版）计算，相似度为0. 989。
[0134] 实施例2,坤灵丸的指纹图谱测定
[0135] 取批号为20121002的坤灵丸薄膜衣丸
[0136] 步骤1，供试品溶液的制备
[0137] 取坤灵薄膜衣丸适量，研成细粉，精密称取0. 4g至10ml容量瓶中，加40%甲醇适 量，超声处理25min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液即得。 指纹图谱的确定，
[013引步骤2,指纹图谱的建立
[0139] 采用高效液相色谱法，色谱条件为；色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填 料，Agilent ZORBAX(4. 6巧50mm，5um);流动相为己腊-1%甲酸水溶液梯度洗脱；流速为 1.0ml/min ;柱温为35°C ;进样量为10 μ L，；检测波长为274nm。在此条件下分析供试品溶 液，得到待测坤灵丸的指纹图谱。
[0140] 梯度洗脱表
[0141]
[0142] 按照本发明提 供的方法，W坤灵丸建立的HPLC对照指纹图谱为对照，采用中药色 谱指纹图谱相似度评价系统（2. 0版）计算，相似度为0. 984。
[0143] 实施例3,坤灵丸的指纹图谱测定
[0144] 取批号为20120901的坤灵丸糖衣丸
[0145] 步骤1，供试品溶液的制备
[0146] 取坤灵丸糖衣丸适量，除去糖衣（直接敲打法），研成细粉，精密称取0. 6g至10ml 容量瓶中，加60 %甲醇适量，超声处理35min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微 孔滤膜，取续滤液即得。
[0147] 步骤2,指纹图谱的建立
[0148] 采用高效液相色谱法，色谱条件为；色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填 料，Agilent Z0RBAX(4.6巧50mm，5ym);流动相为己腊-1%甲酸水溶液梯度洗脱；流速为 1.0ml/min ;柱温为3(TC ;进样量为10 μ L ;检测波长为274nm。在此条件下分析供试品溶 液，得到待测坤灵丸的指纹图谱。
[0149] 梯度洗脱表
[0150]
[0151]
[0152] 按照本发明提供的方法，W坤灵丸建立的HPLC对照指纹图谱为对照，采用中药色 谱指纹图谱相似度评价系统（2. 0版）计算，相似度为0. 998。
[0153] 实施例4,坤灵丸的指纹图谱测定
[0154] 1)待测样品溶液的制备：
[01巧]取坤灵丸适量，研成细粉，精密称取0. 3g至5ml容量瓶中，加30%甲醇适量，超声 处理20min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 4 μ m微孔滤膜；
[0156] 2)待测样品指纹图谱的测定：
[0157] 取滤液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，色谱条件为：
[015引色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填料，Agilent Z0RBAX;流动相为己 腊-甲酸水溶液梯度洗脱，甲酸水溶液的浓度为0. 1%、流速为0. 6ml/min、柱温为25°C、进 样量为5 μ L ;检测波长为272皿；
[0159] 梯度洗脱方式为：
[0160]
[0161] 3)待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
[0162] 将待测样品的色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版"软件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度。
[0163] 实施例5,坤灵丸的指纹图谱测定
[0164] 1)待测样品溶液的制备：
[0165] 取坤灵丸适量，研成细粉，精密称取0. 7g至15ml容量瓶中，加70 %甲醇适量，超声 处理40min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 5 μ m微孔滤膜；
[0166] 2)待测样品指纹图谱的测定：
[0167] 取滤液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，色谱条件为：
[016引色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填料，Agilent Z0RBAX;流动相为己 腊-甲酸水溶液梯度洗脱，甲酸水溶液的浓度为5%、流速为1. 5ml/min、柱温为4(TC、进样 量为20 μ L ;检测波长为276nm ;
[0169] 梯度洗脱方式为：
[0170]
[0171] 3)待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
[0172] 将待测样品的色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版"软件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度。
[0173] 实施例6,坤灵丸的指纹图谱测定
[0174] 1)待测样品溶液的制备：
[0Π 5] 取坤灵丸适量，研成细粉，取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取 0. 5g至10ml容量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理30min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀， 过0. 45 μ m微孔滤膜；
[0176] 2)待测样品指纹图谱的测定：
[0177] 取滤液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，色谱条件为：
[017引色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填料，Agilent Z0RBAX 己腊-1%甲 酸为流动相、流速1. 0ml/分钟、柱温3(TC、检测波长；274nm、进样量为10 μ L ;
[0179] 梯度洗脱方式为：
[0180]
[0181]
[0182] 3)待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
[0183] 将待测样品的色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版"软件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度。
[0184] 实施例7,坤灵丸的指纹图谱测定
[0185] 1)待测样品溶液的制备：
[0186] 取坤灵丸适量，研成细粉，取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取 0. 5g至10ml容量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理30min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀， 过0. 45 μ m微孔滤膜；
[0187] 2)待测样品指纹图谱的测定：
[0188] 取滤液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，色谱条件为：
[0189] 色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填料，Agilent Z0RBAX 己腊-1%甲 酸为流动相、流速1. 0ml/分钟、柱温3(TC、检测波长；274nm、进样量为10 μ L ;
[0190] 梯度洗脱方式为：
[0191]
[0192] 3)待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
[0193] 将待测样品的色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版"软件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度。
[0194] 实施例8, 一种坤灵丸高效液相标准对照指纹图谱，其建立方法如下：
[0195] 1)供试品溶液制备：
[0196] 取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取0. 5g至10ml容量瓶中，加 50 %甲醇适量，超声处理30min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续 滤液即得；
[0197] 对照品溶液的制备方法为；取丹皮酪，加50%甲醇制成每1ml含15 μ g的溶液；
[0198] 2)获得色谱图：
[0199] 供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，其中高效液相色谱 的色谱条件如下：
[0200] 色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填料，Agilent Z0RBAX，W己腊-1 %甲 酸为流动相、流速1. 0ml/分钟、柱温3(TC、检测波长；274皿，进样量15ul ;
[0201] 梯度洗脱表：
[0202]
[0203] 3)生成对照指纹图谱
[0204] 选择合格的多批坤灵丸色谱图导入相似度评价系统，计算得相似度结果，并生成 标准对照指纹图谱；将多批坤灵丸样品的指纹图谱中8个峰为共有峰，W与丹皮酪对照品 峰保留时间相同的色谱峰为参照峰，其他7个色谱峰的相对保留时间分别为；0. 08、0. 13、 0. 14、0. 57、0. 79、1.00、1.08、1. 13,各峰的相对保留时间在 ±3%~±10%W内。
[0205] 实施例9, 一种坤灵丸高效液相标准对照指纹图谱，其建立方法如下：
[0206] 1)供试品溶液制备：
[0207] 取坤灵丸适量，研成细粉，精密称取0. 3g至5ml容量瓶中，加30%甲醇适量，超声 处理20min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液即得；
[020引丹皮酪标准对照品溶液，制备方法为；精密称取丹皮酪对照品适量，加30%甲醇 溶解制成每1ml含8 μ g的溶液，即得；
[020引。获得色谱图：
[0210] 供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，其中高效液相色谱的色谱条件如 下：
[0211] 色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填料，Agilent Z0RBAX;流动相为己 腊-甲酸水溶液梯度洗脱，甲酸水溶液的浓度为0. 1 % ;流速为0. 6ml/min ;柱温为25°C ;进 样量为5 μ L ;检测波长为272皿，
[0212] 梯度洗脱表：
[021 引
[0214] 3)生成对照指纹图谱
[0215] 选择合格的多批坤灵丸色谱图导入相似度评价系统，计算得相似度结果，并生成 标准对照指纹图谱；将多批坤灵丸样品的指纹图谱中8个峰为共有峰，W与丹皮酪对照品 峰保留时间相同的色谱峰为参照峰，其他7个色谱峰的相对保留时间分别为；0. 08、0. 13、 0. 14、0. 57、0. 79、1.00、1.08、1. 13,各峰的相对保留时间在 ±3%~±10%W内。
[0216] 实施例10, 一种坤灵丸高效液相标准对照指纹图谱，其建立方法如下：
[0217] 1)供试品溶液制备：
[021引取坤灵丸适量，研成细粉，精密称取0. 7g至15ml容量瓶中，加70 %甲醇适量，超声 处理40min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液即得；
[0219] 丹皮酪标准对照品溶液，制备方法为；精密称取丹皮酪对照品适量，加70%甲醇 溶解制成每1ml含20 μ g的溶液，即得；
[0220] 。获得色谱图：
[0221] 供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，其中高效液相色谱的色谱条件如 下：
[0222] 色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填料，Agilent Z0RBAX;流动相为己 腊-甲酸水溶液梯度洗脱，甲酸水溶液的浓度为5% ;流速为1. 5ml/min ;柱温为40°C ;进样 量为20 μ L ;检测波长为276皿，
[0223] 梯度洗脱表：
[0224]
[0225] 3)生成对照指纹图谱
[0226] 选择合格的多批坤灵丸色谱图导入相似度评价系统，计算得相似度结果，并生成 标准对照指纹图谱；将多批坤灵丸样品的指纹图谱中8个峰为共有峰，W与丹皮酪对照品 峰保留时间相同的色谱峰为参照峰，其他7个色谱峰的相对保留时间分别为；0. 08、0. 13、 0. 14、0. 57、0. 79、1.00、1.08、1. 13,各峰的相对保留时间在 ±3%~±10%W内。
[0227] 实施例11，一种坤灵丸高效液相标准对照指纹图谱，其建立方法如下：
[022引 1)供试品溶液制备：
[0229] 取坤灵丸适量，研成细粉，精密称取0. 3g至5ml容量瓶中，加30%甲醇适量，超声 处理20min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液即得；
[0230] 丹皮酪标准对照品溶液，制备方法为；精密称取丹皮酪对照品适量，加30%甲醇 溶解制成每1ml含8 μ g的溶液，即得；
[0231] 2)获得色谱图：
[0232] 供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，其中高效液相色谱的色谱条件如 下：
[0233] 色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填料，Agilent ZORBAX;流动相为己 腊-甲酸水溶液梯度洗脱，甲酸水溶液的浓度为0. 1 % ;流速为0. 6ml/min ;柱温为25°C ;进 样量为5 μ L ;检测波长为272皿，
[0234] 梯度洗脱表：
[0235]
[0236]
[0237] 3)生成对照指纹图谱
[023引选择合格的多批坤灵丸色谱图导入相似度评价系统，计算得相似度结果，并生成 标准对照指纹图谱；将多批坤灵丸样品的指纹图谱中8个峰为共有峰，W与丹皮酪对照品 峰保留时间相同的色谱峰为参照峰，其他7个色谱峰的相对保留时间分别为；0. 08、0. 13、 0. 14、0. 57、0. 79、1. 00、1. 08、1. 13,各峰的相对保留时间在 ±3%~±10% W 内。
[0239] 实施例12, 一种坤灵丸高效液相标准对照指纹图谱，其建立方法如下：
[0240] 1)供试品溶液制备：
[0241] 取坤灵丸适量，研成细粉，精密称取0. 7g至15ml容量瓶中，加70 %甲醇适量，超声 处理40min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液即得；
[0242] 丹皮酪标准对照品溶液，制备方法为；精密称取丹皮酪对照品适量，加70 %甲醇 溶解制成每1ml含20 μ g的溶液，即得；
[0243] 2)获得色谱图：
[0244] 供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，其中高效液相色谱的色谱条件如 下：
[0245] 色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填料，Agilent Z0RBAX;流动相为己 腊-甲酸水溶液梯度洗脱，甲酸水溶液的浓度为5% ;流速为1. 5ml/min ;柱温为4(TC ;进样 量为20 μ L ;检测波长为276皿，
[0246] 梯度洗脱表：
[0247]
[024引 3)生成对照指纹图谱
[0249] 选择合格的多批坤灵丸色谱图导入相似度评价系统，计算得相似度结果，并生成 标准对照指纹图谱；将多批坤灵丸样品的指纹图谱中8个峰为共有峰，W与丹皮酪对照品 峰保留时间相同的色谱峰为参照峰，其他7个色谱峰的相对保留时间分别为；0. 08、0. 13、 0. 14、0. 57、0. 79、1.00、1.08、1. 13,各峰的相对保留时间在 ±3%~±10%W内。
【主权项】
1. 一种坤灵丸高效液相标准对照指纹图谱，其建立方法如下： 1) 供试品洛液制备： 取坤灵丸，加入甲醇或乙醇水溶液，超声溶解，再加入溶剂调整溶液浓度，微孔滤膜滤 过，取滤液，既得； 2) 获得色谱图： 供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图； 3) 生成对照指纹图谱 选择合格的多批坤灵丸色谱图导入相似度评价系统，计算得相似度结果，并生成标准 对照指纹图谱； 其中高效液相色谱的色谱条件如下： 色谱柱固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为乙腈-甲酸水溶液梯度洗 脱，其中甲酸水中甲酸的浓度为〇. 1%~5%;流速为0. 6~I. 5ml/min ;柱温为25~40°C; 进样量为5~20 μ L ;检测波长为272~276nm， 梯度洗脱表： 时间/分:钟 0, 1%~5%甲酸 乙廳 0 90 ~99 m~1 6-10 90~卵 10-1 25~40 60-80 猶~涕 .4? ~55 5--1? 95-85 50~紐 5~15 95-85 恥~側 1!)-1 根据需要可以加入有效成分的标准对照品以作为参照物峰。2. 根据权利要求1所述的标准对照指纹图谱，其建立方法如下： 1) 供试品溶液的制备，方法如下： 取坤灵丸适量，研成细粉，精密称取〇. 3~0. 7g至5~15ml容量瓶中，加30%~70% 甲醇适量，超声处理20~40min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续 滤液即得， 2) 获得色谱图： 供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，同时以丹皮酚作为参照物； 丹皮酚标准对照品溶液，制备方法为：精密称取丹皮酚对照品适量，加30 %~70 %甲 醇溶解制成每1ml含8~20 μ g的溶液，即得； 3) 生成对照指纹图谱，方法如下： 将多批坤灵丸样品的指纹图谱中8个峰为共有峰，以与丹皮酚对照品峰保留时间相同 的色谱峰为参照峰，其他7个色谱峰的相对保留时间分别为：0. 08、0. 13、0. 14、0. 57、0. 79、 I. 00、1. 08、1. 13,各峰的相对保留时间在±3%~±10%以内。3. 根据权利要求2所述的标准对照指纹图谱，其中，供试品溶液的制备方法如下： 取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取〇. 5g至IOml容量瓶中，加50 %甲 醇适量，超声处理30min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液即 得；对照品溶液的制备方法为：取丹皮酚，加50%甲醇制成每1ml含15 μ g的溶液。4. 根据权利要求1所述的标准对照指纹图谱，其特征在于，色谱条件为：以乙腈-1 %甲 酸为流动相、流速1.0 ml/分钟、柱温30°C、检测波长：274nm。5. 根据权利要求1所述的标准对照指纹图谱，其特征在于，其中梯度洗脱方式为： 时间/分钟 m平酸 乙黯 〇 m 5 8 95 5 :巧 7Q 30 50 IO 90 10： 90 6：§ 9§: S6. -种坤灵丸的高效液相色谱指纹图谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 待测样品洛液的制备： 取坤灵丸样品，加入甲醇或乙醇水溶液，超声溶解，再加入溶剂调整溶液浓度，微孔滤 膜滤过； 2) 待测样品指纹图谱的测定： 取滤液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，色谱条件为： 色谱柱固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为乙腈-甲酸水溶液梯度洗 脱，甲酸水溶液中甲酸的浓度为〇. 1%~5%、流速为0. 6~I. 5ml/min、柱温为25~40°C、 进样量为5~20 μ L ;检测波长为272-276nm ; 梯度洗脱方式为： 时间/分钟 α ?~St甲酸 乙讀 0 90-99 10~1 6 ~W) 90^99 10^1 23~補： 獅~_ 揚~2δ *15-00 δ-15 95-8? 5U '· β0 δ-'-15 95-85 60 ~?I) 90-99 10-? 3) 待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算： 将待测样品的色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版"软 件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度。7. 根据权利要求6的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤1)待测样品溶液的制备方 式为： 取坤灵丸适量，研成细粉，精密称取〇. 3~0. 7g至5~15ml容量瓶中，加30%~70% 甲醇适量，超声处理20~40min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 4-0. 5 μ m微孔滤膜。8. 根据权利要求6的指纹图谱检测方法，其特征在于，其中步骤1)待测样品溶液的制 备方式为：取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取〇. 5g至IOml容量瓶中，加 50%甲醇适量，超声处理30min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜。9. 根据权利要求6的指纹图谱检测方法，其特征在于，其中步骤2)的色谱条件为：以 乙腈-1 %甲酸水溶液为流动相、流速1.0 ml/分钟、柱温30°C、检测波长：274nm、进样量为 10 μ L010. 根据权利要求6的指纹图谱检测方法，其特征在于，其中梯度洗脱方式为： 时间/分钟 找甲酸 乙鑛 0 9S 5 8 95： 5 36 TO 30 〇{) 10 SO 5S IO 90 65 95 S
【专利摘要】本发明提供了一种坤灵丸的高效液相指纹图谱检测方法，所述方法包括：坤灵丸标准指纹图谱的建立、待测坤灵丸指纹图谱的测定和相似性比较判定等步骤。本发明通过尝试多种不同洗脱条件，最终确定了坤灵丸的指纹图谱分析的色谱条件，考察确定了8个共有峰的对照指纹图谱，具有方法简便、速度快、重现性好等特点，所建立的标准指纹图谱经方法学验证满足相关要求，适用性强，能够更全面的反映产品质量状况，为质量控制及制定标准提供了重要依据。
【IPC分类】G01N30/02, G01N30/06
【公开号】CN105486762
【申请号】CN201410482791
【发明人】阚红玉, 刘海涛, 耿晓梅, 孙玉侠, 曹凤兰, 徐立元, 杨建会, 李建, 杨雪梅, 张淑玉
【申请人】天士力制药集团股份有限公司, 天津天士力（辽宁）制药有限责任公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年9月19日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种坤灵丸的高效液相指纹图谱检测方法，属于药物分析技术领域。
【背景技术】
[0002] 坤灵丸是一种中药复方制剂，其功能主治为调经养血，逐癒生新。用于月经不调， 或多或少，行经腹痛，子宫寒冷，久不受孕，习惯性流产，赤白带下，崩漏不止，病久气虚，肾 亏腰痛。
[0003] 坤灵丸的处方如下：
[0004] 【处方】
[0005] ( -）香附（制）37g甘草7g白薇14g益母草14g黄茂14g鸡冠花14g麦冬 14g北五味子14g地黄14g红花14g木通lOg白术（炒）14g赤石脂14g巧冬14g厚朴 lOg肉巧蓉（制）14g白巧（酒炒）14g
[0006] (二）香附（制）37g荆芥lOg牡丹皮14g阿胶14g当归14g蔓本lOg红参14g 鹿角胶14g川贝母14g没药（炒）14g砂仁14g延胡索14g小茵香（盐制）14g龟甲胶 14g川写14g
[0007] 【制法】W上处方（一）十走味，加水煎煮二次，第一次3小时，第二次2小时，合并 煎液，滤过，滤液放置24小时，取上清液加入米醋280g，浓缩成稠膏。W上处方（二）十五 味，粉碎成中粉，加入上述稠膏中，混匀，干燥，粉碎成细粉，过筛，混匀，用黄酒泛丸，制成 1800丸，包糖衣或薄膜衣，打光，干燥，即得。
[0008] 由于中药化学成分复杂，作用机制不明确，致使现有中药制药技术难W确保中药 产品质量稳定性，中药指纹图谱建立的可W全面反映中药内在化学成分的种类与数量，进 而反映中药的质量。现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确，采用中药指纹图谱的方式， 将有效地表征中药质量。指纹图谱已为国际社会所认可，有利于中药及产品进入国际市场。
[0009] 坤灵丸现行标准收载于中华人民共和国卫生部药品标准《中药成方制剂》第十册， 标准中未涉及任何针对药味的定性定量控制项目，目前，没有对坤灵丸进行指纹图谱研究 的报道，而指纹图谱能充分表征中药制剂的整体性和复杂性，因此发明人对坤灵丸的有效 成分进行了研究。发现其中含有多种水溶性与醇溶性成分，本发明人有针对性的对送些成 分进行了研究，建立了一种坤灵丸的标准指纹图谱，利用该图谱对生产中的坤灵丸进行质 量监督，W确保产品质量。
【发明内容】
：
[0010] 本发明提供一种坤灵丸高效液相标准对照指纹图谱，其建立方法如下：
[0011] 1)供试品溶液制备：
[0012] 取坤灵丸，加入甲醇或己醇水溶液，超声溶解，再加入溶剂调整溶液浓度，微孔滤 膜滤过，取滤液，既得；
[001引。获得色谱图：
[0014] 供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图；
[0015] 3)生成对照指纹图谱
[0016] 选择合格的多批坤灵丸色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价 系统A版"软件，计算得相似度结果，并生成标准对照指纹图谱；
[0017] 其中高效液相色谱的色谱条件如下：
[0018] 色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填料，（4. 6巧50mm，5um);流动相为己 腊-0. 1 %~5%甲酸水溶液梯度洗脱，见表1 ;流速为0. 6~1. 5ml/min ;柱温为25~4(TC; 进样量为5~20 μ L ;检测波长为274皿。
[0019] 梯度洗脱表：
[0020]
[0024] 根据需要可W加入有效成分的标准对照品W作为参照物峰。
[00巧]其中，优选的标准对照指纹图谱的建立方法如下：
[002引1)供试品溶液的制备，方法如下：
[0027] 取坤灵丸适量（糖衣丸除去糖衣），研成细粉，精密称取0. 3~0. 7g至5~15ml 容量瓶中，加30%~70%甲醇适量，超声处理20~40min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀， 过0.45 μ m微孔滤膜，取续滤液即得。优选，取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精 密称取0. 5g至10ml容量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理30min，冷却至室温，定容至刻 度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液即得。
[002引 。W丹皮酪作为参照物制备标准对照品溶液，方法如下：
[0029] 精密称取丹皮酪对照品适量，加30%~70%甲醇溶解制成每1ml含8~20 μ g的 溶液，即得；优选加50%甲醇制成每1ml含15 μ g的溶液。
[0030] 扣标准对照指纹图谱的确定，方法如下：
[0031] 将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，
[0032] 将多批坤灵丸样品的指纹图谱中8个峰为共有峰，利用中药色谱指纹图谱相似度 评价系统（2. 0版），拟合确定坤灵丸对照指纹图谱，其中，与丹皮酪对照品峰保留时间相同 的色谱峰为6号峰，其他7个色谱峰的相对保留时间分别为；0. 08 (1)、0. 13 (2)、0. 14(3)、 0. 57 (4)、0. 79 巧）、1. 00 化）、1. 08 (7)、1. 13 (8)，各峰的相对保留时间在 ±3% ~±10%W 内
[0033] 本发明还提供一种坤灵丸的高效液相色谱指纹图谱检测方法，其特征在于，包括 如下步骤
[0034] 1)待测样品溶液的制备：
[0035] 取坤灵丸样品，加入甲醇或己醇水溶液，超声溶解，再加入溶剂调整溶液浓度，微 孔滤膜滤过；
[0036] 2)待测样品溶液指纹图谱的测定：
[0037] 取滤液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图：
[0038] 其中的色谱条件如下：
[0039] 色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填料（4. 6巧50mm，5um);流动相为己 腊-0. 1%~5%甲酸水溶液梯度洗脱，见表1 ;流速为0. 6~1. 5ml/min ;柱温为25~4(TC; 进样量为5-20 μ L ;检测波长为272-276皿。
[0040] 优选W己腊-1 %甲酸为流动相；流速1. 0ml/分钟；柱温30。进样量为10 μ L ;检 测波长；274皿。
[0041] 表1梯度洗脱表
[0042]
[0043] 洗脱表优选：
[0044]
[0045] 3)待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
[0046] 将待测样品的色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版"软件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度；
[0047] 其中，优选的本发明的待测样品溶液的制备如下：
[0048] 取坤灵丸适量（糖衣丸除去糖衣），研成细粉，精密称取0. 3~0. 7g至5~15ml 容量瓶中，加30%~70%甲醇适量，超声处理20~40min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀， 过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图；
[0049] 优选，；取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取0. 5g至10ml容量瓶 中，加50 %甲醇适量，超声处理30min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤 膜，取续滤液既得。
[0050] 其中，待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
[0051] 将待测样品的色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版"软件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度；相似度为0. 90 W上为合格， 相似度为0. 95 W上为相符，相似度为0. 98 W上为相同。
[0052] 本发明通过W上指纹图谱的建立，进一步的确立了坤灵丸的分析方法，采用该方 法可W隹确辨别坤灵丸，根据和标准指纹图谱的比较，得出鉴别结论，越和标准指纹图谱接 近，产品质量越好，相似度可W使用计算机方法确认，如相似度为0. 90 W上为合格，相似度 为0. 95 W上为相符，相似度为0. 98 W上为相同。
[0053] 上述方法特别是坤灵丸的标准对照指纹图谱的制备方法是经过筛选获得的，W下 为筛选过程：
[0054] 1. 1仪器与试药
[00巧]仪器；Waters2695-2996高效液相色谱仪；Empower II色谱工作站；Milli-Q超纯 水器；万分之一天平（赛多利斯）；十万分之一天平（赛多利斯）。
[0056] 色谱柱；Agilent Z0RBAX(4. 6巧50mm，5 μ m);
[0057] 试剂；甲醇（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）；己腊（色谱纯，天津市康科德 科技有限公司）；甲酸（分析纯，天津市化学试剂一厂）；水为超纯水。
[0058] 对照品；中国药品生物制品检定所；丹皮酪（批号：110708-200506,含量测定用，
[0059] 为中国药品生物制品检定所提供；
[0060] 样品；坤灵丸（天津天±力（迂宁）制药有限责任公司，共11化具体批号见表2， 均经质检中必检验合格。
[0061] 表2坤灵丸样品信息表
[0062]
[0063]
[0064] 1. 2分析条件的选择
[0065] 1. 2. 1检测波长的选择
[0066] 参照产品中丹皮酪含量测定色谱条件，选用色谱柱；Agilent Z0RBAX SB-Cis (4. 6 X 250mm，5 μ m)，W表3中梯度洗脱条件洗脱，进行检测波长的选择考察。
[0067] 表3梯度洗脱表
[0068]
[0069] 文献报道的检测波长常常是为测定某一特定成分的含量，不一定完全适合指纹图 谱的需要，为了获得多层次的信息，需要选择数个不同的检测波长，同时坤灵丸为大复方制 剂，含有31味中药材，其所含化学成分很多。因此，在试验中应使用DAD检测器全波长检测 获得3D指纹图谱，见图1。结果表明274nm处可W得到较多的化学信息，故选择274nm作为 检测波长，见 图2。
[0070] 1.2. 2提取溶剂的选择
[0071] 取坤灵丸适量，研成细粉，精密称取0. 5g，分别加水、30%甲醇溶液、50%甲醇溶 液、70%甲醇溶液、甲醇25血，超声处理30min，取上清液过0. 45 μ m滤膜，即得。
[0072] 由图3显示，50%甲醇与70%甲醇溶液提取样品得到谱峰信息较全且相似，从经 济及环境污染的角度考虑，最终选取50%甲醇做为供试品溶液制备的提取溶剂。
[0073] 1. 2. 3提取剂用量的选择
[0074] 取坤灵丸适量，研成细粉，精密称取0. 5g，分别加入50 %甲醇10ml、15ml、20ml、 25ml，超声处理30min，取上清液过0. 45 μ m滤膜，即得。比较不同用量的提取剂对色谱峰个 数及峰面积的影响，见图4。由图可W看出，提取剂用量并不影响色谱峰的个数，但除保留时 间42min左右的大峰的外其余色谱峰均较小，故考虑选择提取剂用量为10ml。
[00巧]1. 2. 4流动相系统的选择
[0076] 进行上述试验考察时，采用甲醇-水流动相体系，色谱柱使用一段时间后色谱柱 柱压升高明显，且色谱图中个别色谱峰峰形明显变差，故考察了己腊-水流动相体系、己 腊-0. 1%甲酸水流动相体系、己腊-0. 1%磯酸流动相体系。试验过程中，采用线性梯度洗 脱分离坤灵丸中的有效成分。结果表明，当流动相为己腊-0. 1%磯酸、己腊-水时，不能将 31分钟处的色谱峰分开，故最终选择流动相体系为：己腊-0. 1 %甲酸水溶液。
[0077] 1. 2. 4流动相梯度洗脱程序的选择
[0078] 选择比较了约20种不同洗脱梯度对坤灵丸指纹图谱色谱峰的影响，最终确定梯 度洗脱条件如表1所示：
[0079] 1. 3分析方法的确定
[0080] 综上分析，最终确定坤灵丸指纹图谱分析方法如下：
[0081] 取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取0. 5g至10ml容量瓶中，加 50%甲醇适量，超声处理30min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续 滤液即得。W十八烷基键合硅胶为填充剂；W己腊-1 %甲酸为流动相，梯度洗脱，见表2-3 ; 流速1. 0ml/分钟；柱温3(TC ;检测波长；274皿。
[0082] 1. 4化学成分定性研究及参照峰的选择
[0083] 为进一步明确坤灵丸中所含成分，采用对照品保留时间对比法暂定坤灵丸中可能 含有的化学成分。通过查阅文献，坤灵丸中可能含有的成分为丹皮酪、α-香附丽、松果菊 巧、和厚朴酪、延胡索己素、厚朴酪、山奈素、梓醇、甘草酸倭、k脯氨酸、黄茂甲巧、人参皂巧 Rf、人参皂巧Re、人参皂巧Rgl、盐酸益母草碱等。通过对比样品与对照品之间的保留时间 发现，在该色谱条件下，在样品中可W定位的化学成分有丹皮酪、松果菊巧，色谱图中丹皮 酪的含量最高，且为产品中含量测定项的指标成分，故选择丹皮酪为参照峰。详见图6。
[0084] 1. 5指纹图谱试验的方法学验证
[0085] 1. 5. 1精密度实验
[0086] 取坤灵丸样品（薄膜衣批号：20121002 ;糖衣批号：20120903)0. 5g，精密称定，按 "1. 3"项下液相指纹分析方法，连续进样6针，记录各共有色谱峰保留时间和峰面积。W参 照物丹皮酪的保留时间和峰面积为参照，计算出各共有峰的相对保留时间与相对峰面积比 值。
[0087] 结果见表4、5。
[0088]
[0089]
[0090] 结果显示；8个共有峰面积比值相对标准偏差在0. 00%~2. 76%范围内，保留时 间比值相对标准偏差在0.00%~0.25%范围内。符合指纹图谱技术标准的要求，结果显示 方法的精密度较好。
[0091] 1.5. 2重复性实验
[009引取坤灵丸样品（薄膜衣批号：20121002 ;糖衣批号：20120901)0. 5g，各六份，精密 称定，按"1. 3"项下液相指纹测定方法测定，记录各共有色谱峰保留时间和峰面积。W参 照物丹皮酪的保留时间和峰面积为参照，计算出各共有峰的相对保留时间与相对峰面积比 值。结果见表6、7。
[0093]
[0094]
[0095] 结果显示；8个共有峰面积比值相对标准偏差在0. 00%~2. 39%范围内，保留时 间比值相对标准偏差在0. 00%~0. 40%范围内。符合指纹图谱技术标准的要求，该方法的 重复性较好。
[009引 1. 5. 3稳定性实验
[0097] 取坤灵丸样品（薄膜衣批号：20121002 ;糖衣批号：20120903)0. 5g，精密称定，按 "1. 3"项下液相指纹测定方法，分别于0、1、2、4、6、8、16、24小时，测定一次，W参照物丹皮 酪的保留时间和峰面积为参照，计算出各共有峰的相对保留时间与相对峰面积比值。结果 见表8、9。
[0098]
[0099] 结果显示；8个共有峰面积比值相对标准偏差在0. 00%~5. 51 %范围内，保留时 间比值相对标准偏差在0. 00%~0. 55%范围内。符合指纹图谱技术标准的要求，该方法的 重复性较好。
[0100] 2.1指纹图谱方法分析
[0101] 2. 1. 1指纹图谱共有峰的确定
[0102] 选取坤灵丸薄膜衣丸7批、糖衣丸5批，按"1. 3"项下液相指纹测定方法分别测定， 根据12批坤灵丸供试品HPLC图谱所给出的相关参数，有8个色谱峰是各批共有的，见图7、 图8。
[0103] 另将12批样品中8个共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行分析，W 6号峰 丹皮酪为参照峰，计算其它7个共有峰的相对保留时间及峰面积比值，则11批样品的共 有峰平均相对保留时间（峰号）依次为；0. 08(1)、0. 13似、0. 14(3)、0. 57(4)、0. 79巧）、 1.00化）、1.08(7)、1.13(8)，其相对偏差均在±10%^内。见表10、11。
[0104] 表10 11批样品共有峰相对保留时间
[0105]
[010 引
[0109] 2. 1. 2对照指纹图谱的拟合
[0110] W上述12批样品的指纹图谱中8个峰为共有峰，利用中药色谱指纹图谱相似度评 价系统（2. 0版），拟合确定坤灵丸对照指纹图谱，见图9。
[0111] 2. 1.3指纹图谱的标准限定
[0112] 因目前迂宁天±力生产的产品批数较少，后续还需大量样品的质量跟踪，数据积 累，初步暂定坤灵丸的指纹图谱相似度在0. 90 W上为合格。
[0113] 本发明的有益效果在于：
[0114] 本发明通过尝试多种不同洗脱条件，最终确定了坤灵丸的指纹图谱分析的色谱条 件，考察确定了 8个共有峰的对照指纹图谱，方法简便、快速、重复性好，经方法学验证满足 相关要求。
[0115] 本发明建立的一种坤灵丸的指纹图谱分析方法适用性强，能够更全面反映产品的 质量状况。
【附图说明】
[0116] 图1坤灵丸200-400nm全波长扫描色谱图
[0117] 图2 274皿波长图谱图
[0118] 图3不同提取溶剂比较色谱图
[0119] 图4不同提取溶剂比较色谱图
[0120] 图5不同流动相体系比较色谱图
[0121] 图6化学成分定性比较色谱
[0122] 图7 11批坤灵丸样品的液相重叠图
[0123] 图8 11批坤灵丸样品的共有峰匹配图
[0124] 图9由12批坤灵丸样品拟合的对照指纹图谱
【具体实施方式】：
[0125] W下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
[0126] 实施例1，坤灵丸的指纹图谱测定
[0127] 取批号为20121102的坤灵丸薄膜衣丸
[0128] 步骤1，供试品溶液的制备
[0129] 取坤灵薄膜衣丸适量，研成细粉，精密称取0. 5g至10ml容量瓶中，加50%甲醇适 量，超声处理30min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液即得。 步骤2,指纹图谱的建立
[0130] 采用高效液相色谱法，色谱条件为；色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填 料，Agilent Z0RBAX(4. 6巧50mm，5um);流动相为己腊-1%甲酸水溶液梯度洗脱；流速为 1.0ml/min ;柱温为3(TC ;进样量为10μ L，；检测波长为274nm。在此条件下分析供试品溶 液，得到待测坤灵丸的指纹图谱。
[0131] 梯度洗脱表
[0132]
[0133] 按照本发明提供的方法，W坤灵丸建立的HPLC对照指纹图谱为对照，采用中药色 谱指纹图谱相似度评价系统（2. 0版）计算，相似度为0. 989。
[0134] 实施例2,坤灵丸的指纹图谱测定
[0135] 取批号为20121002的坤灵丸薄膜衣丸
[0136] 步骤1，供试品溶液的制备
[0137] 取坤灵薄膜衣丸适量，研成细粉，精密称取0. 4g至10ml容量瓶中，加40%甲醇适 量，超声处理25min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液即得。 指纹图谱的确定，
[013引步骤2,指纹图谱的建立
[0139] 采用高效液相色谱法，色谱条件为；色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填 料，Agilent ZORBAX(4. 6巧50mm，5um);流动相为己腊-1%甲酸水溶液梯度洗脱；流速为 1.0ml/min ;柱温为35°C ;进样量为10 μ L，；检测波长为274nm。在此条件下分析供试品溶 液，得到待测坤灵丸的指纹图谱。
[0140] 梯度洗脱表
[0141]
[0142] 按照本发明提 供的方法，W坤灵丸建立的HPLC对照指纹图谱为对照，采用中药色 谱指纹图谱相似度评价系统（2. 0版）计算，相似度为0. 984。
[0143] 实施例3,坤灵丸的指纹图谱测定
[0144] 取批号为20120901的坤灵丸糖衣丸
[0145] 步骤1，供试品溶液的制备
[0146] 取坤灵丸糖衣丸适量，除去糖衣（直接敲打法），研成细粉，精密称取0. 6g至10ml 容量瓶中，加60 %甲醇适量，超声处理35min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微 孔滤膜，取续滤液即得。
[0147] 步骤2,指纹图谱的建立
[0148] 采用高效液相色谱法，色谱条件为；色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填 料，Agilent Z0RBAX(4.6巧50mm，5ym);流动相为己腊-1%甲酸水溶液梯度洗脱；流速为 1.0ml/min ;柱温为3(TC ;进样量为10 μ L ;检测波长为274nm。在此条件下分析供试品溶 液，得到待测坤灵丸的指纹图谱。
[0149] 梯度洗脱表
[0150]
[0151]
[0152] 按照本发明提供的方法，W坤灵丸建立的HPLC对照指纹图谱为对照，采用中药色 谱指纹图谱相似度评价系统（2. 0版）计算，相似度为0. 998。
[0153] 实施例4,坤灵丸的指纹图谱测定
[0154] 1)待测样品溶液的制备：
[01巧]取坤灵丸适量，研成细粉，精密称取0. 3g至5ml容量瓶中，加30%甲醇适量，超声 处理20min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 4 μ m微孔滤膜；
[0156] 2)待测样品指纹图谱的测定：
[0157] 取滤液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，色谱条件为：
[015引色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填料，Agilent Z0RBAX;流动相为己 腊-甲酸水溶液梯度洗脱，甲酸水溶液的浓度为0. 1%、流速为0. 6ml/min、柱温为25°C、进 样量为5 μ L ;检测波长为272皿；
[0159] 梯度洗脱方式为：
[0160]
[0161] 3)待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
[0162] 将待测样品的色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版"软件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度。
[0163] 实施例5,坤灵丸的指纹图谱测定
[0164] 1)待测样品溶液的制备：
[0165] 取坤灵丸适量，研成细粉，精密称取0. 7g至15ml容量瓶中，加70 %甲醇适量，超声 处理40min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 5 μ m微孔滤膜；
[0166] 2)待测样品指纹图谱的测定：
[0167] 取滤液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，色谱条件为：
[016引色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填料，Agilent Z0RBAX;流动相为己 腊-甲酸水溶液梯度洗脱，甲酸水溶液的浓度为5%、流速为1. 5ml/min、柱温为4(TC、进样 量为20 μ L ;检测波长为276nm ;
[0169] 梯度洗脱方式为：
[0170]
[0171] 3)待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
[0172] 将待测样品的色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版"软件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度。
[0173] 实施例6,坤灵丸的指纹图谱测定
[0174] 1)待测样品溶液的制备：
[0Π 5] 取坤灵丸适量，研成细粉，取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取 0. 5g至10ml容量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理30min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀， 过0. 45 μ m微孔滤膜；
[0176] 2)待测样品指纹图谱的测定：
[0177] 取滤液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，色谱条件为：
[017引色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填料，Agilent Z0RBAX 己腊-1%甲 酸为流动相、流速1. 0ml/分钟、柱温3(TC、检测波长；274nm、进样量为10 μ L ;
[0179] 梯度洗脱方式为：
[0180]
[0181]
[0182] 3)待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
[0183] 将待测样品的色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版"软件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度。
[0184] 实施例7,坤灵丸的指纹图谱测定
[0185] 1)待测样品溶液的制备：
[0186] 取坤灵丸适量，研成细粉，取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取 0. 5g至10ml容量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理30min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀， 过0. 45 μ m微孔滤膜；
[0187] 2)待测样品指纹图谱的测定：
[0188] 取滤液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，色谱条件为：
[0189] 色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填料，Agilent Z0RBAX 己腊-1%甲 酸为流动相、流速1. 0ml/分钟、柱温3(TC、检测波长；274nm、进样量为10 μ L ;
[0190] 梯度洗脱方式为：
[0191]
[0192] 3)待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
[0193] 将待测样品的色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版"软件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度。
[0194] 实施例8, 一种坤灵丸高效液相标准对照指纹图谱，其建立方法如下：
[0195] 1)供试品溶液制备：
[0196] 取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取0. 5g至10ml容量瓶中，加 50 %甲醇适量，超声处理30min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续 滤液即得；
[0197] 对照品溶液的制备方法为；取丹皮酪，加50%甲醇制成每1ml含15 μ g的溶液；
[0198] 2)获得色谱图：
[0199] 供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，其中高效液相色谱 的色谱条件如下：
[0200] 色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填料，Agilent Z0RBAX，W己腊-1 %甲 酸为流动相、流速1. 0ml/分钟、柱温3(TC、检测波长；274皿，进样量15ul ;
[0201] 梯度洗脱表：
[0202]
[0203] 3)生成对照指纹图谱
[0204] 选择合格的多批坤灵丸色谱图导入相似度评价系统，计算得相似度结果，并生成 标准对照指纹图谱；将多批坤灵丸样品的指纹图谱中8个峰为共有峰，W与丹皮酪对照品 峰保留时间相同的色谱峰为参照峰，其他7个色谱峰的相对保留时间分别为；0. 08、0. 13、 0. 14、0. 57、0. 79、1.00、1.08、1. 13,各峰的相对保留时间在 ±3%~±10%W内。
[0205] 实施例9, 一种坤灵丸高效液相标准对照指纹图谱，其建立方法如下：
[0206] 1)供试品溶液制备：
[0207] 取坤灵丸适量，研成细粉，精密称取0. 3g至5ml容量瓶中，加30%甲醇适量，超声 处理20min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液即得；
[020引丹皮酪标准对照品溶液，制备方法为；精密称取丹皮酪对照品适量，加30%甲醇 溶解制成每1ml含8 μ g的溶液，即得；
[020引。获得色谱图：
[0210] 供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，其中高效液相色谱的色谱条件如 下：
[0211] 色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填料，Agilent Z0RBAX;流动相为己 腊-甲酸水溶液梯度洗脱，甲酸水溶液的浓度为0. 1 % ;流速为0. 6ml/min ;柱温为25°C ;进 样量为5 μ L ;检测波长为272皿，
[0212] 梯度洗脱表：
[021 引
[0214] 3)生成对照指纹图谱
[0215] 选择合格的多批坤灵丸色谱图导入相似度评价系统，计算得相似度结果，并生成 标准对照指纹图谱；将多批坤灵丸样品的指纹图谱中8个峰为共有峰，W与丹皮酪对照品 峰保留时间相同的色谱峰为参照峰，其他7个色谱峰的相对保留时间分别为；0. 08、0. 13、 0. 14、0. 57、0. 79、1.00、1.08、1. 13,各峰的相对保留时间在 ±3%~±10%W内。
[0216] 实施例10, 一种坤灵丸高效液相标准对照指纹图谱，其建立方法如下：
[0217] 1)供试品溶液制备：
[021引取坤灵丸适量，研成细粉，精密称取0. 7g至15ml容量瓶中，加70 %甲醇适量，超声 处理40min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液即得；
[0219] 丹皮酪标准对照品溶液，制备方法为；精密称取丹皮酪对照品适量，加70%甲醇 溶解制成每1ml含20 μ g的溶液，即得；
[0220] 。获得色谱图：
[0221] 供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，其中高效液相色谱的色谱条件如 下：
[0222] 色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填料，Agilent Z0RBAX;流动相为己 腊-甲酸水溶液梯度洗脱，甲酸水溶液的浓度为5% ;流速为1. 5ml/min ;柱温为40°C ;进样 量为20 μ L ;检测波长为276皿，
[0223] 梯度洗脱表：
[0224]
[0225] 3)生成对照指纹图谱
[0226] 选择合格的多批坤灵丸色谱图导入相似度评价系统，计算得相似度结果，并生成 标准对照指纹图谱；将多批坤灵丸样品的指纹图谱中8个峰为共有峰，W与丹皮酪对照品 峰保留时间相同的色谱峰为参照峰，其他7个色谱峰的相对保留时间分别为；0. 08、0. 13、 0. 14、0. 57、0. 79、1.00、1.08、1. 13,各峰的相对保留时间在 ±3%~±10%W内。
[0227] 实施例11，一种坤灵丸高效液相标准对照指纹图谱，其建立方法如下：
[022引 1)供试品溶液制备：
[0229] 取坤灵丸适量，研成细粉，精密称取0. 3g至5ml容量瓶中，加30%甲醇适量，超声 处理20min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液即得；
[0230] 丹皮酪标准对照品溶液，制备方法为；精密称取丹皮酪对照品适量，加30%甲醇 溶解制成每1ml含8 μ g的溶液，即得；
[0231] 2)获得色谱图：
[0232] 供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，其中高效液相色谱的色谱条件如 下：
[0233] 色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填料，Agilent ZORBAX;流动相为己 腊-甲酸水溶液梯度洗脱，甲酸水溶液的浓度为0. 1 % ;流速为0. 6ml/min ;柱温为25°C ;进 样量为5 μ L ;检测波长为272皿，
[0234] 梯度洗脱表：
[0235]
[0236]
[0237] 3)生成对照指纹图谱
[023引选择合格的多批坤灵丸色谱图导入相似度评价系统，计算得相似度结果，并生成 标准对照指纹图谱；将多批坤灵丸样品的指纹图谱中8个峰为共有峰，W与丹皮酪对照品 峰保留时间相同的色谱峰为参照峰，其他7个色谱峰的相对保留时间分别为；0. 08、0. 13、 0. 14、0. 57、0. 79、1. 00、1. 08、1. 13,各峰的相对保留时间在 ±3%~±10% W 内。
[0239] 实施例12, 一种坤灵丸高效液相标准对照指纹图谱，其建立方法如下：
[0240] 1)供试品溶液制备：
[0241] 取坤灵丸适量，研成细粉，精密称取0. 7g至15ml容量瓶中，加70 %甲醇适量，超声 处理40min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液即得；
[0242] 丹皮酪标准对照品溶液，制备方法为；精密称取丹皮酪对照品适量，加70 %甲醇 溶解制成每1ml含20 μ g的溶液，即得；
[0243] 2)获得色谱图：
[0244] 供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，其中高效液相色谱的色谱条件如 下：
[0245] 色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填料，Agilent Z0RBAX;流动相为己 腊-甲酸水溶液梯度洗脱，甲酸水溶液的浓度为5% ;流速为1. 5ml/min ;柱温为4(TC ;进样 量为20 μ L ;检测波长为276皿，
[0246] 梯度洗脱表：
[0247]
[024引 3)生成对照指纹图谱
[0249] 选择合格的多批坤灵丸色谱图导入相似度评价系统，计算得相似度结果，并生成 标准对照指纹图谱；将多批坤灵丸样品的指纹图谱中8个峰为共有峰，W与丹皮酪对照品 峰保留时间相同的色谱峰为参照峰，其他7个色谱峰的相对保留时间分别为；0. 08、0. 13、 0. 14、0. 57、0. 79、1.00、1.08、1. 13,各峰的相对保留时间在 ±3%~±10%W内。
【主权项】
1. 一种坤灵丸高效液相标准对照指纹图谱，其建立方法如下： 1) 供试品洛液制备： 取坤灵丸，加入甲醇或乙醇水溶液，超声溶解，再加入溶剂调整溶液浓度，微孔滤膜滤 过，取滤液，既得； 2) 获得色谱图： 供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图； 3) 生成对照指纹图谱 选择合格的多批坤灵丸色谱图导入相似度评价系统，计算得相似度结果，并生成标准 对照指纹图谱； 其中高效液相色谱的色谱条件如下： 色谱柱固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为乙腈-甲酸水溶液梯度洗 脱，其中甲酸水中甲酸的浓度为〇. 1%~5%;流速为0. 6~I. 5ml/min ;柱温为25~40°C; 进样量为5~20 μ L ;检测波长为272~276nm， 梯度洗脱表： 时间/分:钟 0, 1%~5%甲酸 乙廳 0 90 ~99 m~1 6-10 90~卵 10-1 25~40 60-80 猶~涕 .4? ~55 5--1? 95-85 50~紐 5~15 95-85 恥~側 1!)-1 根据需要可以加入有效成分的标准对照品以作为参照物峰。2. 根据权利要求1所述的标准对照指纹图谱，其建立方法如下： 1) 供试品溶液的制备，方法如下： 取坤灵丸适量，研成细粉，精密称取〇. 3~0. 7g至5~15ml容量瓶中，加30%~70% 甲醇适量，超声处理20~40min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续 滤液即得， 2) 获得色谱图： 供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，同时以丹皮酚作为参照物； 丹皮酚标准对照品溶液，制备方法为：精密称取丹皮酚对照品适量，加30 %~70 %甲 醇溶解制成每1ml含8~20 μ g的溶液，即得； 3) 生成对照指纹图谱，方法如下： 将多批坤灵丸样品的指纹图谱中8个峰为共有峰，以与丹皮酚对照品峰保留时间相同 的色谱峰为参照峰，其他7个色谱峰的相对保留时间分别为：0. 08、0. 13、0. 14、0. 57、0. 79、 I. 00、1. 08、1. 13,各峰的相对保留时间在±3%~±10%以内。3. 根据权利要求2所述的标准对照指纹图谱，其中，供试品溶液的制备方法如下： 取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取〇. 5g至IOml容量瓶中，加50 %甲 醇适量，超声处理30min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液即 得；对照品溶液的制备方法为：取丹皮酚，加50%甲醇制成每1ml含15 μ g的溶液。4. 根据权利要求1所述的标准对照指纹图谱，其特征在于，色谱条件为：以乙腈-1 %甲 酸为流动相、流速1.0 ml/分钟、柱温30°C、检测波长：274nm。5. 根据权利要求1所述的标准对照指纹图谱，其特征在于，其中梯度洗脱方式为： 时间/分钟 m平酸 乙黯 〇 m 5 8 95 5 :巧 7Q 30 50 IO 90 10： 90 6：§ 9§: S6. -种坤灵丸的高效液相色谱指纹图谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 待测样品洛液的制备： 取坤灵丸样品，加入甲醇或乙醇水溶液，超声溶解，再加入溶剂调整溶液浓度，微孔滤 膜滤过； 2) 待测样品指纹图谱的测定： 取滤液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，色谱条件为： 色谱柱固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为乙腈-甲酸水溶液梯度洗 脱，甲酸水溶液中甲酸的浓度为〇. 1%~5%、流速为0. 6~I. 5ml/min、柱温为25~40°C、 进样量为5~20 μ L ;检测波长为272-276nm ; 梯度洗脱方式为： 时间/分钟 α ?~St甲酸 乙讀 0 90-99 10~1 6 ~W) 90^99 10^1 23~補： 獅~_ 揚~2δ *15-00 δ-15 95-8? 5U '· β0 δ-'-15 95-85 60 ~?I) 90-99 10-? 3) 待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算： 将待测样品的色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版"软 件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度。7. 根据权利要求6的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤1)待测样品溶液的制备方 式为： 取坤灵丸适量，研成细粉，精密称取〇. 3~0. 7g至5~15ml容量瓶中，加30%~70% 甲醇适量，超声处理20~40min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 4-0. 5 μ m微孔滤膜。8. 根据权利要求6的指纹图谱检测方法，其特征在于，其中步骤1)待测样品溶液的制 备方式为：取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取〇. 5g至IOml容量瓶中，加 50%甲醇适量，超声处理30min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜。9. 根据权利要求6的指纹图谱检测方法，其特征在于，其中步骤2)的色谱条件为：以 乙腈-1 %甲酸水溶液为流动相、流速1.0 ml/分钟、柱温30°C、检测波长：274nm、进样量为 10 μ L010. 根据权利要求6的指纹图谱检测方法，其特征在于，其中梯度洗脱方式为： 时间/分钟 找甲酸 乙鑛 0 9S 5 8 95： 5 36 TO 30 〇{) 10 SO 5S IO 90 65 95 S
【专利摘要】本发明提供了一种坤灵丸的高效液相指纹图谱检测方法，所述方法包括：坤灵丸标准指纹图谱的建立、待测坤灵丸指纹图谱的测定和相似性比较判定等步骤。本发明通过尝试多种不同洗脱条件，最终确定了坤灵丸的指纹图谱分析的色谱条件，考察确定了8个共有峰的对照指纹图谱，具有方法简便、速度快、重现性好等特点，所建立的标准指纹图谱经方法学验证满足相关要求，适用性强，能够更全面的反映产品质量状况，为质量控制及制定标准提供了重要依据。
【IPC分类】G01N30/02, G01N30/06
【公开号】CN105486762
【申请号】CN201410482791
【发明人】阚红玉, 刘海涛, 耿晓梅, 孙玉侠, 曹凤兰, 徐立元, 杨建会, 李建, 杨雪梅, 张淑玉
【申请人】天士力制药集团股份有限公司, 天津天士力（辽宁）制药有限责任公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年9月19日
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