一种坤灵丸的质量检测方法及其应用
一种坤灵丸的质量检测方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种坤灵丸的质量检测方法，属于药物分析技术领域。
【背景技术】
[0002] 坤灵丸是一种中药复方制剂，其功能主治为调经养血，逐癒生新。用于月经不调， 或多或少，行经腹痛，子宫寒冷，久不受孕，习惯性流产，赤白带下，崩漏不止，病久气虚，肾 亏腰痛。
[0003] 坤灵丸的处方如下：
[0004] 【处方】
[0005] ( -）香附（制）37g甘草7g白薇14g益母草14g黄茂14g鸡冠花14g麦冬 14g北五味子14g地黄14g红花14g木通lOg白术（炒）14g赤石脂14g巧冬14g厚朴 lOg肉巧蓉（制）14g白巧（酒炒）14g
[0006] (二）香附（制）37g荆芥lOg牡丹皮14g阿胶14g当归14g蔓本lOg红参14g 鹿角胶14g川贝母14g没药（炒）14g砂仁14g延胡索14g小茵香（盐制）14g龟甲胶 14g川写14g
[0007] 【制法】W上处方（一）十走味，加水煎煮二次，第一次3小时，第二次2小时，合并 煎液，滤过，滤液放置24小时，取上清液加入米醋280g，浓缩成稠膏。W上处方（二）十五 味，粉碎成中粉，加入上述稠膏中，混匀，干燥，粉碎成细粉，过筛，混匀，用黄酒泛丸，制成 1800丸，包糖衣或薄膜衣，打光，干燥，即得。
[0008] 由于中药化学成分复杂，作用机制不明确，致使现有中药制药技术难W确保中药 产品质量稳定性，坤灵丸现行标准收载于中华人民共和国卫生部药品标准《中药成方制剂》 第十册，标准中未涉及任何针对药味的定性定量控制项目，发明人对坤灵丸的有效成分进 行了研究。发现其中含有多种水溶性与醇溶性成分，本发明人有针对性的对送些成分进行 了研究，建立了一种坤灵丸的检测方法，对生产中的坤灵丸进行质量监督，W确保产品质 量。
【发明内容】
[0009] 本发明目的在于提供一种坤灵丸的质量检测方法，为该制剂的质量控制提供更完 善的检测方法。
[0010] 本发明所述的质量检测方法，包括鉴别方法和含量测定方法。
[0011] 本发明首先提供一种坤灵丸的鉴别方法，该方法包括对W下中药的鉴别：
[0012] A牡丹皮鉴别
[0013] B当归-川写-蔓本鉴别
[0014] C延胡索鉴别 [001引 D白巧鉴别 [0016] E红参鉴别
[0017] F香附鉴别
[0018] 本发明的鉴别方法采用薄层色谱法，共有6项，可W使用其中一项作为对坤灵丸 的鉴别方法，也可W多项组合使用作为对坤灵丸的鉴别方法，优选的是多项组合使用，最优 选的是6项组合使用。
[0019] 其次，本发明还包括对坤灵丸中的有效成分丹皮酪进行含量测定，含量测定方法 采用高效液相色谱法。
[0020] 本发明的鉴别方法，优选采用W下方法：
[0021] A牡丹皮鉴别
[0022] 供试品溶液的制备；取坤灵丸薄膜衣丸8g~12g、糖衣丸12~18g，采用研细方 式，加稀盐酸1~4ml，加己離20~50ml，加热回流15~40min，滤过，滤液回收溶剂至干， 残渣加己酸己醋1~3ml使溶解，作为供试品溶液。
[0023] 对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材0. 8~1. 2g，加稀盐酸1~4ml，加己離 20~50ml，加热回流15~40min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加己酸己醋1~3ml使溶 解，作为对照药材溶液。
[0024] 对照品溶液的制备；取丹皮酪对照品适量，加己酸己醋制成每1ml含0. 8~1. 2mg 的溶液，摇匀，即得。
[00巧]阴性样品溶液的制备；通过查询文献，白巧中也含有微量的丹皮酪，故按处方配 比，取除牡丹皮、白巧外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成 阴性样品溶液。
[002引鉴别；照薄层色谱法（附录VI B)试验，吸取上述供试品溶液5~10 μ 1、对照药材 溶液、丹皮酪对照品溶液、阴性样品溶液各5~15 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W石 油離化0~9(TC)-己酸己醋巧~3 : 1)为展开剂，展开，取出，瞭干，喷W盐酸酸性5% Η氯化铁己醇溶液（每100ml 5%H氯化铁己醇溶液中，加入盐酸1~5滴，混匀，即得）。 供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无 干扰。见附图（1)。
[0027] B当归-川写-蔓本鉴别
[002引供试品溶液的制备；同牡丹皮供试品溶液的制备。
[0029] 对照药材溶液的制备；分别取当归对照药材、川写对照药材、蔓本对照药材各 0. 8~1. 2g，分别加己離20~50ml，水浴回流15~40min，取出，放冷，滤过，滤液回收己離 至干，残渣分别加己酸己醋1~3ml使溶解，作为当归对照药材溶液，川写对照药材溶液，蔓 本对照药材溶液。
[0030] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川写、蔓本外的其他药材，按制备工 艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。
[0031] 鉴别；照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液及 上述对照药材与阴性样品溶液各5~15 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W正己焼-己 酸己醋-甲酸（95~70:5~30:1)为展开剂，展开，取出，瞭干，置紫外光灯（366nm)下检 视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的英光斑点，阴性样品无 干扰。见附图（2)。
[0032] C延胡索鉴别
[0033] 供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，研成细粉，称取1. 5~2. 5g，加0. 1~0. 3mol/ L的氨氧化钢溶液5~15ml,超声15~25min后，加入己酸己醋5~20ml,振摇萃取，2000~ 3000转/min离必3~lOmin,取上清液，即得。
[0034] 对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材0. 3~1. Og于20~100ml圆底烧瓶中， 加氨水0. 3~0. 8ml浸润，加二氯甲焼5~15ml，5(TC~7(TC水浴回流0. 5~比，滤过，挥 干，用甲醇1~3ml溶解，即得。
[0035] 对照品溶液的制备；取延胡索己素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0. 15~ 0. 25mg的溶液，作为对照品溶液。
[0036] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备工艺制备样 品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液。
[0037] 鉴别；照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录VI B)试验，吸取上述供试品溶 液、对照药材溶液与阴性样品溶液各5~10 μ 1、对照品溶液2~10 μ 1，分别点于同一硅胶 G薄层板上，W正己焼-二氯甲焼-甲醇-浓氨巧~8 : 2~5 : 0.5~1.5 : 0.1)为展 开剂，展开，取出，瞭干，置贿蒸气中熏至斑点显色清晰后取出，挥尽板上吸附的贿后，置紫 外光灯（366nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同 颜色的英光斑点，阴性样品无干扰。见附图（3)。
[0038] D白巧鉴别
[0039] 供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸12~18g(糖衣丸15~ 20g)，加甲醇30~70ml，加热回流0. 5~比，滤过，滤液蒸干，残渣加水15~25ml使溶解， 用水饱和的正了醇振摇提取2~3次，每次15~25ml，合并正了醇提取液，用氨试液3~ 8ml洗涂，用正了醇饱和的水洗2~3次，每次10~20ml，弃去水洗液，正了醇液蒸干，残渣 加无水己醇1~3ml溶解，作为供试品溶液。
[0040] 对照品溶液的制备；取巧药巧对照品，加甲醇制成每1ml含0. 8~1. 2mg的溶液， 作为对照品溶液。
[0041] 阴性样品溶液的制备：通过文献查阅发现，处方中牡丹皮与白巧同属毛畏科植物， 其主要成分中亦含巧药巧，故按处方配比，取除白巧、牡丹皮外的其他药材，按制备工艺制 备样品，再按供试品溶液制备方法制成白巧、牡丹皮双阴性样品溶液，结果阴性无干扰。
[0042] 鉴别；照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液及阴 性样品溶液各10~20 μ 1、对照品溶液5~15 μ 1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，W Η氯甲焼-己酸己醋-甲醇-甲酸（30~45:3~6:5~15:0.4)为展开剂，展开，取出，喷 W 1%~5%香草醒硫酸溶液，在105°C加热至斑点显色清晰。供试品色谱图中，在与对照品 色谱图相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。见附图（4)。
[004引 E红参鉴别
[0044] 供试品溶液的制备；用白巧供试品溶液。
[0045] 对照品溶液的制备；取人参皂巧Rgl、人参皂巧化1、人参皂巧Re对照品适量，加甲 醇制成每1ml分别含有人参皂巧Rgl、人参皂巧化1、人参皂巧Re各0. 8~1. 2mg的溶液， 作为对照品溶液。
[0046] 对照药材溶液的制备：取红参对照药材0. 8~1. 2g，W下操作同供试品溶液处理 方法，作为对照药材溶液。
[0047] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按制备工艺制备样 品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液。
[0048] 鉴别；照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液及阴 性样品溶液各15~20 μ 1、对照药材溶液及对照品溶液5~20 μ 1，分别点于同一高效硅胶 G薄层板（烟台板）上，氯甲焼-甲醇-水巧0~70:20~40:5~20)5~1(TCW下 放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，喷W 5~10%硫酸己醇溶液，在105°C加热至斑 点显色清晰。供试品色谱图中，在与对照品及对照药材色谱图相应的位置上，显示相同颜色 的斑点。阴性样品无干扰。见附图巧）。
[004引 F香附鉴别
[0050] 供试品溶液的制备；用牡丹皮供试品溶液。
[0051] 对照品溶液的制备；取α -香附丽对照品适量，加甲醇制成每1ml含有α -香附丽 0. 8~1. 2mg的溶液，作为对照品溶液。
[0052] 对照药材溶液的制备：取香附对照药材0. 8~1. 2g，加入稀盐酸1~3ml，加己離 20~40ml回流20~40min，放至室温，滤过，回收溶剂至近干，W己醇1~3ml复溶，即得。
[0053] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按制备工艺制备样 品，再按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液。
[0054] 鉴别；照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录VI B)试验，取上述薄膜衣丸供 试品溶液10-20 μ 1、糖衣丸供试品溶液20-25 μ 1、对照品溶液1-10 μ 1和对照药材溶液 10-20 μ 1点于同一高效硅胶G薄层板（Macher巧-Nagel F254高效薄层板）上，W甲苯-己 酸己醋-甲酸（85~95 ;3~8 ;3~8)为展开剂，展开，取出，瞭干，置紫外光灯（254nm)下 检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷W 二硝基苯阱试液，放置片刻，在日光下观察。在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱 相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性样品无干扰。见附图化）。
[0055] 本发明的含量测定方法，所述的丹皮酪含量测定方法，步骤如下：
[0056] ①供试品溶液的制备：取坤灵丸，粉碎后加入50~70%甲醇溶液中，超声处理后 加50~70%甲醇溶液定容至刻度，过微孔滤膜，即得；
[0057] ②对照品溶液的制备；取丹皮酪对照品适量，加50%~70%甲醇溶液制成每1ml 含14~18 μ g丹皮酪的溶液，即得；
[0058] ⑨含量测定；分别吸取对照品溶液与供试品溶液各5~10 μ 1，注入高效液相色谱 仪，得到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酪的含量，必要时可W使用阴性对照品溶液W排 除干扰；
[0059] 其中色谱条件为：W十八烷基娃焼键合硅胶为填充剂为W下填充剂的一种 Shima化U VP-0DS150X4. 6mm 色谱柱、Dikma Diamomsi]_-C185 μ m, 250 X 4. 6mm 色谱柱、 Agilent ZORBAX SB-C185 μ m, 250X4. 6mm，色谱柱及 Waters2695-2489、Waters 2695-PDA; W 30~60 : 70~40的甲醇-水为流动相；检测波长为270~278皿；流速0. 6~1. 5ml/ min;柱温25~35°C，进样量5~15 μ 1。
[0060] 优选的，本发明的含量测定方法如下：
[0061] 对照品溶液的制备取丹皮酪对照品适量，精密称定，加50%~70%甲醇水溶液制 成每1ml约含14~18 μ g的溶液，即得。
[0062] 供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取0. 4~0. 6g，精密称 定，置10~25ml容量瓶中，加入50~70 %甲醇溶液适量，超声（功率120W，频率40曲Z) 处理15~30min，放冷至室温，加50~70%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤 膜，取续滤液，即得。
[0063] 测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、牡丹皮-白巧阴性供试品溶液各 5~10μ 1，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酪的含量。
[0064] 高效液相色谱条件：W十八烷基娃焼键合硅胶为填充剂（Shima化U VP-0DS(150X4. 6mm)，色谱柱、Dikma Diamomsil-C18 巧 μL?，250X4. 6mm)，色谱柱、Agilent ZORBAX SB-C18 巧 μ m, 250 X 4. 6mm)，色谱柱及 Waters2695-2489、Waters 2695-PDA) ; W 甲 醇-水（30~60 : 70~40)为流动相；检测波长为270~278皿；流速0. 6~1. 5ml/min ; 柱温25~35°C，进样量5~15 μ 1。
[0065] 其中优选；高效液相色谱条件；W十八烷基娃焼键合硅胶为填充剂（Agilent Z0RBAX SB-C185 μ m，4. 6 X 250mm) ; W 甲醇-水（30 ~60 : 70 ~40)为流动相；检测波长 为270~278nm ;流速0. 6~1. 5ml/min ;柱温25~35°C，进样量5~15μ 1。
[0066] 最优选，W 50 : 50甲醇-水为流动相；检测波长为274皿；流速Iml/min ;柱温 3(TC，进样量 10μ 1 ;
[0067] 对照品溶液的制备取丹皮酪对照品适量，精密称定，加50%甲醇水溶液制成每 1ml约含16 μ g的溶液，即得；
[006引供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取0. 5g，精密称定，置 25ml容量瓶中，加入50%甲醇溶液适量，120W、40曲Z超声处理20min，放冷至室温，加50% 甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液，即得；
[0069] 测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液10μ 1，注入高效液相色谱仪，得 到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酪的含量。
[0070] 测定结果见图（7)、做、巧）、（10)。结果显示，阴性样品无干扰。
[0071] 本发明含量测定方法的验证：
[0072] 1仪器与试药
[0073] Waters 2695-2489高效液相色谱仪及紫外检测器；Empower液相色谱工作站； Agilent Z0RBAX SB-C18色谱柱巧um，250X4. 6mm);甲醇（色谱纯，天津市康科德科技有 限公司）；水为超纯水（公司自制，Milli曲；对照品；丹皮酪对照品（中国食品药品检定研 究院，批号：110708-200506)。
[0074] 2线性关系考察
[00巧]取丹皮酪对照品适量，精密称定（实际称样量；12. 73mg)，置于100ml容量瓶中， 加50%甲醇溶解，稀释并定容至刻度，摇匀即得对照品母液化1273mg/ml)。将丹皮酪对 照品母液依次稀释得到浓度为 0. 〇636mg/ml、0. 0318mg/ml、0. 0159mg/ml、0. 0080mg/ml、 0. 0040mg/ml、0. 0020mg/ml的对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液及对照品母液各 1〇μ1，注入液相色谱仪中，记录色谱图。W丹皮酪的对照品浓度（mg/ml)为横坐标，丹皮酪 峰面积为纵坐标，求得回归方程巧=48644921. 31X+10376. 05，r = 0. 9999。结果表明丹皮 酪在0. 0020mg/ml~0. 1273mg/ml浓度范围内，线性良好。
[0076] 3精密度试验
[0077] 取坤灵丸样品适量（薄膜衣丸，批号：20121101 ;糖衣丸，批号：20120901),按照 "实施例7"项下方法制备供试品溶液。精密吸取上述两种供试品溶液10 μ 1，连续进样6针， 测得薄膜衣丸峰面积平均值为779400, RSD为0. 47% ;糖衣丸峰面积平均值为867291，RSD 为0. 42%。结果表明，供试品溶液在该色谱条件下进行丹皮酪含量测定时，精密度良好。 [007引 4重复性试验
[0079] 取坤灵丸样品适量（薄膜衣丸，批号：20121101 ;糖衣丸，批号：20120901)，研细， 取0. 5g，精密称定，共6份，照"实施例7"项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取上述供 试品溶液及对照品溶液各1〇μ1，进样分析。记录色谱图，并计算丹皮酪的含量。结果薄膜 衣丸样品中丹皮酪平均含量为0. 8220mg/g，RSD为1. 10% ;糖衣丸样品中丹皮酪平均含量 为0. 8958mg/g，RSD为0. 24%。结果表明，方法的重复性良好。
[0080] 5稳定性试验
[0081] 取坤灵丸样品适量（薄膜衣丸，批号：20121101 ;糖衣丸，批号：20120901),照"实 施例7"项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取上述供试品溶液10 μ 1，分别于0、2、8、12、 16、24h进样分析，计算峰面积的相对平均偏差RSD，薄膜衣丸、糖衣丸RSD分别为0. 66 %、 0. 47%。结果表明供试品溶液在24h内稳定。
[008引 6加样回收率试验
[0083] 取坤灵丸样品适量（薄膜衣丸，批号：20121101 ;糖衣丸，批号：20120901),研细， 取0.25g，精密称定。向已知丹皮酪含量的样品中加入该样品所含丹皮酪含量的80%、 100%、120%的丹皮酪对照品，每个浓度各3份，共9份，按"实施例7"项下供试品溶液制备 方法处理。分别精密吸取上述供试品溶液1〇μ 1，进样分析，记录色谱图，计算回收率，薄膜 衣丸平均回收率为103. 4%，RSD为0. 67% ;糖衣丸平均回收率为102. 2%，RSD为1. 19%。 见表1、表2,结果符合含量测定有关要求，说明该方法准确度良好。
[0084] 表1薄膜衣丸加样回收率试验
[0085]
[0086]
[0087] 注：薄膜衣丸中丹皮酪含量按照重复性项下含量0. 8220mg/g计算。
[008引表2糖衣丸加样回收率试验
[0089]
[0091] 注；糖衣丸中丹皮酪含量按照重复性项下含量0. 8958mg/g计算。
[0092] 7样品测定
[0093] 分别选取坤灵丸样品Η批（薄膜衣丸，批号；20121001、20121101、20130112 ;糖衣 丸，批号；20120901、20120904、20130101)，按"实施例7"项下供试品溶液制备方法处理。分 别精密吸取上述供试品溶液10 μ 1，进样分析，记录色谱图，计算含量，结果见表3、4。
[0094] 表3薄膜衣丸样品测定
[0095]
[0098] 本发明的有益效果在于：
[0099] 本发明中涉及的8味药材的薄层鉴别，除延胡索鉴别需单独处理供试品外，其中 牡丹皮、当归、川写、蔓本、香附5味药材鉴别可采用同一供试品溶液，白巧、红参2味药材鉴 别可采用同一供试品溶液，本方法既节省样品取样量，又节省溶剂、环保经济、污染小。
[0100] 丹皮酪含量测定方法考察中，考虑不同厂家色谱柱及不同实验室的 仪器设施因素，另分别考察了 Shima化U VP-0DS(150X4. 6mm)，色谱柱、Dikma Diamomsil-C18 巧 um, 250X4. 6mm),色谱柱、Agilent Z0RBAX SB-C18 巧 um, 250X4. 6mm), 色谱柱及Waters2695-2489、Waters 2695-PDA高效液相色谱仪的分离情况，结果均满足要 求。
[0101] 本发明所提供的坤灵丸的质量检测方法，是通过大量具体创造性试验筛选后得到 的，鉴别方法中通过对样品处理方法的筛选，展开剂的选择，使得鉴别专属性好，且方法简 便快捷、经济实用、结果快速。含量测定方法中通过对供试品处理方法及色谱条件的考察， 证明本方法具有良好的重复性、稳定性、专属性及耐用性，该含量测定方法可有效的对产品 进行质量分析，保证了该产品的质量稳定性。
【附图说明】
[0102] 图1、从左到右；糖衣丸样品（20120903)、牡丹皮阴性样品、丹皮酪对照品（中检 院）、牡丹皮对照药材（中检院）、薄膜衣丸样品（20120809)、薄膜衣丸样品（20121002)、薄 膜衣丸样品（20121102)、薄膜衣丸样品（20130103);
[0103] 图2、从左到右：薄膜衣丸20121002、薄膜衣20120809、当归对照药材（中检院）、 川写对照药材（中检院）、蔓本对照药材（中检院）、薄膜衣丸20121102、糖衣丸20120903 ;
[0104] 图3、从左到右：薄膜衣丸20121101、薄膜衣丸20130102、薄膜衣丸20121001、薄 膜衣丸20120809、阴性样品、延胡索己素（中检院）、延胡索对照药材（中检院）、糖衣丸 20120903、薄膜衣 20121102、薄膜衣丸 20121002 ;
[0105] 图4、从左到右：薄膜衣丸20130103、薄膜衣丸20121105、薄膜衣丸20121103、巧药 巧对照品（中检院）、双阴性样品、糖衣丸20120901、糖衣丸20120904、糖衣丸20130101 ;
[0106] 图5、从左到右；薄膜衣20130103、薄膜衣丸20121105、薄膜衣丸20121103、红参阴 性、人参皂巧Rgl+人参皂巧化1+人参皂巧Re混合对照品（中检院）、红参对照药材（中检 院）、糖衣丸20120901、糖衣丸20120904、糖衣丸20130101 ;
[0107] 图6、从左到右；香附阴性、香附对照药材（中检院）、薄膜衣丸20130101、糖衣丸 20120901、α-香附丽对照品；
[010引图7、牡丹皮-白巧阴性供试品溶液；
[0109] 图8、丹皮酪对照品溶液；
[0110] 图9、薄膜衣丸供试品溶液；
[01川图10、糖衣丸供试品溶液。
【具体实施方式】
[0112] 下述实施例用于进一步说明但不限于本发明。
[0113] 实施例1牡丹皮鉴别
[0114] 供试品溶液的制备；取坤灵丸素丸lOg，（薄膜衣丸lOg ;含牡丹皮、延胡索、当归、 川写、白巧约为0. 5g ;约含蔓本0. 35g ;糖衣丸15g ;含牡丹皮、延胡索、当归、川写、白巧约 为0. 4g ;约含蔓本0. 3g)，采用研细方式，加稀盐酸2ml，加己離30ml，加热回流30min，滤 过，滤液回收溶剂至干，残渣加己酸己醋2ml使溶解，作为供试品溶液。
[0115] 对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材1. Og，加稀盐酸1ml，加己離30ml，加热 回流30min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加己酸己醋2ml使溶解，作为对照药材溶液。
[0116] 对照品溶液的制备；取丹皮酪对照品适量，加己酸己醋制成每1ml含Img的溶液， 摇匀，即得。
[0117] 阴性样品溶液的制备；通过查询文献，白巧中也含有微量的丹皮酪，故按处方配 比，取除牡丹皮、白巧外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成 阴性样品溶液。
[om] 鉴别；照薄层色谱法（附录VI B)试验，吸取上述供试品溶液5~10 μ 1、对照药材 溶液、丹皮酪对照品溶液、阴性样品溶液各5~15 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W石 油離（60~9(TC)-己酸己醋（3 : 1)为展开剂，展开，取出，瞭干，喷W盐酸酸性5%立氯 化铁己醇溶液（每100ml 5%H氯化铁己醇溶液中，加入盐酸3滴，混匀，即得）。供试品色 谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。见附 图（1)。
[0119] 实施例2当归-川写-蔓本鉴别
[0120] 供试品溶液的制备；同牡丹皮供试品溶液的制备。
[0121] 对照药材溶液的制备；分别取当归对照药材、川写对照药材、蔓本对照药材各 1. Og，分别加己離30ml，水浴回流30 min，取出，放冷，滤过，滤液回收己離至干，残渣分别加 己酸己醋1ml使溶解，作为当归对照药材溶液，川写对照药材溶液，蔓本对照药材溶液。
[0122] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川写、蔓本外的其他药材，按制备工 艺制备样品，再供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。
[0123] 鉴别；照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液及上 述对照药材与阴性样品溶液各5~15 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W正己焼-己酸 己醋-甲酸巧0 ; 15 ;1)为展开剂，展开，取出，瞭干，置紫外光灯（366nm)下检视。供试品色 谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的英光斑点，阴性样品无干扰。见附图 似。
[0124] 实施例3延胡索鉴别
[01巧]供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，研成细粉，称取2g，加0. 2mol/L的氨氧化钢溶 液10ml，超声20min后，加入己酸己醋10ml，振摇萃取，3000转/min离必5min，取上清液， 即得。
[0126] 对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材0. 5g于50ml圆底烧瓶中，加氨水0. 5ml 浸润，加二氯甲焼l〇ml，6(TC水浴回流比，滤过，挥干，用甲醇2ml溶解，即得。
[0127] 对照品溶液的制备；取延胡索己素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0. 2mg的溶 液，作为对照品溶液
[012引阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备工艺制备样 品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液。
[0129] 鉴别；照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录VI B)试验，吸取上述供试品溶 液、对照药材溶液与阴性样品溶液各5~10 μ 1、对照品溶液2~10 μ 1，分别点于同一硅胶 G薄层板上，W正己焼-二氯甲焼-甲醇-浓氨（7.5 : 4 : 1 : 0.1)为展开剂，展开，取 出，瞭干，置贿蒸气中熏至斑点显色清晰后取出，挥尽板上吸附的贿后，置紫外光灯（366nm) 下检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的英光斑 点，阴性样品无干扰。见附图（3)。
[0130] 实施例4白巧鉴别
[0131] 供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸15g(糖衣丸17g)，加甲 醇50ml，加热回流比，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正了醇振摇提 取3次，每次20ml，合并正了醇提取液，用氨试液5ml洗涂，用正了醇饱和的水洗2次，每次 15ml，弃去水洗液，正了醇液蒸干，残渣加无水己醇2ml溶解，作为供试品溶液。
[013引对照品溶液的制备；取巧药巧对照品，加甲醇制成每1ml含Img的溶液，作为对照 品溶液。
[0133] 阴性样品溶液的制备：通过文献查阅发现，处方中牡丹皮与白巧同属毛畏科植物， 其主要成分中亦含巧药巧，故按处方配比，取除白巧、牡丹皮外的其他药材，按制备工艺制 备样品，再按供试品溶液制备方法制成白巧、牡丹皮双阴性样品溶液，结果阴性无干扰。
[0134] 鉴别；照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液及阴 性样品溶液各10~20 μ 1、对照品溶液5~15 μ 1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，W S氯甲焼-己酸己醋-甲醇-甲酸（40:5:10:0.4)为展开剂，展开，取出，喷W 5%香草醒 硫酸溶液，在l〇5°C加热至斑点显色清晰。供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置 上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。见附图（4)。
[0135] 实施例5红参鉴别
[0136] 供试品溶液的制备；用白巧供试品溶液。
[0137] 对照品溶液的制备；取人参皂巧Rgl、人参皂巧化1、人参皂巧Re对照品适量，加甲 醇制成每1ml分别含有人参皂巧Rgl、人参皂巧化1、人参皂巧Re各Img的溶液，作为对照 品溶液。
[013引对照药材溶液的制备：取红参对照药材1. Og，W下操作同供试品溶液制备，作为 对照药材溶液。
[0139] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按制备工艺制备样 品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液。
[0140] 鉴别；照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液及 阴性样品溶液各15~20 μ 1、对照药材溶液及对照品溶液5~20 μ 1，分别点于同一高效娃 胶G薄层板（烟台板）上，氯甲焼-甲醇-水化0:30:10) 1(TCW下放置分层的下层溶 液为展开剂，展开，取出，喷W 10%硫酸己醇溶液，在l〇5°C加热至斑点显色清晰。供试品色 谱图中，在与对照品及对照药材色谱图相应的位置上，显示相同颜色的斑点。阴性样品无干 扰。见附图巧）。
[0141] 实施例6香附鉴别
[0142] 供试品溶液的制备；用牡丹皮供试品溶液。
[0143] 对照品溶液的制备；取α-香附丽对照品适量，加甲醇制成每1ml含有α-香附丽 Img的溶液，作为对照品溶液。
[0144] 对照药材溶液的制备：取香附对照药材Ig，加入稀盐酸1ml，加己離30ml回流 30min，放至室温，滤过，回收溶剂至近干，W己醇2ml复溶，即得。
[0145] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按制备工艺制备样 品，再按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液。
[0146] 鉴别；照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录VI B)试验，取上述薄膜衣丸供 试品溶液10-20 μ 1、糖衣丸供试品溶液20-25 μ 1、对照品溶液1-10 μ 1和对照药材溶液 10-20 μ 1点于同一高效硅胶G薄层板（Macher巧-Nagel F254高效薄层板）上，W甲苯-己 酸己醋-甲酸巧2 ;5 ;5)为展开剂，展开，取出，瞭干，置紫外光灯（254nm)下检视。供试品 色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷W二硝基苯阱试 液，放置片刻，在日光下观察。在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上， 显相同颜色的斑点。阴性样品无干扰。见附图化）。
[0147] 实施例7丹皮酪含量测定
[0148] 高效液相色谱条件：W十八烷基娃焼键合硅胶为填充剂（Agilent Z0RBAX SB-C185um，4. 6X250mm) 甲醇-水巧0 : 50)为流动相；检测波长为274nm;流速1ml/ min ;柱温30°C，进样量10μ 1。
[0149] 对照品溶液的制备；取丹皮酪对照品适量，精密称定，加50%甲醇水溶液制成每 1ml约含16 μ g的溶液，即得。
[0150] 供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取〇.5g，精密称定，置 25ml容量瓶中，加入50%甲醇溶液适量，超声（功率120W，频率40曲Z)处理20min，放冷至 室温，加50%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液，即得。
[0151] 测定法；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μ 1，注入高效液相色谱仪， 得到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酪的含量。见附图（7)~（10)。
[0152] 实施例8
[0153] 坤灵丸的质量检测方法
[0154] 牡丹皮的鉴别
[0155] 供试品溶液的制备；取坤灵丸薄膜衣丸8g或糖衣丸12g，采用研细方式，加稀盐酸 1ml，加己離20ml，加热回流15min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加己酸己醋1ml使溶解， 作为供试品溶液；
[0156] 对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材0. 8g，加稀盐酸1ml，加己離20ml，加热 回流15min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加己酸己醋1ml使溶解，作为对照药材溶液；
[0157] 对照品溶液的制备；取丹皮酪对照品适量，加己酸己醋制成每1ml含0. 8mg的溶 液，摇匀，即得；
[015引阴性样品溶液的制备：按坤灵丸处方配比，取除牡丹皮、白巧外的其他药材，按坤 灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液；
[0159] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液5 μ 1、对照药材溶液、丹皮酪对照 品溶液、阴性样品溶液各5μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W6(TC，5 : 1石油離-己酸 己醋为展开剂，展开，取出，瞭干，喷W盐酸酸性5%H氯化铁己醇溶液；供试品色谱中，在 与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰；
[0160] 当归、川写、蔓本薄层鉴别，步骤如下：
[0161] 供试品溶液的制备；同牡丹皮供试品溶液的制备方法；
[0162] 对照药材溶液的制备；分别取当归对照药材、川写对照药材、蔓本对照药材各 0. 8g，分别加己離20ml，水浴回流15min，取出，放冷，滤过，滤液回收己離至干，残渣分别加 己酸己醋1ml使溶解，作为当归对照药材溶液，川写对照药材溶液，蔓本对照药材溶；
[0163] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川写、蔓本外的其他药材，按坤灵丸 的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液，
[0164] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及上述对照药材与阴性样品溶液各 5 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W 95 ;5 ;1的正己焼-己酸己醋-甲酸为展开剂，展 开，取出，瞭干，置366nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置 上，显相同颜色的英光斑点，阴性样品无干扰；
[0165] 延胡索薄层鉴别，步骤如下：
[0166] 供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，研成细粉，称取1. 5g，加0.1mol/L的氨氧化钢 溶液5ml，超声15min后，加入己酸己醋5ml，振摇萃取，2000转/min离必3min，取上清液， 即得；
[0167] 对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材0. 3g于20ml圆底烧瓶中，加氨水0. 3ml 浸润，加二氯甲焼5ml，5(TC水浴回流0.化，滤过，挥干，用甲醇1ml溶解，即得；
[016引对照品溶液的制备；取延胡索己素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0. 15mg的溶 液，作为对照品溶液；
[0169] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备坤灵丸的工 艺制备样品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液；
[0170] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液与阴性样品溶液各 5μ1、对照品溶液2μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W5 : 2 : 0. 5 : 0. 1的正己焼-二 氯甲焼-甲醇-浓氨为展开剂，展开，取出，瞭干，置贿蒸气中熏至斑点显色清晰后取出，挥 尽板上吸附的贿后，置366nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱 相应的位置上，显相同颜色的英光斑点，阴性样品无干扰，
[0171] 白巧薄层鉴别，步骤如下：
[0172] 供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸12g或糖衣丸15g，加甲 醇30ml，加热回流0.化，滤过，滤液蒸干，残渣加水15ml使溶解，用水饱和的正了醇振摇提 取2次，每次15ml，合并正了醇提取液，用氨试液3ml洗涂，用正了醇饱和的水洗2次，每次 10ml，弃去水洗液，正了醇液蒸干，残渣加无水己醇1ml溶解，作为供试品溶液；
[017引对照品溶液的制备；取巧药巧对照品，加甲醇制成每1ml含0. 8mg的溶液，作为对 照品溶液；
[0174] 阴性样品溶液的制备：取除白巧、牡丹皮外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备 样品，再按供试品溶液制备方法制成白巧、牡丹皮双阴性样品溶液，结果阴性无干扰；
[0175] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各10 μ 1、对照品溶液 5 μ 1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，W 30:3:5:0. 4 Η氯甲焼-己酸己醋-甲醇-甲 酸为展开剂，展开，取出，喷W 1%~5%香草醒硫酸溶液，在105°C加热至斑点显色清晰；供 试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰，
[0176] 红参薄层鉴别，步骤如下：
[0177] 供试品溶液的制备；用白巧供试品溶液
[0178] 对照品溶液的制备；取人参皂巧Rgl、人参皂巧化1、人参皂巧Re对照品适量，加甲 醇制成每1ml分别含有人参皂巧Rgl、人参皂巧化1、人参皂巧Re各0. 8mg的溶液，作为对 照品溶液；
[0179] 对照药材溶液的制备：取红参对照药材0. 8g， W下操作同供试品溶液处理方法， 作为对照药材溶液；
[0180] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺 制备样品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液；
[0181] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各15 μ 1、对照药材溶 液及对照品溶液5 μ 1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，W 50:20:5 Η氯甲焼-甲醇-水 5°CW下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，喷W5%硫酸己醇溶液，在105°C加热 至斑点显色清晰；供试品色谱图中，在与对照品及对照药材色谱图相应的位置上，显示相同 颜色的斑点，阴性样品无干扰；
[0182] 香附薄层鉴别，步骤如下：
[0183] 供试品溶液的制备；用牡丹皮供试品溶液；
[0184] 对照品溶液的制备；取α-香附丽对照品适量，加甲醇制成每1ml含有α-香附丽 0. 8mg的溶液，作为对照品溶液；
[0185] 对照药材溶液的制备：取香附对照药材0.8g，加入稀盐酸1ml，加己離20ml回流 20min，放至室温，滤过，回收溶剂至近干，W己醇1ml复溶，即得；
[0186] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按制备工艺制备样 品，再按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液；
[0187] 鉴别；照薄层色谱法试验，取上述薄膜衣丸供试品溶液10μ 1、糖衣丸供试品溶液 20 μ 1、对照品溶液1 μ 1和对照药材溶液10 μ 1点于同一高效硅胶G薄层板上，W 85 ;3 ;3 的甲苯-己酸己醋-甲酸为展开剂，展开，取出，瞭干，置紫外光灯下检视，供试品色谱中，在 与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷W二硝基苯阱试液，放置片 亥IJ，在日光下观察，在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜 色的斑点，阴性样品无干扰。
[018引 实施例9
[0189] 坤灵丸的质量检测方法
[0190] 牡丹皮的鉴别
[0191] 供试品溶液的制备；取坤灵丸薄膜衣丸12g或糖衣丸18g，采用研细方式，加稀盐 酸4ml，加己離50ml，加热回流40min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加己酸己醋3ml使溶 解，作为供试品溶液；
[0192] 对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材1. 2g，加稀盐酸4ml，加己離50ml，加热 回流40min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加己酸己醋3ml使溶解，作为对照药材溶液；
[0193] 对照品溶液的制备；取丹皮酪对照品适量，加己酸己醋制成每1ml含1. 2mg的溶 液，摇匀，即得；
[0194] 阴性样品溶液的制备：按坤灵丸处方配比，取除牡丹皮、白巧外的其他药材，按坤 灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液；
[0195] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液10 μ 1、对照药材溶液、丹皮酪对 照品溶液、阴性样品溶液各15 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W 9(TC，3 : 1石油離-己 酸己醋为展开剂，展开，取出，瞭干，喷W盐酸酸性5%H氯化铁己醇溶液；供试品色谱中， 在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰；
[0196] 当归、川写、蔓本薄层鉴别，步骤如下：
[0197] 供试品溶液的制备；同牡丹皮供试品溶液的制备方法；
[0198] 对照药材溶液的制备；分别取当归对照药材、川写对照药材、蔓本对照药材各 1. 2g，分别加己離50ml，水浴回流40min，取出，放冷，滤过，滤液回收己離至干，残渣分别加 己酸己醋3ml使溶解，作为当归对照药材溶液，川写对照药材溶液，蔓本对照药材溶；
[0199] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川写、蔓本外的其他药材，按坤灵丸 的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液，
[0200] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及上述对照药材与阴性样品溶液各 15 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W 70 ;30 ;1的正己焼-己酸己醋-甲酸为展开剂， 展开，取出，瞭干，置366nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置 上，显相同颜色的英光斑点，阴性样品无干扰；
[0201] 延胡索薄层鉴别，步骤如下：
[0202] 供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，研成细粉，称取2. 5g，加0. 3mol/L的氨氧化钢 溶液15ml，超声25min后，加入己酸己醋20ml，振摇萃取，3000转/min离必lOmin，取上清 液，即得；
[020引对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材1. Og于100ml圆底烧瓶中，加氨水 0. 8ml浸润，加二氯甲焼15ml，7(TC水浴回流比，滤过，挥干，用甲醇3ml溶解，即得；
[0204] 对照品溶液的制备；取延胡索己素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0. 25mg的溶 液，作为对照品溶液；
[0205] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备坤灵丸的工 艺制备样品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液；
[0206] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液与阴性样品溶液各 10 μ 1、对照品溶液10 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W8 : 5 : 1.5 : 0.1的正己 焼-二氯甲焼-甲醇-浓氨为展开剂，展开，取出，瞭干，置贿蒸气中熏至斑点显色清晰后取 出，挥尽板上吸附的贿后，置366nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品及对照药 材色谱相应的位置上，显相同颜色的英光斑点，阴性样品无干扰，
[0207] 白巧薄层鉴别，步骤如下：
[020引供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸18g或糖衣丸20g，加甲 醇70ml，加热回流比，滤过，滤液蒸干，残渣加水25ml使溶解，用水饱和的正了醇振摇提 取3次，每次25ml，合并正了醇提取液，用氨试液8ml洗涂，用正了醇饱和的水洗3次，每次 20ml，弃去水洗液，正了醇液蒸干，残渣加无水己醇3ml溶解，作为供试品溶液；
[0209] 对照品溶液的制备；取巧药巧对照品，加甲醇制成每1ml含1. 2mg的溶液，作为对 照品溶液；
[0210] 阴性样品溶液的制备：取除白巧、牡丹皮外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备 样品，再按供试品溶液制备方法制成白巧、牡丹皮双阴性样品溶液，结果阴性无干扰；
[0211] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各20 μ 1、对照品溶液 15 μ 1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，W 45:6:15:0. 4 Η氯甲焼-己酸己醋-甲醇-甲 酸为展开剂，展开，取出，喷W 1 %~5%香草醒硫酸溶液，在105°C加热至斑点显色清晰；供 试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰，
[0212] 红参薄层鉴别，步骤如下：
[0213] 供试品溶液的制备；用白巧供试品溶液
[0214] 对照品溶液的制备；取人参皂巧Rgl、人参皂巧化1、人参皂巧Re对照品适量，加甲 醇制成每1ml分别含有人参皂巧Rgl、人参皂巧化1、人参皂巧Re各1. 2mg的溶液，作为对 照品溶液；
[0215] 对照药材溶液的制备：取红参对照药材1. 2g，W下操作同供试品溶液处理方法， 作为对照药材溶液；
[0216] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺 制备样品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液；
[0217] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各20 μ 1、对照药材 溶液及对照品溶液20 μ 1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，W 70:40:20 Η氯甲焼-甲 醇-水1(TCW下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，喷W 10%硫酸己醇溶液，在 l〇5°C加热至斑点显色清晰；供试品色谱图中，在与对照品及对照药材色谱图相应的位置 上，显示相同颜色的斑点，阴性样品无干扰；
[021引香附薄层鉴别，步骤如下：
[0219] 供试品溶液的制备；用牡丹皮供试品溶液；
[0220] 对照品溶液的制备；取α -香附丽对照品适量，加甲醇制成每1ml含有α -香附丽 1. 2mg的溶液，作为对照品溶液；
[0221] 对照药材溶液的制备：取香附对照药材1. 2g，加入稀盐酸3ml，加己離40ml回流 40min，放至室温，滤过，回收溶剂至近干，W己醇3ml复溶，即得；
[0222] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按制备工艺制备样 品，再按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液；
[0223] 鉴别；照薄层色谱法试验，取上述薄膜衣丸供试品溶液20 μ 1、糖衣丸供试品溶液 25 μ 1、对照品溶液10 μ 1和对照药材溶液20 μ 1点于同一高效硅胶G薄层板上，W 95 ;8 ;8 的甲苯-己酸己醋-甲酸为展开剂，展开，取出，瞭干，置紫外光灯下检视，供试品色谱中，在 与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷W二硝基苯阱试液，放置片 亥IJ，在日光下观察，在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜 色的斑点，阴性样品无干扰。
[0224] 实施例10
[0225] 坤灵丸的质量检测方法
[0226] 牡丹皮鉴别方法为：
[0227] 供试品溶液的制备；取坤灵丸薄膜衣丸lOg或糖衣丸15g，采用研细方式，加稀盐 酸2ml，加己離30ml，加热回流30min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加己酸己醋2ml使溶 解，作为供试品溶液；
[022引对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材1. Og，加稀盐酸1ml，加己離30ml，加热 回流30min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加己酸己醋2ml使溶解，作为对照药材溶液；
[0229] 对照品溶液的制备；取丹皮酪对照品适量，加己酸己醋制成每1ml含Img的溶液， 摇匀，即得；
[0230] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除牡丹皮、白巧外的其他药材，按坤灵丸的 制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液；
[0231] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液5~10 μ 1、对照药材溶液、丹皮酪 对照品溶液、阴性样品溶液各5~15 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W 60~9(TC的 3 : 1石油離-己酸己醋为展开剂，展开，取出，瞭干，喷W盐酸酸性5%立氯化铁己醇溶液； 供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无 干扰；
[023引当归、川写、蔓本鉴别
[0233] 供试品溶液的制备；同牡丹皮供试品溶液的制备；
[0234] 对照药材溶液的制备；分别取当归对照药材、川写对照药材、蔓本对照药材各 1. Og，分别加己離30ml，水浴回流30min，取出，放冷，滤过，滤液回收己離至干，残渣分别加 己酸己醋1ml使溶解，作为当归对照药材溶液，川写对照药材溶液，蔓本对照药材溶液；
[0235] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川写、蔓本外的其他药材，按坤灵丸 的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液，
[0236] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及上述对照药材与阴性样品溶液各 5~15 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W 90 ; 15 ;1正己焼-己酸己醋-甲酸为展开剂， 展开，取出，瞭干，置366nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置 上，显相同颜色的英光斑点，阴性样品无干扰。
[0237] 延胡索鉴别
[023引供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，研成细粉，称取2g，加0. 2mol/L的氨氧化钢溶 液10ml，超声20min后，加入己酸己醋10ml，振摇萃取，3000转/min离必5min，取上清液， 即得；
[0239] 对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材0. 5g于50ml圆底烧瓶中，加氨水0. 5ml 浸润，加二氯甲焼10ml，6(TC水浴回流比，滤过，挥干，用甲醇2ml溶解，即得；
[0240] 对照品溶液的制备；取延胡索己素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0. 2mg的溶 液，作为对照品溶液；
[0241] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备坤灵丸的工 艺制备样品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液；
[0242] 鉴别；照薄层色谱法试验 ，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液与阴性样品溶液各 5~10 μ 1、对照品溶液2~10 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W 7. 5 : 4 : 1 : 0. 1 的正己焼-二氯甲焼-甲醇-浓氨为展开剂，展开，取出，瞭干，置贿蒸气中熏至斑点显色清 晰后取出，挥尽板上吸附的贿后，置366nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品及 对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的英光斑点，阴性样品无干扰；
[0243] 白巧鉴别
[0244] 供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸15g或糖衣丸17g，加甲 醇50ml，加热回流比，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正了醇振摇提 取3次，每次20ml，合并正了醇提取液，用氨试液5ml洗涂，用正了醇饱和的水洗2次，每次 15ml，弃去水洗液，正了醇液蒸干，残渣加无水己醇2ml溶解，作为供试品溶液；
[024引对照品溶液的制备；取巧药巧对照品，加甲醇制成每1ml含Img的溶液，作为对照 品溶液；
[0246] 阴性样品溶液的制备：取除白巧、牡丹皮外的其他药材，按制备坤灵丸的工艺制备 样品，再按供试品溶液制备方法制成白巧、牡丹皮双阴性样品溶液；
[0247] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各10~20 μ 1、对照品 溶液5~15 μ 1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，W 40:5:10:0. 4的Η氯甲焼-己酸己 醋-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，喷W 5%香草醒硫酸溶液，在105°C加热至斑点显色， 供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰；
[024引 红参鉴别
[0249] 供试品溶液的制备；用白巧供试品溶液；
[0巧0] 对照品溶液的制备；取人参皂巧Rgl、人参皂巧化1、人参皂巧Re对照品适量，加甲 醇制成每1ml分别含有人参皂巧Rgl、人参皂巧化1、人参皂巧Re各Img的溶液，作为对照 品溶液；
[0251] 对照药材溶液的制备：取红参对照药材1. Og，W下操作同供试品溶液制备，作为 对照药材溶液；
[0252] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺 制备样品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液；
[025引鉴别；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各15~20 μ 1、对照药 材溶液及对照品溶液5~20 μ 1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，W 60:30:10的Η氯甲 焼-甲醇-水在1(TC W下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，喷W 10%硫酸己醇溶 液，在105°C加热至斑点显色，供试品色谱图中，在与对照品及对照药材色谱图相应的位置 上，显示相同颜色的斑点，阴性样品无干扰 [0巧4] 香附鉴别
[0255] 供试品溶液的制备；用牡丹皮供试品溶液；
[0256] 对照品溶液的制备；取α -香附丽对照品适量，加甲醇制成每1ml含有α -香附丽 Img的溶液，作为对照品溶液；
[0巧7] 对照药材溶液的制备：取香附对照药材Ig，加入稀盐酸1ml，加己離30ml回流 30min，放至室温，滤过，回收溶剂至近干，W己醇2ml复溶，即得；
[0巧引阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺 制备样品，再按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液；
[0巧9] 鉴别；照薄层色谱法试验，取上述薄膜衣丸供试品溶液10-20 μ 1、糖衣丸供试品 溶液20-25μ 1、对照品溶液1-10μ 1和对照药材溶液10-20μ 1点于同一高效硅胶G薄层板 上，W 92 ;5 ;5的甲苯-己酸己醋-甲酸为展开剂，展开，取出，瞭干，置254nm紫外光灯下检 视，供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷W二 硝基苯阱试液，放置片刻，在日光下观察，在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相 应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。
[0260] 实施例11
[0261] 丹皮酪含量测定方法为高效液相色谱法，步骤如下：
[0262] 高效液相色谱条件：W十八烷基娃焼键合硅胶为填充剂为化ima化U VP-0DS150X4. 6mm，色谱柱；W 30 : 70的甲醇-水为流动相；检测波长为270皿；流速 0. 6ml/min ;柱温 25°C，进样量 5 μ 1 ;
[0263] 对照品溶液的制备取丹皮酪对照品适量，精密称定，加50%甲醇水溶液制成每 1ml约含14 μ g的溶液，即得；
[0264] 供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取0. 4g，精密称定，置 10ml容量瓶中，加入50%甲醇溶液适量，超声功率120W，频率40曲Z处理15min，放冷至室 温，加50%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液，即得；
[0265] 测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液5 μ 1，注入高效液相色谱仪，得到 色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酪的含量。
[0266] 实施例12
[0267] 丹皮酪含量测定方法为高效液相色谱法，步骤如下：
[026引高效液相色谱条件：W十八烷基娃焼键合硅胶为填充剂为，Dikma DiamomsU-C185um，250X4. 6mm 3色谱柱；W 60 : 40的甲醇-水为流动相；检测波长为 278nm ;流速 1. 5ml/min ;柱温 35°C，进样量 15 μ 1 ;
[0269] 对照品溶液的制备取丹皮酪对照品适量，精密称定，加70%甲醇水溶液制成每 1ml约含18 μ g的溶液，即得；
[0270] 供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取0. 6g，精密称定，置 25ml容量瓶中，加入70%甲醇溶液适量，超声功率120W，频率40曲Z处理30min，放冷至室 温，加70%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液，即得；
[0271] 巧IJ定法；分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液10μ 1，注入高效液相色谱化得 到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酪的含量。
[0272] 实施例13
[0273] 丹皮酪含量测定方法为高效液相色谱法，步骤如下：
[0274] 高效液相色谱条件；W十八烷基娃焼键合硅胶为填充剂，具体为Agilent Z0RBAX SB-C185 μ m,4. 6 X250mm ;
[027引 W 50 : 50甲醇-水为流动相；检测波长为274nm ;流速Iml/min ;柱温3(TC，进样 量 10 μ 1 ;
[0276] 对照品溶液的制备取丹皮酪对照品适量，精密称定，加50%甲醇水溶液制成每 1ml约含16 μ g的溶液，即得；
[0277] 供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取0. 5g，精密称定，置 25ml容量瓶中，加入50%甲醇溶液适量，120W、40曲Z超声处理20min，放冷至室温，加50% 甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液，即得；
[027引测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液10 μ 1，注入高效液相色谱仪，得 到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酪的含量。
【主权项】
1. 一种坤灵丸的检测方法，其特征在于，所述方法包括：坤灵丸的鉴别和含量测定；其 中鉴别方法采用薄层色谱法对坤灵丸的中药组成成分进行鉴别，包括对牡丹皮、当归、川 芎、藁本、延胡索、白芍、红参、香附的鉴别；含量测定方法采用高效液相色谱法对坤灵丸中 有效成分丹皮酚的含量进行测定。2. 根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述鉴别方法，包括对牡丹皮、当归、川 芎、藁本、延胡索、白芍、红参、香附其中一项或多项进行鉴别。3. 根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述鉴别方法，包括对牡丹皮、当归、川 芎、本、延胡索、白芍、红参、香附全部6项进行鉴别。4. 根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述含量测定方法包括以下步骤： ① 供试品溶液的制备：取坤灵丸，粉碎后加入50~70%甲醇溶液中，超声处理后加 50~70%甲醇溶液定容至刻度，过微孔滤膜，即得； ② 对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，加50%~70%甲醇溶液制成每lml含 14~18μg丹皮酚的溶液，艮P得； ③ 含量测定：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各5~10μ1，注入高效液相色谱仪， 得到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酚的含量，必要时可以使用阴性对照品溶液以排除 干扰； 其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以30~60 : 70~40的甲 醇-水为流动相；检测波长为270~278nm;流速0. 6~1. 5ml/min;柱温25~35°C，进样 量5~15μ1 〇5. 根据权利要求3的检测方法，其特征在于， 所述牡丹皮薄层鉴别，步骤如下： 供试品溶液的制备：取坤灵丸薄膜衣丸8g~12g或糖衣丸12~18g，采用研细方式， 加稀盐酸1~4ml，加乙醚20~50ml，加热回流15~40min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渔 加乙酸乙酯1~3ml使溶解，作为供试品溶液； 对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材〇. 8~1. 2g，加稀盐酸1~4ml，加乙醚20~ 50ml，加热回流15~40min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渔加乙酸乙酯1~3ml使溶解，作 为对照药材溶液； 对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，加乙酸乙酯制成每lml含0. 8~1. 2mg的溶 液，摇匀，即得； 阴性样品溶液的制备：按坤灵丸处方配比，取除牡丹皮、白芍外的其他药材，按坤灵丸 的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液； 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液5~10μ1、对照药材溶液、丹皮酚对 照品溶液、阴性样品溶液各5~15μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60~90°C，5~ 3 : 1石油醚-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5%三氯化铁乙醇溶液； 供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无 干扰； 所述当归、川芎、藁本薄层鉴别，步骤如下： 供试品溶液的制备：同牡丹皮供试品溶液的制备方法； 对照药材溶液的制备：分别取当归对照药材、川芎对照药材、藁本对照药材各〇. 8~ 1. 2g，分别加乙醚20~50ml，水浴回流15~40min，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干， 残渣分别加乙酸乙酯1~3ml使溶解，作为当归对照药材溶液，川芎对照药材溶液，藁本对 照药材溶； 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川芎、藁本外的其他药材，按坤灵丸的制 备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液， 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及上述对照药材与阴性样品溶液各5~ 15μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以95~70 :5~30 :1的正己烧-乙酸乙酯-甲酸为 展开剂，展开，取出，晾干，置366nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相 应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰； 所述延胡索薄层鉴别，步骤如下： 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研成细粉，称取1.5~2.5g，加0. 1~0. 3mol/L的 氢氧化钠溶液5~15ml，超声15~25min后，加入乙酸乙酯5~20ml，振摇萃取，2000~ 3000转/min离心3~lOmin，取上清液，即得； 对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材〇. 3~1.Og于20~100ml圆底烧瓶中，加氨水0.3~0.81111浸润，加二氯甲烧5~151111，50°(：~70°(：水浴回流0.5~111，滤过，挥干， 用甲醇1~3ml溶解，即得； 对照品溶液的制备：取延胡索乙素对照品适量，加甲醇制成每lml含0.15~0.25mg的 溶液，作为对照品溶液； 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备坤灵丸的工艺制 备样品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液； 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液与阴性样品溶液各5~ 10μ1、对照品溶液2~10μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以5~8 : 2~5 : 0. 5~ 1.5 : 0.1的正己烷-二氯甲烷-甲醇-浓氨为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏至 斑点显色清晰后取出，挥尽板上吸附的碘后，置366nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在 与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰， 所述白芍薄层鉴别，步骤如下： 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸12~18g或糖衣丸15~20g， 加甲醇30~70ml，加热回流0. 5~lh，滤 过，滤液蒸干，残渔加水15~25ml使溶解，用水 饱和的正丁醇振摇提取2~3次，每次15~25ml，合并正丁醇提取液，用氨试液3~8ml洗 涤，用正丁醇饱和的水洗2~3次，每次10~20ml，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加无水 乙醇1~3ml溶解，作为供试品溶液； 对照品溶液的制备：取芍药苷对照品，加甲醇制成每lml含0. 8~1. 2mg的溶液，作为 对照品洛液； 阴性样品溶液的制备：取除白芍、牡丹皮外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样 品，再按供试品溶液制备方法制成白芍、牡丹皮双阴性样品溶液，结果阴性无干扰； 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各10~20μ1、对照品溶 液5~15μ1，分别点于同一高效??圭胶G薄层板上，以30~45:3~6:5~15:0. 4三氯甲 烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，喷以1%~5%香草醛硫酸溶液，在105°C 加热至斑点显色清晰；供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，显相同颜色的斑 点，阴性样品无干扰， 所述红参薄层鉴别，步骤如下： 供试品溶液的制备：用白芍供试品溶液 对照品溶液的制备：取人参皂苷Rgl、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品适量，加甲醇制 成每lml分别含有人参皂苷Rgl、人参皂苷Rbl、人参皂苷Re各0. 8~1. 2mg的溶液，作为 对照品洛液； 对照药材溶液的制备：取红参对照药材〇. 8~1. 2g，以下操作同供试品溶液处理方法， 作为对照药材溶液； 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备 样品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液； 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各15~20μ1、对照药材溶 液及对照品溶液5~20μ1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以50~70:20~40:5~ 20三氯甲烷-甲醇-水5~10°C以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，喷以5~ 10%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰；供试品色谱图中，在与对照品及对照药 材色谱图相应的位置上，显示相同颜色的斑点，阴性样品无干扰； 所述香附薄层鉴别，步骤如下： 供试品溶液的制备：用牡丹皮供试品溶液； 对照品溶液的制备：取α-香附酮对照品适量，加甲醇制成每lml含有α-香附酮 0. 8~1. 2mg的溶液，作为对照品溶液； 对照药材溶液的制备：取香附对照药材〇. 8~1. 2g，加入稀盐酸1~3ml，加乙醚20~ 40ml回流20~40min，放至室温，滤过，回收溶剂至近干，以乙醇1~3ml复溶，即得； 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按制备工艺制备样品，再 按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液； 鉴别：照薄层色谱法试验，取上述薄膜衣丸供试品溶液10-20μ1、糖衣丸供试品溶液 20-25μ1、对照品溶液1-10μ1和对照药材溶液10-20μ1点于同一高效硅胶G薄层板上， 以85~95 :3~8 :3~8的甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯 下检视，供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷 以二硝基苯肼试液，放置片刻，在日光下观察，在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色 谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。6.根据权利要求5检测方法，其特征在于， 牡丹皮鉴别方法为： 供试品溶液的制备：取坤灵丸薄膜衣丸l〇g或糖衣丸15g，采用研细方式，加稀盐酸 2ml,加乙醚30ml,加热回流30min,滤过，滤液回收溶剂至干，残渔加乙酸乙酯2ml使溶解， 作为供试品溶液； 对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材1. 〇g，加稀盐酸lml，加乙醚30ml，加热回流 30min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为对照药材溶液； 对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，加乙酸乙酯制成每lml含lmg的溶液，摇匀， 即得； 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除牡丹皮、白芍外的其他药材，按坤灵丸的制备 工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液； 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液5~10μ1、对照药材溶液、丹皮酚对照 品溶液、阴性样品溶液各5~15μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60~90°C的3 : 1石 油醚-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5%三氯化铁乙醇溶液；供试品 色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰； 当归、川芎、藁本鉴别 供试品溶液的制备：同牡丹皮供试品溶液的制备； 对照药材溶液的制备：分别取当归对照药材、川芎对照药材、藁本对照药材各l.〇g，分 别加乙醚30ml，水浴回流30min，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干，残渣分别加乙酸乙 酯lml使溶解，作为当归对照药材溶液，川芎对照药材溶液，藁本对照药材溶液； 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川芎、藁本外的其他药材，按坤灵丸的制 备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液， 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及上述对照药材与阴性样品溶液各5~ 15μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以90 :15 :1正己烧-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展 开，取出，晾干，置366nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置 上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰。7.根据权利要求5检测方法，其特征在于， 延胡索鉴别 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研成细粉，称取2g，加0. 2mol/L的氢氧化钠溶液 10ml，超声20min后，加入乙酸乙酯10ml，振摇萃取，3000转/min离心5min，取上清液，即 得； 对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材〇. 5g于50ml圆底烧瓶中，加氨水0. 5ml浸 润，加二氯甲烷l〇ml，60°C水浴回流lh，滤过，挥干，用甲醇2ml溶解，即得； 对照品溶液的制备：取延胡索乙素对照品适量，加甲醇制成每lml含0. 2mg的溶液，作 为对照品洛液； 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备坤灵丸的工艺制 备样品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液； 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液与阴性样品溶液各5~ 10μ1、对照品溶液2~10μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以7. 5 : 4 : 1 : 0. 1的正 己烷-二氯甲烷-甲醇-浓氨为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏至斑点显色清晰后 取出，挥尽板上吸附的碘后，置366nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品及对照 药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰； 白芍鉴别 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸15g或糖衣丸17g，加甲醇 50ml，加热回流lh，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取 3次，每次20ml，合并正丁醇提取液，用氨试液5ml洗涤，用正丁醇饱和的水洗2次，每次 15ml，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加无水乙醇2ml溶解，作为供试品溶液； 对照品溶液的制备：取芍药苷对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶 液； 阴性样品溶液的制备：取除白芍、牡丹皮外的其他药材，按制备坤灵丸的工艺制备样 品，再按供试品溶液制备方法制成白芍、牡丹皮双阴性样品溶液； 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各10~20μ1、对照品溶液 5~15μ1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以40:5:10:0. 4的三氯甲烧-乙酸乙酯-甲 醇-甲酸为展开剂，展开，取出，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105°C加热至斑点显色，供试 品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。8. 根据权利要求5检测方法，其特征在于， 红参鉴别 供试品溶液的制备：用白芍供试品溶液； 对照品溶液的制备：取人参皂苷Rgl、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品适量，加甲醇制 成每lml分别含有人参皂苷Rgl、人参皂苷Rbl、人参皂苷Re各lmg的溶液，作为对照品溶 液； 对照药材溶液的制备：取红参对照药材1. 〇g，以下操作同供试品溶液制备，作为对照 药材溶液； 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备 样品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液； 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各15~20μ1、对照药材 溶液及对照品溶液5~20μ1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以60:30:10的三氯甲 烷-甲醇-水在l〇°C以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，喷以10%硫酸乙醇溶 液，在105°C加热至斑点显色，供试品色谱图中，在与对照品及对照药材色谱图相应的位置 上，显示相同颜色的斑点，阴性样品无干扰； 香附鉴别 供试品溶液的制备：用牡丹皮供试品溶液； 对照品溶液的制备：取α-香附酮对照品适量，加甲醇制成每lml含有α-香附酮lmg的溶液，作为对照品溶液； 对照药材溶液的制备：取香附对照药材lg，加入稀盐酸lml,加乙醚30ml回流30min， 放至室温，滤过，回收溶剂至近干，以乙醇2ml复溶，即得； 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备 样品，再按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液； 鉴别：照薄层色谱法试验，取上述薄膜衣丸供试品溶液10-20μ1、糖衣丸供试品溶液 20-25μ1、对照品溶液1-10μ1和对照药材溶液10-20μ1点于同一高效硅胶G薄层板上， 以92 :5 :5的甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检 视，供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷以二 硝基苯肼试液，放置片刻，在日光下观察，在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相 应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。9. 根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述的丹皮酚含量测定方法为高效液相 色谱法，步骤如下： 高效液相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，具体选自以下规格中的一种： 5μm150X4. 6mm、5ym250X4. 6mm;以30~60 : 70~40的甲醇-水为流动相；检测波 长为270~278nm;流速(λ6~L5ml/min;柱温25~35°C，进样量5~15μ1 ; 对照品溶液的制备取丹皮酚对照品适量，精密称定，加50%~70 %甲醇水溶液制成每lml约含14~18μg的溶液，即得； 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取〇. 4~0. 6g，精密称定， 置10~25ml容量瓶中，加入50~70%甲醇溶液适量，超声功率120W，频率40kHz处理15~ 30min，放冷至室温，加50~70%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0. 45μm微孔滤膜，取续滤 液，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液，注入高效液相色谱仪，得到色谱 图，经计算得到坤灵丸中丹皮酚的含量。10.根据权利要求9的检测方法，其特征在于，步骤如下： 高效液相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂； 以50 : 50甲醇-水为流动相；检测波长为274nm;流速lml/min;柱温30°C，进样量10μ1 ； 对照品溶液的制备取丹皮酚对照品适量，精密称定，加50%甲醇水溶液制成每lml约 含16μg的溶液，即得； 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取〇. 5g，精密称定，置25ml容量瓶中，加入50%甲醇溶液适量，120W、40kHz超声处理20min，放冷至室温，加50%甲醇 溶液定容至刻度，摇匀，过0. 45μm微孔滤膜，取续滤液，即得； 测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，经 计算得到坤灵丸中丹皮酚的含量。
【专利摘要】本发明提供了一种坤灵丸的质量检测方法，所述方法包括：坤灵丸的鉴别和含量测定；其中鉴别方法采用薄层色谱法对坤灵丸的中药组成成分进行鉴别，包括对牡丹皮、当归-川芎-藁本、延胡索、白芍、红参、香附的鉴别；含量测定方法采用高效液相色谱法对坤灵丸中有效成分丹皮酚的含量进行测定，本发明具有方法简便、速度快、重现性好等特点，所建立的鉴别及含量测定方法经方法学验证满足相关要求，适用性强，能够更全面的反映产品质量状况，为质量控制及制定标准提供了重要依据。
【IPC分类】G01N30/02, G01N30/90
【公开号】CN105486763
【申请号】CN201410484061
【发明人】阚红玉, 高展, 孙志翠, 孙玉侠, 曹凤兰, 徐立元, 杨建会, 李建, 杨雪梅, 张淑玉
【申请人】天士力制药集团股份有限公司, 天津天士力（辽宁）制药有限责任公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年9月19日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种坤灵丸的质量检测方法，属于药物分析技术领域。
【背景技术】
[0002] 坤灵丸是一种中药复方制剂，其功能主治为调经养血，逐癒生新。用于月经不调， 或多或少，行经腹痛，子宫寒冷，久不受孕，习惯性流产，赤白带下，崩漏不止，病久气虚，肾 亏腰痛。
[0003] 坤灵丸的处方如下：
[0004] 【处方】
[0005] ( -）香附（制）37g甘草7g白薇14g益母草14g黄茂14g鸡冠花14g麦冬 14g北五味子14g地黄14g红花14g木通lOg白术（炒）14g赤石脂14g巧冬14g厚朴 lOg肉巧蓉（制）14g白巧（酒炒）14g
[0006] (二）香附（制）37g荆芥lOg牡丹皮14g阿胶14g当归14g蔓本lOg红参14g 鹿角胶14g川贝母14g没药（炒）14g砂仁14g延胡索14g小茵香（盐制）14g龟甲胶 14g川写14g
[0007] 【制法】W上处方（一）十走味，加水煎煮二次，第一次3小时，第二次2小时，合并 煎液，滤过，滤液放置24小时，取上清液加入米醋280g，浓缩成稠膏。W上处方（二）十五 味，粉碎成中粉，加入上述稠膏中，混匀，干燥，粉碎成细粉，过筛，混匀，用黄酒泛丸，制成 1800丸，包糖衣或薄膜衣，打光，干燥，即得。
[0008] 由于中药化学成分复杂，作用机制不明确，致使现有中药制药技术难W确保中药 产品质量稳定性，坤灵丸现行标准收载于中华人民共和国卫生部药品标准《中药成方制剂》 第十册，标准中未涉及任何针对药味的定性定量控制项目，发明人对坤灵丸的有效成分进 行了研究。发现其中含有多种水溶性与醇溶性成分，本发明人有针对性的对送些成分进行 了研究，建立了一种坤灵丸的检测方法，对生产中的坤灵丸进行质量监督，W确保产品质 量。
【发明内容】
[0009] 本发明目的在于提供一种坤灵丸的质量检测方法，为该制剂的质量控制提供更完 善的检测方法。
[0010] 本发明所述的质量检测方法，包括鉴别方法和含量测定方法。
[0011] 本发明首先提供一种坤灵丸的鉴别方法，该方法包括对W下中药的鉴别：
[0012] A牡丹皮鉴别
[0013] B当归-川写-蔓本鉴别
[0014] C延胡索鉴别 [001引 D白巧鉴别 [0016] E红参鉴别
[0017] F香附鉴别
[0018] 本发明的鉴别方法采用薄层色谱法，共有6项，可W使用其中一项作为对坤灵丸 的鉴别方法，也可W多项组合使用作为对坤灵丸的鉴别方法，优选的是多项组合使用，最优 选的是6项组合使用。
[0019] 其次，本发明还包括对坤灵丸中的有效成分丹皮酪进行含量测定，含量测定方法 采用高效液相色谱法。
[0020] 本发明的鉴别方法，优选采用W下方法：
[0021] A牡丹皮鉴别
[0022] 供试品溶液的制备；取坤灵丸薄膜衣丸8g~12g、糖衣丸12~18g，采用研细方 式，加稀盐酸1~4ml，加己離20~50ml，加热回流15~40min，滤过，滤液回收溶剂至干， 残渣加己酸己醋1~3ml使溶解，作为供试品溶液。
[0023] 对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材0. 8~1. 2g，加稀盐酸1~4ml，加己離 20~50ml，加热回流15~40min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加己酸己醋1~3ml使溶 解，作为对照药材溶液。
[0024] 对照品溶液的制备；取丹皮酪对照品适量，加己酸己醋制成每1ml含0. 8~1. 2mg 的溶液，摇匀，即得。
[00巧]阴性样品溶液的制备；通过查询文献，白巧中也含有微量的丹皮酪，故按处方配 比，取除牡丹皮、白巧外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成 阴性样品溶液。
[002引鉴别；照薄层色谱法（附录VI B)试验，吸取上述供试品溶液5~10 μ 1、对照药材 溶液、丹皮酪对照品溶液、阴性样品溶液各5~15 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W石 油離化0~9(TC)-己酸己醋巧~3 : 1)为展开剂，展开，取出，瞭干，喷W盐酸酸性5% Η氯化铁己醇溶液（每100ml 5%H氯化铁己醇溶液中，加入盐酸1~5滴，混匀，即得）。 供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无 干扰。见附图（1)。
[0027] B当归-川写-蔓本鉴别
[002引供试品溶液的制备；同牡丹皮供试品溶液的制备。
[0029] 对照药材溶液的制备；分别取当归对照药材、川写对照药材、蔓本对照药材各 0. 8~1. 2g，分别加己離20~50ml，水浴回流15~40min，取出，放冷，滤过，滤液回收己離 至干，残渣分别加己酸己醋1~3ml使溶解，作为当归对照药材溶液，川写对照药材溶液，蔓 本对照药材溶液。
[0030] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川写、蔓本外的其他药材，按制备工 艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。
[0031] 鉴别；照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液及 上述对照药材与阴性样品溶液各5~15 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W正己焼-己 酸己醋-甲酸（95~70:5~30:1)为展开剂，展开，取出，瞭干，置紫外光灯（366nm)下检 视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的英光斑点，阴性样品无 干扰。见附图（2)。
[0032] C延胡索鉴别
[0033] 供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，研成细粉，称取1. 5~2. 5g，加0. 1~0. 3mol/ L的氨氧化钢溶液5~15ml,超声15~25min后，加入己酸己醋5~20ml,振摇萃取，2000~ 3000转/min离必3~lOmin,取上清液，即得。
[0034] 对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材0. 3~1. Og于20~100ml圆底烧瓶中， 加氨水0. 3~0. 8ml浸润，加二氯甲焼5~15ml，5(TC~7(TC水浴回流0. 5~比，滤过，挥 干，用甲醇1~3ml溶解，即得。
[0035] 对照品溶液的制备；取延胡索己素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0. 15~ 0. 25mg的溶液，作为对照品溶液。
[0036] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备工艺制备样 品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液。
[0037] 鉴别；照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录VI B)试验，吸取上述供试品溶 液、对照药材溶液与阴性样品溶液各5~10 μ 1、对照品溶液2~10 μ 1，分别点于同一硅胶 G薄层板上，W正己焼-二氯甲焼-甲醇-浓氨巧~8 : 2~5 : 0.5~1.5 : 0.1)为展 开剂，展开，取出，瞭干，置贿蒸气中熏至斑点显色清晰后取出，挥尽板上吸附的贿后，置紫 外光灯（366nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同 颜色的英光斑点，阴性样品无干扰。见附图（3)。
[0038] D白巧鉴别
[0039] 供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸12~18g(糖衣丸15~ 20g)，加甲醇30~70ml，加热回流0. 5~比，滤过，滤液蒸干，残渣加水15~25ml使溶解， 用水饱和的正了醇振摇提取2~3次，每次15~25ml，合并正了醇提取液，用氨试液3~ 8ml洗涂，用正了醇饱和的水洗2~3次，每次10~20ml，弃去水洗液，正了醇液蒸干，残渣 加无水己醇1~3ml溶解，作为供试品溶液。
[0040] 对照品溶液的制备；取巧药巧对照品，加甲醇制成每1ml含0. 8~1. 2mg的溶液， 作为对照品溶液。
[0041] 阴性样品溶液的制备：通过文献查阅发现，处方中牡丹皮与白巧同属毛畏科植物， 其主要成分中亦含巧药巧，故按处方配比，取除白巧、牡丹皮外的其他药材，按制备工艺制 备样品，再按供试品溶液制备方法制成白巧、牡丹皮双阴性样品溶液，结果阴性无干扰。
[0042] 鉴别；照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液及阴 性样品溶液各10~20 μ 1、对照品溶液5~15 μ 1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，W Η氯甲焼-己酸己醋-甲醇-甲酸（30~45:3~6:5~15:0.4)为展开剂，展开，取出，喷 W 1%~5%香草醒硫酸溶液，在105°C加热至斑点显色清晰。供试品色谱图中，在与对照品 色谱图相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。见附图（4)。
[004引 E红参鉴别
[0044] 供试品溶液的制备；用白巧供试品溶液。
[0045] 对照品溶液的制备；取人参皂巧Rgl、人参皂巧化1、人参皂巧Re对照品适量，加甲 醇制成每1ml分别含有人参皂巧Rgl、人参皂巧化1、人参皂巧Re各0. 8~1. 2mg的溶液， 作为对照品溶液。
[0046] 对照药材溶液的制备：取红参对照药材0. 8~1. 2g，W下操作同供试品溶液处理 方法，作为对照药材溶液。
[0047] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按制备工艺制备样 品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液。
[0048] 鉴别；照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液及阴 性样品溶液各15~20 μ 1、对照药材溶液及对照品溶液5~20 μ 1，分别点于同一高效硅胶 G薄层板（烟台板）上，氯甲焼-甲醇-水巧0~70:20~40:5~20)5~1(TCW下 放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，喷W 5~10%硫酸己醇溶液，在105°C加热至斑 点显色清晰。供试品色谱图中，在与对照品及对照药材色谱图相应的位置上，显示相同颜色 的斑点。阴性样品无干扰。见附图巧）。
[004引 F香附鉴别
[0050] 供试品溶液的制备；用牡丹皮供试品溶液。
[0051] 对照品溶液的制备；取α -香附丽对照品适量，加甲醇制成每1ml含有α -香附丽 0. 8~1. 2mg的溶液，作为对照品溶液。
[0052] 对照药材溶液的制备：取香附对照药材0. 8~1. 2g，加入稀盐酸1~3ml，加己離 20~40ml回流20~40min，放至室温，滤过，回收溶剂至近干，W己醇1~3ml复溶，即得。
[0053] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按制备工艺制备样 品，再按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液。
[0054] 鉴别；照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录VI B)试验，取上述薄膜衣丸供 试品溶液10-20 μ 1、糖衣丸供试品溶液20-25 μ 1、对照品溶液1-10 μ 1和对照药材溶液 10-20 μ 1点于同一高效硅胶G薄层板（Macher巧-Nagel F254高效薄层板）上，W甲苯-己 酸己醋-甲酸（85~95 ;3~8 ;3~8)为展开剂，展开，取出，瞭干，置紫外光灯（254nm)下 检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷W 二硝基苯阱试液，放置片刻，在日光下观察。在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱 相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性样品无干扰。见附图化）。
[0055] 本发明的含量测定方法，所述的丹皮酪含量测定方法，步骤如下：
[0056] ①供试品溶液的制备：取坤灵丸，粉碎后加入50~70%甲醇溶液中，超声处理后 加50~70%甲醇溶液定容至刻度，过微孔滤膜，即得；
[0057] ②对照品溶液的制备；取丹皮酪对照品适量，加50%~70%甲醇溶液制成每1ml 含14~18 μ g丹皮酪的溶液，即得；
[0058] ⑨含量测定；分别吸取对照品溶液与供试品溶液各5~10 μ 1，注入高效液相色谱 仪，得到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酪的含量，必要时可W使用阴性对照品溶液W排 除干扰；
[0059] 其中色谱条件为：W十八烷基娃焼键合硅胶为填充剂为W下填充剂的一种 Shima化U VP-0DS150X4. 6mm 色谱柱、Dikma Diamomsi]_-C185 μ m, 250 X 4. 6mm 色谱柱、 Agilent ZORBAX SB-C185 μ m, 250X4. 6mm，色谱柱及 Waters2695-2489、Waters 2695-PDA; W 30~60 : 70~40的甲醇-水为流动相；检测波长为270~278皿；流速0. 6~1. 5ml/ min;柱温25~35°C，进样量5~15 μ 1。
[0060] 优选的，本发明的含量测定方法如下：
[0061] 对照品溶液的制备取丹皮酪对照品适量，精密称定，加50%~70%甲醇水溶液制 成每1ml约含14~18 μ g的溶液，即得。
[0062] 供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取0. 4~0. 6g，精密称 定，置10~25ml容量瓶中，加入50~70 %甲醇溶液适量，超声（功率120W，频率40曲Z) 处理15~30min，放冷至室温，加50~70%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤 膜，取续滤液，即得。
[0063] 测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、牡丹皮-白巧阴性供试品溶液各 5~10μ 1，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酪的含量。
[0064] 高效液相色谱条件：W十八烷基娃焼键合硅胶为填充剂（Shima化U VP-0DS(150X4. 6mm)，色谱柱、Dikma Diamomsil-C18 巧 μL?，250X4. 6mm)，色谱柱、Agilent ZORBAX SB-C18 巧 μ m, 250 X 4. 6mm)，色谱柱及 Waters2695-2489、Waters 2695-PDA) ; W 甲 醇-水（30~60 : 70~40)为流动相；检测波长为270~278皿；流速0. 6~1. 5ml/min ; 柱温25~35°C，进样量5~15 μ 1。
[0065] 其中优选；高效液相色谱条件；W十八烷基娃焼键合硅胶为填充剂（Agilent Z0RBAX SB-C185 μ m，4. 6 X 250mm) ; W 甲醇-水（30 ~60 : 70 ~40)为流动相；检测波长 为270~278nm ;流速0. 6~1. 5ml/min ;柱温25~35°C，进样量5~15μ 1。
[0066] 最优选，W 50 : 50甲醇-水为流动相；检测波长为274皿；流速Iml/min ;柱温 3(TC，进样量 10μ 1 ;
[0067] 对照品溶液的制备取丹皮酪对照品适量，精密称定，加50%甲醇水溶液制成每 1ml约含16 μ g的溶液，即得；
[006引供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取0. 5g，精密称定，置 25ml容量瓶中，加入50%甲醇溶液适量，120W、40曲Z超声处理20min，放冷至室温，加50% 甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液，即得；
[0069] 测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液10μ 1，注入高效液相色谱仪，得 到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酪的含量。
[0070] 测定结果见图（7)、做、巧）、（10)。结果显示，阴性样品无干扰。
[0071] 本发明含量测定方法的验证：
[0072] 1仪器与试药
[0073] Waters 2695-2489高效液相色谱仪及紫外检测器；Empower液相色谱工作站； Agilent Z0RBAX SB-C18色谱柱巧um，250X4. 6mm);甲醇（色谱纯，天津市康科德科技有 限公司）；水为超纯水（公司自制，Milli曲；对照品；丹皮酪对照品（中国食品药品检定研 究院，批号：110708-200506)。
[0074] 2线性关系考察
[00巧]取丹皮酪对照品适量，精密称定（实际称样量；12. 73mg)，置于100ml容量瓶中， 加50%甲醇溶解，稀释并定容至刻度，摇匀即得对照品母液化1273mg/ml)。将丹皮酪对 照品母液依次稀释得到浓度为 0. 〇636mg/ml、0. 0318mg/ml、0. 0159mg/ml、0. 0080mg/ml、 0. 0040mg/ml、0. 0020mg/ml的对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液及对照品母液各 1〇μ1，注入液相色谱仪中，记录色谱图。W丹皮酪的对照品浓度（mg/ml)为横坐标，丹皮酪 峰面积为纵坐标，求得回归方程巧=48644921. 31X+10376. 05，r = 0. 9999。结果表明丹皮 酪在0. 0020mg/ml~0. 1273mg/ml浓度范围内，线性良好。
[0076] 3精密度试验
[0077] 取坤灵丸样品适量（薄膜衣丸，批号：20121101 ;糖衣丸，批号：20120901),按照 "实施例7"项下方法制备供试品溶液。精密吸取上述两种供试品溶液10 μ 1，连续进样6针， 测得薄膜衣丸峰面积平均值为779400, RSD为0. 47% ;糖衣丸峰面积平均值为867291，RSD 为0. 42%。结果表明，供试品溶液在该色谱条件下进行丹皮酪含量测定时，精密度良好。 [007引 4重复性试验
[0079] 取坤灵丸样品适量（薄膜衣丸，批号：20121101 ;糖衣丸，批号：20120901)，研细， 取0. 5g，精密称定，共6份，照"实施例7"项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取上述供 试品溶液及对照品溶液各1〇μ1，进样分析。记录色谱图，并计算丹皮酪的含量。结果薄膜 衣丸样品中丹皮酪平均含量为0. 8220mg/g，RSD为1. 10% ;糖衣丸样品中丹皮酪平均含量 为0. 8958mg/g，RSD为0. 24%。结果表明，方法的重复性良好。
[0080] 5稳定性试验
[0081] 取坤灵丸样品适量（薄膜衣丸，批号：20121101 ;糖衣丸，批号：20120901),照"实 施例7"项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取上述供试品溶液10 μ 1，分别于0、2、8、12、 16、24h进样分析，计算峰面积的相对平均偏差RSD，薄膜衣丸、糖衣丸RSD分别为0. 66 %、 0. 47%。结果表明供试品溶液在24h内稳定。
[008引 6加样回收率试验
[0083] 取坤灵丸样品适量（薄膜衣丸，批号：20121101 ;糖衣丸，批号：20120901),研细， 取0.25g，精密称定。向已知丹皮酪含量的样品中加入该样品所含丹皮酪含量的80%、 100%、120%的丹皮酪对照品，每个浓度各3份，共9份，按"实施例7"项下供试品溶液制备 方法处理。分别精密吸取上述供试品溶液1〇μ 1，进样分析，记录色谱图，计算回收率，薄膜 衣丸平均回收率为103. 4%，RSD为0. 67% ;糖衣丸平均回收率为102. 2%，RSD为1. 19%。 见表1、表2,结果符合含量测定有关要求，说明该方法准确度良好。
[0084] 表1薄膜衣丸加样回收率试验
[0085]
[0086]
[0087] 注：薄膜衣丸中丹皮酪含量按照重复性项下含量0. 8220mg/g计算。
[008引表2糖衣丸加样回收率试验
[0089]
[0091] 注；糖衣丸中丹皮酪含量按照重复性项下含量0. 8958mg/g计算。
[0092] 7样品测定
[0093] 分别选取坤灵丸样品Η批（薄膜衣丸，批号；20121001、20121101、20130112 ;糖衣 丸，批号；20120901、20120904、20130101)，按"实施例7"项下供试品溶液制备方法处理。分 别精密吸取上述供试品溶液10 μ 1，进样分析，记录色谱图，计算含量，结果见表3、4。
[0094] 表3薄膜衣丸样品测定
[0095]
[0098] 本发明的有益效果在于：
[0099] 本发明中涉及的8味药材的薄层鉴别，除延胡索鉴别需单独处理供试品外，其中 牡丹皮、当归、川写、蔓本、香附5味药材鉴别可采用同一供试品溶液，白巧、红参2味药材鉴 别可采用同一供试品溶液，本方法既节省样品取样量，又节省溶剂、环保经济、污染小。
[0100] 丹皮酪含量测定方法考察中，考虑不同厂家色谱柱及不同实验室的 仪器设施因素，另分别考察了 Shima化U VP-0DS(150X4. 6mm)，色谱柱、Dikma Diamomsil-C18 巧 um, 250X4. 6mm),色谱柱、Agilent Z0RBAX SB-C18 巧 um, 250X4. 6mm), 色谱柱及Waters2695-2489、Waters 2695-PDA高效液相色谱仪的分离情况，结果均满足要 求。
[0101] 本发明所提供的坤灵丸的质量检测方法，是通过大量具体创造性试验筛选后得到 的，鉴别方法中通过对样品处理方法的筛选，展开剂的选择，使得鉴别专属性好，且方法简 便快捷、经济实用、结果快速。含量测定方法中通过对供试品处理方法及色谱条件的考察， 证明本方法具有良好的重复性、稳定性、专属性及耐用性，该含量测定方法可有效的对产品 进行质量分析，保证了该产品的质量稳定性。
【附图说明】
[0102] 图1、从左到右；糖衣丸样品（20120903)、牡丹皮阴性样品、丹皮酪对照品（中检 院）、牡丹皮对照药材（中检院）、薄膜衣丸样品（20120809)、薄膜衣丸样品（20121002)、薄 膜衣丸样品（20121102)、薄膜衣丸样品（20130103);
[0103] 图2、从左到右：薄膜衣丸20121002、薄膜衣20120809、当归对照药材（中检院）、 川写对照药材（中检院）、蔓本对照药材（中检院）、薄膜衣丸20121102、糖衣丸20120903 ;
[0104] 图3、从左到右：薄膜衣丸20121101、薄膜衣丸20130102、薄膜衣丸20121001、薄 膜衣丸20120809、阴性样品、延胡索己素（中检院）、延胡索对照药材（中检院）、糖衣丸 20120903、薄膜衣 20121102、薄膜衣丸 20121002 ;
[0105] 图4、从左到右：薄膜衣丸20130103、薄膜衣丸20121105、薄膜衣丸20121103、巧药 巧对照品（中检院）、双阴性样品、糖衣丸20120901、糖衣丸20120904、糖衣丸20130101 ;
[0106] 图5、从左到右；薄膜衣20130103、薄膜衣丸20121105、薄膜衣丸20121103、红参阴 性、人参皂巧Rgl+人参皂巧化1+人参皂巧Re混合对照品（中检院）、红参对照药材（中检 院）、糖衣丸20120901、糖衣丸20120904、糖衣丸20130101 ;
[0107] 图6、从左到右；香附阴性、香附对照药材（中检院）、薄膜衣丸20130101、糖衣丸 20120901、α-香附丽对照品；
[010引图7、牡丹皮-白巧阴性供试品溶液；
[0109] 图8、丹皮酪对照品溶液；
[0110] 图9、薄膜衣丸供试品溶液；
[01川图10、糖衣丸供试品溶液。
【具体实施方式】
[0112] 下述实施例用于进一步说明但不限于本发明。
[0113] 实施例1牡丹皮鉴别
[0114] 供试品溶液的制备；取坤灵丸素丸lOg，（薄膜衣丸lOg ;含牡丹皮、延胡索、当归、 川写、白巧约为0. 5g ;约含蔓本0. 35g ;糖衣丸15g ;含牡丹皮、延胡索、当归、川写、白巧约 为0. 4g ;约含蔓本0. 3g)，采用研细方式，加稀盐酸2ml，加己離30ml，加热回流30min，滤 过，滤液回收溶剂至干，残渣加己酸己醋2ml使溶解，作为供试品溶液。
[0115] 对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材1. Og，加稀盐酸1ml，加己離30ml，加热 回流30min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加己酸己醋2ml使溶解，作为对照药材溶液。
[0116] 对照品溶液的制备；取丹皮酪对照品适量，加己酸己醋制成每1ml含Img的溶液， 摇匀，即得。
[0117] 阴性样品溶液的制备；通过查询文献，白巧中也含有微量的丹皮酪，故按处方配 比，取除牡丹皮、白巧外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成 阴性样品溶液。
[om] 鉴别；照薄层色谱法（附录VI B)试验，吸取上述供试品溶液5~10 μ 1、对照药材 溶液、丹皮酪对照品溶液、阴性样品溶液各5~15 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W石 油離（60~9(TC)-己酸己醋（3 : 1)为展开剂，展开，取出，瞭干，喷W盐酸酸性5%立氯 化铁己醇溶液（每100ml 5%H氯化铁己醇溶液中，加入盐酸3滴，混匀，即得）。供试品色 谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。见附 图（1)。
[0119] 实施例2当归-川写-蔓本鉴别
[0120] 供试品溶液的制备；同牡丹皮供试品溶液的制备。
[0121] 对照药材溶液的制备；分别取当归对照药材、川写对照药材、蔓本对照药材各 1. Og，分别加己離30ml，水浴回流30 min，取出，放冷，滤过，滤液回收己離至干，残渣分别加 己酸己醋1ml使溶解，作为当归对照药材溶液，川写对照药材溶液，蔓本对照药材溶液。
[0122] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川写、蔓本外的其他药材，按制备工 艺制备样品，再供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。
[0123] 鉴别；照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液及上 述对照药材与阴性样品溶液各5~15 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W正己焼-己酸 己醋-甲酸巧0 ; 15 ;1)为展开剂，展开，取出，瞭干，置紫外光灯（366nm)下检视。供试品色 谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的英光斑点，阴性样品无干扰。见附图 似。
[0124] 实施例3延胡索鉴别
[01巧]供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，研成细粉，称取2g，加0. 2mol/L的氨氧化钢溶 液10ml，超声20min后，加入己酸己醋10ml，振摇萃取，3000转/min离必5min，取上清液， 即得。
[0126] 对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材0. 5g于50ml圆底烧瓶中，加氨水0. 5ml 浸润，加二氯甲焼l〇ml，6(TC水浴回流比，滤过，挥干，用甲醇2ml溶解，即得。
[0127] 对照品溶液的制备；取延胡索己素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0. 2mg的溶 液，作为对照品溶液
[012引阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备工艺制备样 品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液。
[0129] 鉴别；照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录VI B)试验，吸取上述供试品溶 液、对照药材溶液与阴性样品溶液各5~10 μ 1、对照品溶液2~10 μ 1，分别点于同一硅胶 G薄层板上，W正己焼-二氯甲焼-甲醇-浓氨（7.5 : 4 : 1 : 0.1)为展开剂，展开，取 出，瞭干，置贿蒸气中熏至斑点显色清晰后取出，挥尽板上吸附的贿后，置紫外光灯（366nm) 下检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的英光斑 点，阴性样品无干扰。见附图（3)。
[0130] 实施例4白巧鉴别
[0131] 供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸15g(糖衣丸17g)，加甲 醇50ml，加热回流比，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正了醇振摇提 取3次，每次20ml，合并正了醇提取液，用氨试液5ml洗涂，用正了醇饱和的水洗2次，每次 15ml，弃去水洗液，正了醇液蒸干，残渣加无水己醇2ml溶解，作为供试品溶液。
[013引对照品溶液的制备；取巧药巧对照品，加甲醇制成每1ml含Img的溶液，作为对照 品溶液。
[0133] 阴性样品溶液的制备：通过文献查阅发现，处方中牡丹皮与白巧同属毛畏科植物， 其主要成分中亦含巧药巧，故按处方配比，取除白巧、牡丹皮外的其他药材，按制备工艺制 备样品，再按供试品溶液制备方法制成白巧、牡丹皮双阴性样品溶液，结果阴性无干扰。
[0134] 鉴别；照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液及阴 性样品溶液各10~20 μ 1、对照品溶液5~15 μ 1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，W S氯甲焼-己酸己醋-甲醇-甲酸（40:5:10:0.4)为展开剂，展开，取出，喷W 5%香草醒 硫酸溶液，在l〇5°C加热至斑点显色清晰。供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置 上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。见附图（4)。
[0135] 实施例5红参鉴别
[0136] 供试品溶液的制备；用白巧供试品溶液。
[0137] 对照品溶液的制备；取人参皂巧Rgl、人参皂巧化1、人参皂巧Re对照品适量，加甲 醇制成每1ml分别含有人参皂巧Rgl、人参皂巧化1、人参皂巧Re各Img的溶液，作为对照 品溶液。
[013引对照药材溶液的制备：取红参对照药材1. Og，W下操作同供试品溶液制备，作为 对照药材溶液。
[0139] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按制备工艺制备样 品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液。
[0140] 鉴别；照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液及 阴性样品溶液各15~20 μ 1、对照药材溶液及对照品溶液5~20 μ 1，分别点于同一高效娃 胶G薄层板（烟台板）上，氯甲焼-甲醇-水化0:30:10) 1(TCW下放置分层的下层溶 液为展开剂，展开，取出，喷W 10%硫酸己醇溶液，在l〇5°C加热至斑点显色清晰。供试品色 谱图中，在与对照品及对照药材色谱图相应的位置上，显示相同颜色的斑点。阴性样品无干 扰。见附图巧）。
[0141] 实施例6香附鉴别
[0142] 供试品溶液的制备；用牡丹皮供试品溶液。
[0143] 对照品溶液的制备；取α-香附丽对照品适量，加甲醇制成每1ml含有α-香附丽 Img的溶液，作为对照品溶液。
[0144] 对照药材溶液的制备：取香附对照药材Ig，加入稀盐酸1ml，加己離30ml回流 30min，放至室温，滤过，回收溶剂至近干，W己醇2ml复溶，即得。
[0145] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按制备工艺制备样 品，再按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液。
[0146] 鉴别；照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录VI B)试验，取上述薄膜衣丸供 试品溶液10-20 μ 1、糖衣丸供试品溶液20-25 μ 1、对照品溶液1-10 μ 1和对照药材溶液 10-20 μ 1点于同一高效硅胶G薄层板（Macher巧-Nagel F254高效薄层板）上，W甲苯-己 酸己醋-甲酸巧2 ;5 ;5)为展开剂，展开，取出，瞭干，置紫外光灯（254nm)下检视。供试品 色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷W二硝基苯阱试 液，放置片刻，在日光下观察。在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上， 显相同颜色的斑点。阴性样品无干扰。见附图化）。
[0147] 实施例7丹皮酪含量测定
[0148] 高效液相色谱条件：W十八烷基娃焼键合硅胶为填充剂（Agilent Z0RBAX SB-C185um，4. 6X250mm) 甲醇-水巧0 : 50)为流动相；检测波长为274nm;流速1ml/ min ;柱温30°C，进样量10μ 1。
[0149] 对照品溶液的制备；取丹皮酪对照品适量，精密称定，加50%甲醇水溶液制成每 1ml约含16 μ g的溶液，即得。
[0150] 供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取〇.5g，精密称定，置 25ml容量瓶中，加入50%甲醇溶液适量，超声（功率120W，频率40曲Z)处理20min，放冷至 室温，加50%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液，即得。
[0151] 测定法；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μ 1，注入高效液相色谱仪， 得到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酪的含量。见附图（7)~（10)。
[0152] 实施例8
[0153] 坤灵丸的质量检测方法
[0154] 牡丹皮的鉴别
[0155] 供试品溶液的制备；取坤灵丸薄膜衣丸8g或糖衣丸12g，采用研细方式，加稀盐酸 1ml，加己離20ml，加热回流15min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加己酸己醋1ml使溶解， 作为供试品溶液；
[0156] 对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材0. 8g，加稀盐酸1ml，加己離20ml，加热 回流15min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加己酸己醋1ml使溶解，作为对照药材溶液；
[0157] 对照品溶液的制备；取丹皮酪对照品适量，加己酸己醋制成每1ml含0. 8mg的溶 液，摇匀，即得；
[015引阴性样品溶液的制备：按坤灵丸处方配比，取除牡丹皮、白巧外的其他药材，按坤 灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液；
[0159] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液5 μ 1、对照药材溶液、丹皮酪对照 品溶液、阴性样品溶液各5μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W6(TC，5 : 1石油離-己酸 己醋为展开剂，展开，取出，瞭干，喷W盐酸酸性5%H氯化铁己醇溶液；供试品色谱中，在 与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰；
[0160] 当归、川写、蔓本薄层鉴别，步骤如下：
[0161] 供试品溶液的制备；同牡丹皮供试品溶液的制备方法；
[0162] 对照药材溶液的制备；分别取当归对照药材、川写对照药材、蔓本对照药材各 0. 8g，分别加己離20ml，水浴回流15min，取出，放冷，滤过，滤液回收己離至干，残渣分别加 己酸己醋1ml使溶解，作为当归对照药材溶液，川写对照药材溶液，蔓本对照药材溶；
[0163] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川写、蔓本外的其他药材，按坤灵丸 的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液，
[0164] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及上述对照药材与阴性样品溶液各 5 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W 95 ;5 ;1的正己焼-己酸己醋-甲酸为展开剂，展 开，取出，瞭干，置366nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置 上，显相同颜色的英光斑点，阴性样品无干扰；
[0165] 延胡索薄层鉴别，步骤如下：
[0166] 供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，研成细粉，称取1. 5g，加0.1mol/L的氨氧化钢 溶液5ml，超声15min后，加入己酸己醋5ml，振摇萃取，2000转/min离必3min，取上清液， 即得；
[0167] 对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材0. 3g于20ml圆底烧瓶中，加氨水0. 3ml 浸润，加二氯甲焼5ml，5(TC水浴回流0.化，滤过，挥干，用甲醇1ml溶解，即得；
[016引对照品溶液的制备；取延胡索己素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0. 15mg的溶 液，作为对照品溶液；
[0169] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备坤灵丸的工 艺制备样品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液；
[0170] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液与阴性样品溶液各 5μ1、对照品溶液2μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W5 : 2 : 0. 5 : 0. 1的正己焼-二 氯甲焼-甲醇-浓氨为展开剂，展开，取出，瞭干，置贿蒸气中熏至斑点显色清晰后取出，挥 尽板上吸附的贿后，置366nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱 相应的位置上，显相同颜色的英光斑点，阴性样品无干扰，
[0171] 白巧薄层鉴别，步骤如下：
[0172] 供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸12g或糖衣丸15g，加甲 醇30ml，加热回流0.化，滤过，滤液蒸干，残渣加水15ml使溶解，用水饱和的正了醇振摇提 取2次，每次15ml，合并正了醇提取液，用氨试液3ml洗涂，用正了醇饱和的水洗2次，每次 10ml，弃去水洗液，正了醇液蒸干，残渣加无水己醇1ml溶解，作为供试品溶液；
[017引对照品溶液的制备；取巧药巧对照品，加甲醇制成每1ml含0. 8mg的溶液，作为对 照品溶液；
[0174] 阴性样品溶液的制备：取除白巧、牡丹皮外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备 样品，再按供试品溶液制备方法制成白巧、牡丹皮双阴性样品溶液，结果阴性无干扰；
[0175] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各10 μ 1、对照品溶液 5 μ 1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，W 30:3:5:0. 4 Η氯甲焼-己酸己醋-甲醇-甲 酸为展开剂，展开，取出，喷W 1%~5%香草醒硫酸溶液，在105°C加热至斑点显色清晰；供 试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰，
[0176] 红参薄层鉴别，步骤如下：
[0177] 供试品溶液的制备；用白巧供试品溶液
[0178] 对照品溶液的制备；取人参皂巧Rgl、人参皂巧化1、人参皂巧Re对照品适量，加甲 醇制成每1ml分别含有人参皂巧Rgl、人参皂巧化1、人参皂巧Re各0. 8mg的溶液，作为对 照品溶液；
[0179] 对照药材溶液的制备：取红参对照药材0. 8g， W下操作同供试品溶液处理方法， 作为对照药材溶液；
[0180] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺 制备样品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液；
[0181] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各15 μ 1、对照药材溶 液及对照品溶液5 μ 1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，W 50:20:5 Η氯甲焼-甲醇-水 5°CW下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，喷W5%硫酸己醇溶液，在105°C加热 至斑点显色清晰；供试品色谱图中，在与对照品及对照药材色谱图相应的位置上，显示相同 颜色的斑点，阴性样品无干扰；
[0182] 香附薄层鉴别，步骤如下：
[0183] 供试品溶液的制备；用牡丹皮供试品溶液；
[0184] 对照品溶液的制备；取α-香附丽对照品适量，加甲醇制成每1ml含有α-香附丽 0. 8mg的溶液，作为对照品溶液；
[0185] 对照药材溶液的制备：取香附对照药材0.8g，加入稀盐酸1ml，加己離20ml回流 20min，放至室温，滤过，回收溶剂至近干，W己醇1ml复溶，即得；
[0186] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按制备工艺制备样 品，再按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液；
[0187] 鉴别；照薄层色谱法试验，取上述薄膜衣丸供试品溶液10μ 1、糖衣丸供试品溶液 20 μ 1、对照品溶液1 μ 1和对照药材溶液10 μ 1点于同一高效硅胶G薄层板上，W 85 ;3 ;3 的甲苯-己酸己醋-甲酸为展开剂，展开，取出，瞭干，置紫外光灯下检视，供试品色谱中，在 与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷W二硝基苯阱试液，放置片 亥IJ，在日光下观察，在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜 色的斑点，阴性样品无干扰。
[018引 实施例9
[0189] 坤灵丸的质量检测方法
[0190] 牡丹皮的鉴别
[0191] 供试品溶液的制备；取坤灵丸薄膜衣丸12g或糖衣丸18g，采用研细方式，加稀盐 酸4ml，加己離50ml，加热回流40min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加己酸己醋3ml使溶 解，作为供试品溶液；
[0192] 对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材1. 2g，加稀盐酸4ml，加己離50ml，加热 回流40min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加己酸己醋3ml使溶解，作为对照药材溶液；
[0193] 对照品溶液的制备；取丹皮酪对照品适量，加己酸己醋制成每1ml含1. 2mg的溶 液，摇匀，即得；
[0194] 阴性样品溶液的制备：按坤灵丸处方配比，取除牡丹皮、白巧外的其他药材，按坤 灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液；
[0195] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液10 μ 1、对照药材溶液、丹皮酪对 照品溶液、阴性样品溶液各15 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W 9(TC，3 : 1石油離-己 酸己醋为展开剂，展开，取出，瞭干，喷W盐酸酸性5%H氯化铁己醇溶液；供试品色谱中， 在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰；
[0196] 当归、川写、蔓本薄层鉴别，步骤如下：
[0197] 供试品溶液的制备；同牡丹皮供试品溶液的制备方法；
[0198] 对照药材溶液的制备；分别取当归对照药材、川写对照药材、蔓本对照药材各 1. 2g，分别加己離50ml，水浴回流40min，取出，放冷，滤过，滤液回收己離至干，残渣分别加 己酸己醋3ml使溶解，作为当归对照药材溶液，川写对照药材溶液，蔓本对照药材溶；
[0199] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川写、蔓本外的其他药材，按坤灵丸 的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液，
[0200] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及上述对照药材与阴性样品溶液各 15 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W 70 ;30 ;1的正己焼-己酸己醋-甲酸为展开剂， 展开，取出，瞭干，置366nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置 上，显相同颜色的英光斑点，阴性样品无干扰；
[0201] 延胡索薄层鉴别，步骤如下：
[0202] 供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，研成细粉，称取2. 5g，加0. 3mol/L的氨氧化钢 溶液15ml，超声25min后，加入己酸己醋20ml，振摇萃取，3000转/min离必lOmin，取上清 液，即得；
[020引对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材1. Og于100ml圆底烧瓶中，加氨水 0. 8ml浸润，加二氯甲焼15ml，7(TC水浴回流比，滤过，挥干，用甲醇3ml溶解，即得；
[0204] 对照品溶液的制备；取延胡索己素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0. 25mg的溶 液，作为对照品溶液；
[0205] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备坤灵丸的工 艺制备样品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液；
[0206] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液与阴性样品溶液各 10 μ 1、对照品溶液10 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W8 : 5 : 1.5 : 0.1的正己 焼-二氯甲焼-甲醇-浓氨为展开剂，展开，取出，瞭干，置贿蒸气中熏至斑点显色清晰后取 出，挥尽板上吸附的贿后，置366nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品及对照药 材色谱相应的位置上，显相同颜色的英光斑点，阴性样品无干扰，
[0207] 白巧薄层鉴别，步骤如下：
[020引供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸18g或糖衣丸20g，加甲 醇70ml，加热回流比，滤过，滤液蒸干，残渣加水25ml使溶解，用水饱和的正了醇振摇提 取3次，每次25ml，合并正了醇提取液，用氨试液8ml洗涂，用正了醇饱和的水洗3次，每次 20ml，弃去水洗液，正了醇液蒸干，残渣加无水己醇3ml溶解，作为供试品溶液；
[0209] 对照品溶液的制备；取巧药巧对照品，加甲醇制成每1ml含1. 2mg的溶液，作为对 照品溶液；
[0210] 阴性样品溶液的制备：取除白巧、牡丹皮外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备 样品，再按供试品溶液制备方法制成白巧、牡丹皮双阴性样品溶液，结果阴性无干扰；
[0211] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各20 μ 1、对照品溶液 15 μ 1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，W 45:6:15:0. 4 Η氯甲焼-己酸己醋-甲醇-甲 酸为展开剂，展开，取出，喷W 1 %~5%香草醒硫酸溶液，在105°C加热至斑点显色清晰；供 试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰，
[0212] 红参薄层鉴别，步骤如下：
[0213] 供试品溶液的制备；用白巧供试品溶液
[0214] 对照品溶液的制备；取人参皂巧Rgl、人参皂巧化1、人参皂巧Re对照品适量，加甲 醇制成每1ml分别含有人参皂巧Rgl、人参皂巧化1、人参皂巧Re各1. 2mg的溶液，作为对 照品溶液；
[0215] 对照药材溶液的制备：取红参对照药材1. 2g，W下操作同供试品溶液处理方法， 作为对照药材溶液；
[0216] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺 制备样品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液；
[0217] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各20 μ 1、对照药材 溶液及对照品溶液20 μ 1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，W 70:40:20 Η氯甲焼-甲 醇-水1(TCW下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，喷W 10%硫酸己醇溶液，在 l〇5°C加热至斑点显色清晰；供试品色谱图中，在与对照品及对照药材色谱图相应的位置 上，显示相同颜色的斑点，阴性样品无干扰；
[021引香附薄层鉴别，步骤如下：
[0219] 供试品溶液的制备；用牡丹皮供试品溶液；
[0220] 对照品溶液的制备；取α -香附丽对照品适量，加甲醇制成每1ml含有α -香附丽 1. 2mg的溶液，作为对照品溶液；
[0221] 对照药材溶液的制备：取香附对照药材1. 2g，加入稀盐酸3ml，加己離40ml回流 40min，放至室温，滤过，回收溶剂至近干，W己醇3ml复溶，即得；
[0222] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按制备工艺制备样 品，再按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液；
[0223] 鉴别；照薄层色谱法试验，取上述薄膜衣丸供试品溶液20 μ 1、糖衣丸供试品溶液 25 μ 1、对照品溶液10 μ 1和对照药材溶液20 μ 1点于同一高效硅胶G薄层板上，W 95 ;8 ;8 的甲苯-己酸己醋-甲酸为展开剂，展开，取出，瞭干，置紫外光灯下检视，供试品色谱中，在 与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷W二硝基苯阱试液，放置片 亥IJ，在日光下观察，在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜 色的斑点，阴性样品无干扰。
[0224] 实施例10
[0225] 坤灵丸的质量检测方法
[0226] 牡丹皮鉴别方法为：
[0227] 供试品溶液的制备；取坤灵丸薄膜衣丸lOg或糖衣丸15g，采用研细方式，加稀盐 酸2ml，加己離30ml，加热回流30min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加己酸己醋2ml使溶 解，作为供试品溶液；
[022引对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材1. Og，加稀盐酸1ml，加己離30ml，加热 回流30min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加己酸己醋2ml使溶解，作为对照药材溶液；
[0229] 对照品溶液的制备；取丹皮酪对照品适量，加己酸己醋制成每1ml含Img的溶液， 摇匀，即得；
[0230] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除牡丹皮、白巧外的其他药材，按坤灵丸的 制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液；
[0231] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液5~10 μ 1、对照药材溶液、丹皮酪 对照品溶液、阴性样品溶液各5~15 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W 60~9(TC的 3 : 1石油離-己酸己醋为展开剂，展开，取出，瞭干，喷W盐酸酸性5%立氯化铁己醇溶液； 供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无 干扰；
[023引当归、川写、蔓本鉴别
[0233] 供试品溶液的制备；同牡丹皮供试品溶液的制备；
[0234] 对照药材溶液的制备；分别取当归对照药材、川写对照药材、蔓本对照药材各 1. Og，分别加己離30ml，水浴回流30min，取出，放冷，滤过，滤液回收己離至干，残渣分别加 己酸己醋1ml使溶解，作为当归对照药材溶液，川写对照药材溶液，蔓本对照药材溶液；
[0235] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川写、蔓本外的其他药材，按坤灵丸 的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液，
[0236] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及上述对照药材与阴性样品溶液各 5~15 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W 90 ; 15 ;1正己焼-己酸己醋-甲酸为展开剂， 展开，取出，瞭干，置366nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置 上，显相同颜色的英光斑点，阴性样品无干扰。
[0237] 延胡索鉴别
[023引供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，研成细粉，称取2g，加0. 2mol/L的氨氧化钢溶 液10ml，超声20min后，加入己酸己醋10ml，振摇萃取，3000转/min离必5min，取上清液， 即得；
[0239] 对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材0. 5g于50ml圆底烧瓶中，加氨水0. 5ml 浸润，加二氯甲焼10ml，6(TC水浴回流比，滤过，挥干，用甲醇2ml溶解，即得；
[0240] 对照品溶液的制备；取延胡索己素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0. 2mg的溶 液，作为对照品溶液；
[0241] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备坤灵丸的工 艺制备样品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液；
[0242] 鉴别；照薄层色谱法试验 ，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液与阴性样品溶液各 5~10 μ 1、对照品溶液2~10 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W 7. 5 : 4 : 1 : 0. 1 的正己焼-二氯甲焼-甲醇-浓氨为展开剂，展开，取出，瞭干，置贿蒸气中熏至斑点显色清 晰后取出，挥尽板上吸附的贿后，置366nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品及 对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的英光斑点，阴性样品无干扰；
[0243] 白巧鉴别
[0244] 供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸15g或糖衣丸17g，加甲 醇50ml，加热回流比，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正了醇振摇提 取3次，每次20ml，合并正了醇提取液，用氨试液5ml洗涂，用正了醇饱和的水洗2次，每次 15ml，弃去水洗液，正了醇液蒸干，残渣加无水己醇2ml溶解，作为供试品溶液；
[024引对照品溶液的制备；取巧药巧对照品，加甲醇制成每1ml含Img的溶液，作为对照 品溶液；
[0246] 阴性样品溶液的制备：取除白巧、牡丹皮外的其他药材，按制备坤灵丸的工艺制备 样品，再按供试品溶液制备方法制成白巧、牡丹皮双阴性样品溶液；
[0247] 鉴别；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各10~20 μ 1、对照品 溶液5~15 μ 1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，W 40:5:10:0. 4的Η氯甲焼-己酸己 醋-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，喷W 5%香草醒硫酸溶液，在105°C加热至斑点显色， 供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰；
[024引 红参鉴别
[0249] 供试品溶液的制备；用白巧供试品溶液；
[0巧0] 对照品溶液的制备；取人参皂巧Rgl、人参皂巧化1、人参皂巧Re对照品适量，加甲 醇制成每1ml分别含有人参皂巧Rgl、人参皂巧化1、人参皂巧Re各Img的溶液，作为对照 品溶液；
[0251] 对照药材溶液的制备：取红参对照药材1. Og，W下操作同供试品溶液制备，作为 对照药材溶液；
[0252] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺 制备样品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液；
[025引鉴别；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各15~20 μ 1、对照药 材溶液及对照品溶液5~20 μ 1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，W 60:30:10的Η氯甲 焼-甲醇-水在1(TC W下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，喷W 10%硫酸己醇溶 液，在105°C加热至斑点显色，供试品色谱图中，在与对照品及对照药材色谱图相应的位置 上，显示相同颜色的斑点，阴性样品无干扰 [0巧4] 香附鉴别
[0255] 供试品溶液的制备；用牡丹皮供试品溶液；
[0256] 对照品溶液的制备；取α -香附丽对照品适量，加甲醇制成每1ml含有α -香附丽 Img的溶液，作为对照品溶液；
[0巧7] 对照药材溶液的制备：取香附对照药材Ig，加入稀盐酸1ml，加己離30ml回流 30min，放至室温，滤过，回收溶剂至近干，W己醇2ml复溶，即得；
[0巧引阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺 制备样品，再按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液；
[0巧9] 鉴别；照薄层色谱法试验，取上述薄膜衣丸供试品溶液10-20 μ 1、糖衣丸供试品 溶液20-25μ 1、对照品溶液1-10μ 1和对照药材溶液10-20μ 1点于同一高效硅胶G薄层板 上，W 92 ;5 ;5的甲苯-己酸己醋-甲酸为展开剂，展开，取出，瞭干，置254nm紫外光灯下检 视，供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷W二 硝基苯阱试液，放置片刻，在日光下观察，在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相 应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。
[0260] 实施例11
[0261] 丹皮酪含量测定方法为高效液相色谱法，步骤如下：
[0262] 高效液相色谱条件：W十八烷基娃焼键合硅胶为填充剂为化ima化U VP-0DS150X4. 6mm，色谱柱；W 30 : 70的甲醇-水为流动相；检测波长为270皿；流速 0. 6ml/min ;柱温 25°C，进样量 5 μ 1 ;
[0263] 对照品溶液的制备取丹皮酪对照品适量，精密称定，加50%甲醇水溶液制成每 1ml约含14 μ g的溶液，即得；
[0264] 供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取0. 4g，精密称定，置 10ml容量瓶中，加入50%甲醇溶液适量，超声功率120W，频率40曲Z处理15min，放冷至室 温，加50%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液，即得；
[0265] 测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液5 μ 1，注入高效液相色谱仪，得到 色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酪的含量。
[0266] 实施例12
[0267] 丹皮酪含量测定方法为高效液相色谱法，步骤如下：
[026引高效液相色谱条件：W十八烷基娃焼键合硅胶为填充剂为，Dikma DiamomsU-C185um，250X4. 6mm 3色谱柱；W 60 : 40的甲醇-水为流动相；检测波长为 278nm ;流速 1. 5ml/min ;柱温 35°C，进样量 15 μ 1 ;
[0269] 对照品溶液的制备取丹皮酪对照品适量，精密称定，加70%甲醇水溶液制成每 1ml约含18 μ g的溶液，即得；
[0270] 供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取0. 6g，精密称定，置 25ml容量瓶中，加入70%甲醇溶液适量，超声功率120W，频率40曲Z处理30min，放冷至室 温，加70%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液，即得；
[0271] 巧IJ定法；分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液10μ 1，注入高效液相色谱化得 到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酪的含量。
[0272] 实施例13
[0273] 丹皮酪含量测定方法为高效液相色谱法，步骤如下：
[0274] 高效液相色谱条件；W十八烷基娃焼键合硅胶为填充剂，具体为Agilent Z0RBAX SB-C185 μ m,4. 6 X250mm ;
[027引 W 50 : 50甲醇-水为流动相；检测波长为274nm ;流速Iml/min ;柱温3(TC，进样 量 10 μ 1 ;
[0276] 对照品溶液的制备取丹皮酪对照品适量，精密称定，加50%甲醇水溶液制成每 1ml约含16 μ g的溶液，即得；
[0277] 供试品溶液的制备；取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取0. 5g，精密称定，置 25ml容量瓶中，加入50%甲醇溶液适量，120W、40曲Z超声处理20min，放冷至室温，加50% 甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液，即得；
[027引测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液10 μ 1，注入高效液相色谱仪，得 到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酪的含量。
【主权项】
1. 一种坤灵丸的检测方法，其特征在于，所述方法包括：坤灵丸的鉴别和含量测定；其 中鉴别方法采用薄层色谱法对坤灵丸的中药组成成分进行鉴别，包括对牡丹皮、当归、川 芎、藁本、延胡索、白芍、红参、香附的鉴别；含量测定方法采用高效液相色谱法对坤灵丸中 有效成分丹皮酚的含量进行测定。2. 根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述鉴别方法，包括对牡丹皮、当归、川 芎、藁本、延胡索、白芍、红参、香附其中一项或多项进行鉴别。3. 根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述鉴别方法，包括对牡丹皮、当归、川 芎、本、延胡索、白芍、红参、香附全部6项进行鉴别。4. 根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述含量测定方法包括以下步骤： ① 供试品溶液的制备：取坤灵丸，粉碎后加入50~70%甲醇溶液中，超声处理后加 50~70%甲醇溶液定容至刻度，过微孔滤膜，即得； ② 对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，加50%~70%甲醇溶液制成每lml含 14~18μg丹皮酚的溶液，艮P得； ③ 含量测定：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各5~10μ1，注入高效液相色谱仪， 得到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酚的含量，必要时可以使用阴性对照品溶液以排除 干扰； 其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以30~60 : 70~40的甲 醇-水为流动相；检测波长为270~278nm;流速0. 6~1. 5ml/min;柱温25~35°C，进样 量5~15μ1 〇5. 根据权利要求3的检测方法，其特征在于， 所述牡丹皮薄层鉴别，步骤如下： 供试品溶液的制备：取坤灵丸薄膜衣丸8g~12g或糖衣丸12~18g，采用研细方式， 加稀盐酸1~4ml，加乙醚20~50ml，加热回流15~40min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渔 加乙酸乙酯1~3ml使溶解，作为供试品溶液； 对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材〇. 8~1. 2g，加稀盐酸1~4ml，加乙醚20~ 50ml，加热回流15~40min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渔加乙酸乙酯1~3ml使溶解，作 为对照药材溶液； 对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，加乙酸乙酯制成每lml含0. 8~1. 2mg的溶 液，摇匀，即得； 阴性样品溶液的制备：按坤灵丸处方配比，取除牡丹皮、白芍外的其他药材，按坤灵丸 的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液； 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液5~10μ1、对照药材溶液、丹皮酚对 照品溶液、阴性样品溶液各5~15μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60~90°C，5~ 3 : 1石油醚-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5%三氯化铁乙醇溶液； 供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无 干扰； 所述当归、川芎、藁本薄层鉴别，步骤如下： 供试品溶液的制备：同牡丹皮供试品溶液的制备方法； 对照药材溶液的制备：分别取当归对照药材、川芎对照药材、藁本对照药材各〇. 8~ 1. 2g，分别加乙醚20~50ml，水浴回流15~40min，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干， 残渣分别加乙酸乙酯1~3ml使溶解，作为当归对照药材溶液，川芎对照药材溶液，藁本对 照药材溶； 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川芎、藁本外的其他药材，按坤灵丸的制 备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液， 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及上述对照药材与阴性样品溶液各5~ 15μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以95~70 :5~30 :1的正己烧-乙酸乙酯-甲酸为 展开剂，展开，取出，晾干，置366nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相 应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰； 所述延胡索薄层鉴别，步骤如下： 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研成细粉，称取1.5~2.5g，加0. 1~0. 3mol/L的 氢氧化钠溶液5~15ml，超声15~25min后，加入乙酸乙酯5~20ml，振摇萃取，2000~ 3000转/min离心3~lOmin，取上清液，即得； 对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材〇. 3~1.Og于20~100ml圆底烧瓶中，加氨水0.3~0.81111浸润，加二氯甲烧5~151111，50°(：~70°(：水浴回流0.5~111，滤过，挥干， 用甲醇1~3ml溶解，即得； 对照品溶液的制备：取延胡索乙素对照品适量，加甲醇制成每lml含0.15~0.25mg的 溶液，作为对照品溶液； 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备坤灵丸的工艺制 备样品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液； 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液与阴性样品溶液各5~ 10μ1、对照品溶液2~10μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以5~8 : 2~5 : 0. 5~ 1.5 : 0.1的正己烷-二氯甲烷-甲醇-浓氨为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏至 斑点显色清晰后取出，挥尽板上吸附的碘后，置366nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在 与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰， 所述白芍薄层鉴别，步骤如下： 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸12~18g或糖衣丸15~20g， 加甲醇30~70ml，加热回流0. 5~lh，滤 过，滤液蒸干，残渔加水15~25ml使溶解，用水 饱和的正丁醇振摇提取2~3次，每次15~25ml，合并正丁醇提取液，用氨试液3~8ml洗 涤，用正丁醇饱和的水洗2~3次，每次10~20ml，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加无水 乙醇1~3ml溶解，作为供试品溶液； 对照品溶液的制备：取芍药苷对照品，加甲醇制成每lml含0. 8~1. 2mg的溶液，作为 对照品洛液； 阴性样品溶液的制备：取除白芍、牡丹皮外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样 品，再按供试品溶液制备方法制成白芍、牡丹皮双阴性样品溶液，结果阴性无干扰； 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各10~20μ1、对照品溶 液5~15μ1，分别点于同一高效??圭胶G薄层板上，以30~45:3~6:5~15:0. 4三氯甲 烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，喷以1%~5%香草醛硫酸溶液，在105°C 加热至斑点显色清晰；供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，显相同颜色的斑 点，阴性样品无干扰， 所述红参薄层鉴别，步骤如下： 供试品溶液的制备：用白芍供试品溶液 对照品溶液的制备：取人参皂苷Rgl、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品适量，加甲醇制 成每lml分别含有人参皂苷Rgl、人参皂苷Rbl、人参皂苷Re各0. 8~1. 2mg的溶液，作为 对照品洛液； 对照药材溶液的制备：取红参对照药材〇. 8~1. 2g，以下操作同供试品溶液处理方法， 作为对照药材溶液； 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备 样品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液； 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各15~20μ1、对照药材溶 液及对照品溶液5~20μ1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以50~70:20~40:5~ 20三氯甲烷-甲醇-水5~10°C以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，喷以5~ 10%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰；供试品色谱图中，在与对照品及对照药 材色谱图相应的位置上，显示相同颜色的斑点，阴性样品无干扰； 所述香附薄层鉴别，步骤如下： 供试品溶液的制备：用牡丹皮供试品溶液； 对照品溶液的制备：取α-香附酮对照品适量，加甲醇制成每lml含有α-香附酮 0. 8~1. 2mg的溶液，作为对照品溶液； 对照药材溶液的制备：取香附对照药材〇. 8~1. 2g，加入稀盐酸1~3ml，加乙醚20~ 40ml回流20~40min，放至室温，滤过，回收溶剂至近干，以乙醇1~3ml复溶，即得； 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按制备工艺制备样品，再 按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液； 鉴别：照薄层色谱法试验，取上述薄膜衣丸供试品溶液10-20μ1、糖衣丸供试品溶液 20-25μ1、对照品溶液1-10μ1和对照药材溶液10-20μ1点于同一高效硅胶G薄层板上， 以85~95 :3~8 :3~8的甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯 下检视，供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷 以二硝基苯肼试液，放置片刻，在日光下观察，在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色 谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。6.根据权利要求5检测方法，其特征在于， 牡丹皮鉴别方法为： 供试品溶液的制备：取坤灵丸薄膜衣丸l〇g或糖衣丸15g，采用研细方式，加稀盐酸 2ml,加乙醚30ml,加热回流30min,滤过，滤液回收溶剂至干，残渔加乙酸乙酯2ml使溶解， 作为供试品溶液； 对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材1. 〇g，加稀盐酸lml，加乙醚30ml，加热回流 30min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为对照药材溶液； 对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，加乙酸乙酯制成每lml含lmg的溶液，摇匀， 即得； 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除牡丹皮、白芍外的其他药材，按坤灵丸的制备 工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液； 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液5~10μ1、对照药材溶液、丹皮酚对照 品溶液、阴性样品溶液各5~15μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60~90°C的3 : 1石 油醚-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5%三氯化铁乙醇溶液；供试品 色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰； 当归、川芎、藁本鉴别 供试品溶液的制备：同牡丹皮供试品溶液的制备； 对照药材溶液的制备：分别取当归对照药材、川芎对照药材、藁本对照药材各l.〇g，分 别加乙醚30ml，水浴回流30min，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干，残渣分别加乙酸乙 酯lml使溶解，作为当归对照药材溶液，川芎对照药材溶液，藁本对照药材溶液； 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川芎、藁本外的其他药材，按坤灵丸的制 备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液， 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及上述对照药材与阴性样品溶液各5~ 15μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以90 :15 :1正己烧-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展 开，取出，晾干，置366nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置 上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰。7.根据权利要求5检测方法，其特征在于， 延胡索鉴别 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研成细粉，称取2g，加0. 2mol/L的氢氧化钠溶液 10ml，超声20min后，加入乙酸乙酯10ml，振摇萃取，3000转/min离心5min，取上清液，即 得； 对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材〇. 5g于50ml圆底烧瓶中，加氨水0. 5ml浸 润，加二氯甲烷l〇ml，60°C水浴回流lh，滤过，挥干，用甲醇2ml溶解，即得； 对照品溶液的制备：取延胡索乙素对照品适量，加甲醇制成每lml含0. 2mg的溶液，作 为对照品洛液； 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备坤灵丸的工艺制 备样品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液； 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液与阴性样品溶液各5~ 10μ1、对照品溶液2~10μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以7. 5 : 4 : 1 : 0. 1的正 己烷-二氯甲烷-甲醇-浓氨为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏至斑点显色清晰后 取出，挥尽板上吸附的碘后，置366nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品及对照 药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰； 白芍鉴别 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸15g或糖衣丸17g，加甲醇 50ml，加热回流lh，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取 3次，每次20ml，合并正丁醇提取液，用氨试液5ml洗涤，用正丁醇饱和的水洗2次，每次 15ml，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加无水乙醇2ml溶解，作为供试品溶液； 对照品溶液的制备：取芍药苷对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶 液； 阴性样品溶液的制备：取除白芍、牡丹皮外的其他药材，按制备坤灵丸的工艺制备样 品，再按供试品溶液制备方法制成白芍、牡丹皮双阴性样品溶液； 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各10~20μ1、对照品溶液 5~15μ1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以40:5:10:0. 4的三氯甲烧-乙酸乙酯-甲 醇-甲酸为展开剂，展开，取出，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105°C加热至斑点显色，供试 品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。8. 根据权利要求5检测方法，其特征在于， 红参鉴别 供试品溶液的制备：用白芍供试品溶液； 对照品溶液的制备：取人参皂苷Rgl、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品适量，加甲醇制 成每lml分别含有人参皂苷Rgl、人参皂苷Rbl、人参皂苷Re各lmg的溶液，作为对照品溶 液； 对照药材溶液的制备：取红参对照药材1. 〇g，以下操作同供试品溶液制备，作为对照 药材溶液； 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备 样品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液； 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各15~20μ1、对照药材 溶液及对照品溶液5~20μ1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以60:30:10的三氯甲 烷-甲醇-水在l〇°C以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，喷以10%硫酸乙醇溶 液，在105°C加热至斑点显色，供试品色谱图中，在与对照品及对照药材色谱图相应的位置 上，显示相同颜色的斑点，阴性样品无干扰； 香附鉴别 供试品溶液的制备：用牡丹皮供试品溶液； 对照品溶液的制备：取α-香附酮对照品适量，加甲醇制成每lml含有α-香附酮lmg的溶液，作为对照品溶液； 对照药材溶液的制备：取香附对照药材lg，加入稀盐酸lml,加乙醚30ml回流30min， 放至室温，滤过，回收溶剂至近干，以乙醇2ml复溶，即得； 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备 样品，再按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液； 鉴别：照薄层色谱法试验，取上述薄膜衣丸供试品溶液10-20μ1、糖衣丸供试品溶液 20-25μ1、对照品溶液1-10μ1和对照药材溶液10-20μ1点于同一高效硅胶G薄层板上， 以92 :5 :5的甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检 视，供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷以二 硝基苯肼试液，放置片刻，在日光下观察，在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相 应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。9. 根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述的丹皮酚含量测定方法为高效液相 色谱法，步骤如下： 高效液相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，具体选自以下规格中的一种： 5μm150X4. 6mm、5ym250X4. 6mm;以30~60 : 70~40的甲醇-水为流动相；检测波 长为270~278nm;流速(λ6~L5ml/min;柱温25~35°C，进样量5~15μ1 ; 对照品溶液的制备取丹皮酚对照品适量，精密称定，加50%~70 %甲醇水溶液制成每lml约含14~18μg的溶液，即得； 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取〇. 4~0. 6g，精密称定， 置10~25ml容量瓶中，加入50~70%甲醇溶液适量，超声功率120W，频率40kHz处理15~ 30min，放冷至室温，加50~70%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0. 45μm微孔滤膜，取续滤 液，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液，注入高效液相色谱仪，得到色谱 图，经计算得到坤灵丸中丹皮酚的含量。10.根据权利要求9的检测方法，其特征在于，步骤如下： 高效液相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂； 以50 : 50甲醇-水为流动相；检测波长为274nm;流速lml/min;柱温30°C，进样量10μ1 ； 对照品溶液的制备取丹皮酚对照品适量，精密称定，加50%甲醇水溶液制成每lml约 含16μg的溶液，即得； 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取〇. 5g，精密称定，置25ml容量瓶中，加入50%甲醇溶液适量，120W、40kHz超声处理20min，放冷至室温，加50%甲醇 溶液定容至刻度，摇匀，过0. 45μm微孔滤膜，取续滤液，即得； 测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，经 计算得到坤灵丸中丹皮酚的含量。
【专利摘要】本发明提供了一种坤灵丸的质量检测方法，所述方法包括：坤灵丸的鉴别和含量测定；其中鉴别方法采用薄层色谱法对坤灵丸的中药组成成分进行鉴别，包括对牡丹皮、当归-川芎-藁本、延胡索、白芍、红参、香附的鉴别；含量测定方法采用高效液相色谱法对坤灵丸中有效成分丹皮酚的含量进行测定，本发明具有方法简便、速度快、重现性好等特点，所建立的鉴别及含量测定方法经方法学验证满足相关要求，适用性强，能够更全面的反映产品质量状况，为质量控制及制定标准提供了重要依据。
【IPC分类】G01N30/02, G01N30/90
【公开号】CN105486763
【申请号】CN201410484061
【发明人】阚红玉, 高展, 孙志翠, 孙玉侠, 曹凤兰, 徐立元, 杨建会, 李建, 杨雪梅, 张淑玉
【申请人】天士力制药集团股份有限公司, 天津天士力（辽宁）制药有限责任公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年9月19日
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