一种坤灵丸的气相指纹图谱的分析方法及其应用
一种坤灵丸的气相指纹图谱的分析方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种坤灵丸的气相指纹图谱分析方法，属于药物分析技术领域。
【背景技术】
[0002] 坤灵丸是一种中药复方制剂，其功能主治为调经养血，逐癒生新。用于月经不调， 或多或少，行经腹痛，子宫寒冷，久不受孕，习惯性流产，赤白带下，崩漏不止，病久气虚，肾 亏腰痛。
[0003] 坤灵丸的处方如下：
[0004] 【处方】
[0005] ( -）香附（制）37g甘草7g白薇14g益母草14g黄茂14g鸡冠花14g麦冬 14g北五味子14g地黄14g红花14g木通lOg白术（炒）14g赤石脂14g巧冬14g厚朴 lOg肉巧蓉（制）14g白巧（酒炒）14g
[0006] (二）香附（制）37g荆芥lOg牡丹皮14g阿胶14g当归14g蔓本lOg红参14g 鹿角胶14g川贝母14g没药（炒）14g砂仁14g延胡索14g小茵香（盐制）14g龟甲胶 14g川写14g
[0007] 【制法】W上处方（一）十走味，加水煎煮二次，第一次3小时，第二次2小时，合并 煎液，滤过，滤液放置24小时，取上清液加入米醋280g，浓缩成稠膏。W上处方（二）十五 味，粉碎成中粉，加入上述稠膏中，混匀，干燥，粉碎成细粉，过筛，混匀，用黄酒泛丸，制成 1800丸，包糖衣或薄膜衣，打光，干燥，即得。
[0008] 由于中药化学成分复杂，作用机制不明确，致使现有中药制药技术难W确保中药 产品质量稳定性，中药指纹图谱建立的可W全面反映中药内在化学成分的种类与数量，进 而反映中药的质量。现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确，采用中药指纹图谱的方式， 将有效地表征中药质量。指纹图谱已为国际社会所认可，有利于中药及产品进入国际市场。
[0009] 坤灵丸现行标准收载于中华人民共和国卫生部药品标准《中药成方制剂》第十册， 标准中未涉及任何针对药味的定性定量控制项目，目前，没有对坤灵丸进行指纹图谱研究 的报道，而指纹图谱能充分表征中药制剂的整体性和复杂性，因此发明人对坤灵丸的有效 成分进行了研究。发现其中含有多种水溶性与醇溶性成分，本发明人有针对性的对送些成 分进行了研究，建立了一种坤灵丸的标准指纹图谱，利用该图谱对生产中的坤灵丸进行质 量监督，W确保产品质量。
【发明内容】
：
[0010] 本发明提供一种坤灵丸气相色谱标准对照指纹图谱，其建立方法如下：
[0011] 1)供试品溶液制备：
[0012] 取坤灵丸，加水，超声提取，提取液加己酸己醋萃取，萃取液己酸己醋层加己酸己 醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，既得；
[0013] 2)获得气相色谱图：
[0014] 供试品溶液气相色谱仪，得到气相色谱图；
[0015] 3)生成对照指纹图谱
[0016] 选择合格的多批坤灵丸样品的气相指纹图谱中确定了 10个共有峰，利用中药色 谱指纹图谱相似度评价系统（2. 0版），拟合确定坤灵丸对照指纹图谱。
[0017] 根据需要可W加入有效成分的标准对照品W作为参照物峰。
[001引其中气相色谱的色谱条件如下：
[0019] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30m X0. 25mm X0. 25 μ m)。柱温；程序升温条件见表1 ;进样口温度：150~200。检id器： FID;温度；230~28(TC;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1~5 : 1;进样量；0. 5~ 1 μ 1。
[0020] 表1程序升温表
[0021]
[00巧]其中，优选的标准对照指纹图谱的建立方法如下：
[002引1)供试品溶液的制备，方法如下：
[0027] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取0. 8~1. 2g，加水20~ 3〇111以超声处理20~40min，加己酸己醋萃取2次，第1次10~20ml，第2次5~15ml，合 并萃取液至15~35ml容量瓶中，加己酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，即 得；
[0028] 优选，取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取1. Og，加水25mU超声 处理30min，加己酸己醋萃取2次，第一次15ml，第二次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中， 摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，即得。
[0029] 2)获得气相色谱图：
[0030] 供试品溶液气相色谱仪，得到气相色谱图；
[0031] 其中W丹皮酪作为参照物制备标准对照品溶液，方法如下：
[003引取丹皮酪对照品适量，加己酸己醋制成每1血含10~15 μ g的溶液，作为对照品 溶液，优取丹皮酪对照品适量，加己酸己醋制成每ImL含对丹皮酪约12. 55 μ g的溶液，即 得。
[003引扣生成对照指纹图谱，方法如下：
[0034] 将供试品溶液和对照品溶液注入气相色谱仪，得到色谱图，
[0035] 对多批批坤灵丸的气相指纹图谱进行分析比较，确定了 10个共有峰，色谱图中， 与丹皮酪对照品峰保留时间相同的色谱参照峰为5号峰，计算其它9个共有峰的相对保 留时间分别为；〇. 365 (1)、0. 372 (2)、0. 769 (3)、0. 772 (4)、1. 000 巧）、1. 263 化）、1. 283 (7)、 1. 359 (8)、1. 395巧）、1. 565 (10)，其相对偏差均在± 3 % W内，利用中药色谱指纹图谱相似 度评价系统（2. 0版），拟合确定得到坤灵丸标准对照气相指纹图谱。
[0036] 本发明还提供一种坤灵丸的气相色谱指纹图谱检测方法，其特征在于，包括如下 步骤
[0037] 1)待测样品色谱图的制备：
[003引取坤灵丸，加水，超声提取，提取液加己酸己醋萃取，萃取液己酸己醋层加己酸己 醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，取滤液，注入气相色谱仪，得到色谱图；
[0039] 2)待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
[0040] 将待测样品的色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版"软件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度；
[0041] 其中气相色谱的色谱条件如下：
[0042] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30m X0. 25mm X0. 25 μ m)。柱温；程序升温条件见表1 ;进样口温度：150~200。检id器： FID;温度；230~28(TC;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1~5 : 1;进样量；0. 5~ 1 μ 1。
[0043] 表1程序升温表
[0044]
[0047] 其中，优选的本发明的检测方法如下：
[0048] 1)待测样品色谱图的制备：
[0049] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取0. 8~1. 2g，加水20~ 3〇111以超声处理20~40min，加己酸己醋萃取2次，第1次10~20ml，第2次5~15ml，合 并萃取液至15~35ml容量瓶中，加己酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，取滤 液，注入气相色谱仪，得到色谱图；
[0050] 优选，取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取1. Og，加水25mU超声 处理30min，加己酸己醋萃取2次，第一次15ml，第二次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中， 摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，即得。
[0051] 2)待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
[0052] 将待测样品的色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版"软件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度；相似度为0. 90 W上为合格， 相似度为0. 95 W上为相符，相似度为0. 98 W上为相同。
[0053] 本发明通过W上指纹图谱的建立，进一步的确立了坤灵丸的分析方法，采用该方 法可W隹确辨别坤灵丸，根据和标准指纹图谱的比较，得出鉴别结论，越和标准指纹图谱接 近，产品质量越好，相似度可W使用计算机方法确认，如相似度为0. 90 W上为合格，相似度 为0. 95 W上为相符，相似度为0. 98 W上为相同。
[0054] 上述方法特别是坤灵丸的标准对照气相指纹图谱的制备方法是经过筛选获得的， W下为筛选过程：
[005引 1仪器与试药
[0056] 仪器；美国 Agilent7890A, Agilent Open LAB Control Panel 工作站。
[0057] 色谱柱；①非极性柱，固定相W 5%苯基95%二甲基聚娃氧焼为填料，Agilent HP-5(30mX0. 32mmX0. 25μπ〇 ;
[005引②中极性柱，固定相W 14%氯丙基-苯基86%二甲基聚娃氧焼为填料，Agilent DB-1701 (30mX 0. 25mmX 0. 25 μ m)。
[005引⑨中极性柱，固定相50 %二苯基50 %二甲基聚娃氧焼，Agilent DB-17 (30mX 0. 25mmXO. 15 μ m)
[0060] 试剂；己酸己醋（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）；水为超纯水。
[0061] 对照品；丹皮酪（中国药品生物制品检定所，批号：110708-200506,含量测定用）； α-香附丽（中国食品药品检定研究院，批号：110748-201111,含量测定用）；和厚朴酪（中 国食品药品检定研究院，批号；110730-201011，含量测定化按98. 4%纯度计）
[006引样品；坤灵丸（天津天±力（迂宁）巧喊有限责任公司），共11化具体批号见表 3，均经质检中必检验合格。
[006引表3样品信息表
[0064]
[0065] 2气相色谱条件的选择
[0066] 2. 1色谱柱的选择
[0067] 因坤灵丸包括糖衣丸和薄膜衣丸两种规格，且糖衣丸糖衣剂增重比例较大（约 40% )，故方法考察时首先采用素丸（批号：20130209)样品进行，待条件基本确定后再针对 糖衣丸和薄膜衣丸进行方法学考察。
[0068] 参照相关文献，考察不同极性毛细管柱进行试验，结果3种不同极性毛细管柱分 离得到的色谱峰个数及峰形基本一致，（见图1~3)，但其中色谱柱②的色谱峰峰形较好， 故使用色谱柱②进行程序升温条件的考察。
[0069] 2. 2程序升温条件的选择
[0070] 使用色谱柱②对程序升温条件进行考察调整，在保证出峰完全的情况下，尽可能 缩短分析时长。结果在调整了 30余次程序升温条件后，确定在此程序升温条件（见表2-1) 下，共分离出约11个色谱峰，分析时间总长为55min，见图4。
[0071] 表2-1程序升温表
[0072]
[0073] 3气相色谱条件的确定
[0074] 综上分析，最终确定坤灵丸气相指纹图谱色谱条件如下：
[00巧]色谱柱；固定相W 14%氯丙基-苯基86%二甲基聚娃氧焼为填料，Agilent DB-1701(30mX0. 25mmX0. 25um)。柱温；程序升温条件见表1 ;进样口温度；18(TC ;检测 器；FID ;温度；25(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1进样量；1 μ L。
[0076] 表1程序升温表
[0077]
[0078]
[0079] 4供试品处理方法的选择
[0080] 4. 1首先采用糖衣丸进行提取溶剂的选择：
[0081] ①取糖衣丸适量，研成细粉，精密称取7g (与素丸折算），加己酸己醋25mU超声处 理30min，离必取上清液，浓缩至干，残渣加己酸己醋复溶并定容至5ml，摇匀，过0. 45 μ m微 孔滤膜，即得。
[0082] ②取糖衣丸适量，研成细粉，精密称取7g (与素丸折算），加环己焼25mU超声处理 30min，离必取上清液，浓缩至干，残渣加环己焼复溶并定容至5ml，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤 膜，即得。
[0083] ⑨取糖衣丸适量，研成细粉，精密称取7g，加水25血，超声处理30min，加环己焼萃 取2次，每次20ml，合并萃取液回收至干，残渣加环己焼复溶，并定容至5ml容量瓶中，摇匀， 过0.45 μ m微孔滤膜，即得。
[0084] ④取糖衣丸适量，研成细粉，精密称取7g，加水25血，超声处理30min，加己酸己醋 萃取2次，每次20ml，合并萃取液回收至干，残渣加己酸己醋复溶，并定容至5ml容量瓶中， 摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，即得。
[0085] 结果见图5~图8,由图可W看出，采用供试品处理方法④即水提己酸己醋萃取得 到的色谱图信息最多，故确定采用供试品处理方法④，继续考察。
[0086] 4. 2根据上述考察结果，采用糖衣丸进行提取方式的选择，即供试品处理方法⑤ 取糖衣丸适量，研成细粉，精密称取7g，加水25mL，加热回流30min，加己酸己醋萃取2次， 每次20ml，合并萃取液回收至干，残渣加己酸己醋复溶，并定容至5ml容量瓶中，摇匀，过 0.45 μ m微孔滤膜，即得。
[0087] 结果见图9,由图可W看出，除保留时间在lOmin之前的3个色谱峰明显变大外，其 余色谱峰均明显变小，故考虑气相指纹图谱信息的整体性及供试品操作的简便性，选择供 试品处理方法④。
[0088] 4. 3采用上述供试品处理方法④，进行糖衣丸方法学考察过程中，出现气相进样针 弯折的现象，仔细观察发现是气相进样针针芯及针筒部分抽动极为粘涩造成的，分析可能 原因为糖衣丸包衣剂用量较大（约占整丸的40% )，且包括藏糖，再加上样品为水提己酸己 醋萃取，在样品中则很有可能引入少量的水溶性成分，如藏糖等，使得进样后采用仅己酸己 醋洗针不够彻底，造成进样针进样次数较多之后出现一定的粘涩现象。
[0089] 考虑上述原因后，则决定将糖衣丸去除糖衣后重新进行供试品处理方法考察，且 在仪器灵敏度允许条件下尽可能降低样品浓度。
[0090] ⑧取糖衣丸适量，除去糖衣，研成细粉，精密称取4g，加水25mU超声处理30min， 加己酸己醋萃取2次，每次20ml，合并萃取液回收至干，残渣加己酸己醋复溶，并定容至5ml 容量瓶中，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，即得。
[0091] ⑦取糖衣丸适量，除去糖衣，研成细粉，精密称取Ig，加水25血，超声处理30min， 加己酸己醋萃取2次，第一次15ml，第二次10ml，合并萃取液至化ml容量瓶中，摇匀，过 0. 22 μ m微孔滤膜，即得。
[0092] ⑨取薄膜衣丸适量，研成细粉，精密称取Ig，加水25血，超声处理30min，加己酸己 醋萃取2次，第一次15ml，第二次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中，摇匀，过0. 22 μ m微 孔滤膜，即得。
[0093] 结果供试品处理方法⑧得到的样品在多次进样后，仍出现了进样针粘涩的现象， 故舍弃。
[0094] 供试品处理方法⑦、⑨因样品浓度较低，故在样品进样后进样针较为顺滑，未出现 粘涩现象，初步确定采用该方法，进行方法学考察。供试品处理方法⑦、⑨的典型色谱图见 图 10,图，11。
[0095] 5供试品处理方法的确定
[0096] 取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取l.Og，加水25111以超声处理 30min，加己酸己醋萃取2次，第一次15ml，第二次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中，摇 匀，过0.22 μ m微孔滤膜，即得。
[0097] 6化学成分定性分析及参照峰的选择
[0098] 为进一步明确坤灵丸中所含成分，采用对照品保留时间对比及GC-MS定性法考 察坤灵丸中可能含有的化学成分。通过对比样品与对照品之间的保留时间及GC-MS中 NIST8. 0谱库对比，在该色谱条件下，在样品中可W定位的化学成分有丹皮酪、α -香附丽， 色谱图中丹皮酪的含量最高，且为产品中含量测定项的指标成分，故选择丹皮酪为参照峰。 详见图12,图13。
[0099] 丹皮酪对照品溶液的制备；取丹皮酪对照品适量，精密称定，加己酸己醋制成每 1血含对丹皮酪约12. 55 μ g的溶液，即得。
[0100] 7坤灵丸气相指纹图谱试验的方法学验证
[0101] 7.1重复性试验
[010引取同一批坤灵丸（薄膜衣丸批号：20130102 ;糖衣丸批号：20130101)，按"5"项下 操作，平行制备6份供试品，采用"3"项下色谱条件，进行分析。
[0103] W丹皮酪的保留时间和峰面积为1，计算其它各共有指纹峰的相对保留时间 巧.Rt)及相对峰面积化A)的比值。结果见表7-1~表7-2。结果重复性良好。
[0104] 表7-1薄膜衣丸重复性相对保留时间、相对峰面积数据表
[0105]
[0106] 表7-2糖衣丸重复性相对保留时间、相对峰面积数据表
[0107]
[01 ο引 7. 2精密度试验
[0109] 取同一批坤灵丸（薄膜衣丸批号：20130102 ;糖衣丸批号：20130101)，按"5"项下 操作，制备1份供试品连续进样6次，采用"3"项下色谱条件，进行分析。
[0110] W丹皮酪的保留时间和峰面积为1，计算其它各共有指纹峰的相对保留时间 巧.Rt)及相对峰面积化A)的比值。结果见表7-3~表7-4。结果除4号峰因未达到基线 分离相对峰面积精密度> 5%外，其余各峰相对保留时间及相对峰面积均精密度良好。
[0111] 表7-3薄膜衣丸精密度相对保留时间、相对峰面积数据表
[0112]
[0113] 表7-4糖衣丸精密度相对保留时间、相对峰面积数据表
[0114]
[0115] 7. 3稳定性试验
[0116] 取同一批坤灵丸（薄膜衣丸批号：20130102 ;糖衣丸批号：20130101),按"5"项下 操作，制备1份供试品于0、2、4、6、8、10、12、14、17、20、2他分别进样，采用"3"项下色谱条 件，进行分析。
[0117] W丹皮酪的保留时间和峰面积为1，计算其它各共有指纹峰的相对保留时间 巧.Rt)及相对峰面积化A)的比值。结果见表7-5~表7-6。结果各峰相对保留时间及相 对峰面积1?50均<5%外，表明2他内样品稳定性良好。< br>[om] 表7-5薄膜衣丸稳定性相对保留时间、相对峰面积数据表 [0119]
[0122]
[0123] 8气相指纹图谱方法分析
[0124] 按W上确定的坤灵丸供试品处理方法及色谱条件，随机选取10批坤灵丸按"5"项 下操作，采用"3"项下色谱条件，进行分析。8. 1对照气相指纹图谱的建立
[0125] 选取坤灵丸薄膜衣丸7批、糖衣丸3批，按"5"项下操作，采用"3"项下色谱条件 下进行测定，根据10批坤灵丸供试品气相图谱所给出的相关参数，坤灵丸测定所得的主要 色谱峰均在45分钟内出现。比较薄膜衣丸、糖衣丸10批样品的色谱图及空白溶剂色谱图 发现有10个色谱峰是各批共有的，见图14。
[0126] 另将10批样品中10个共有峰的相对保留时间进行分析，W 5丹皮酪为参照峰，计 算其它9个共有峰的相对保留时间，则11批样品的共有峰平均相对保留时间（峰号）依 次为；0. 365 (1)、0. 372 (2)、0. 769 (3)、0. 772 (4)、1. 000 巧）、1. 263 (6)、1. 283 (7)、1. 359 (8)、 1. 395巧）、1. 565(10)，其相对偏差均在±3% W内。见表8-1。
[0127] 表8-110批样品相对保留时间数据表 [012 引
[0129] 8. 2对照气相指纹图谱的拟合
[0130] W上述10批样品的指纹图谱中10个峰为共有峰，利用中药色谱指纹图谱相似度 评价系统（2. 0版），拟合确定坤灵丸对照气相指纹图谱，见图15
[0131] 8. 3指纹图谱的标准限定
[0132] 根据W上考察结果，确定坤灵丸的气相指纹图谱相似度在0. 90 W上即为合格。
[0133] 本发明的有益效果在于：
[0134] 本发明通过尝试多种色谱条件及供试品处理方法，最终确定了程序升温法对坤灵 丸进行气相指纹图谱分析的色谱条件，考察确定了 10个共有峰的对照气相指纹图谱，方法 简便、快速、重复性好，经方法学验证满足相关要求。
[0135] 应用本发明建立的一种坤灵丸的气相指纹图谱分析方法，对10批样品进行了气 相指纹图谱分析，结果与对照指纹图谱进行比对计算相似度均在0. 90 W上，表明本发明建 立的该方法适用于产品的质量控制要求。
[0136] 本发明建立的一种坤灵丸的气相指纹图谱分析方法适用性强，能够更全面反映产 品的质量状况。
【附图说明】
[0137] 图UHP-5毛细管色谱柱色谱图
[013引 图2、DB-1701毛细管色谱柱色谱图
[0139] 图3、DB-17毛细管色谱柱色谱图
[0140] 图4、DB-1701毛细管色谱柱色谱图
[0141] 图5、供试品处理方法①色谱图
[0142] 图6、供试品处理方法②色谱图
[0143] 图7、供试品处理方法⑨色谱图
[0144] 图8、供试品处理方法④色谱图
[0145] 图9、供试品处理方法⑤色谱图
[0146] 图10、供试品处理方法⑦糖衣丸色谱图
[0147] 图11、供试品处理方法⑨薄膜衣丸色谱图 [014引图12、丹皮酪分子离子峰图
[0149] 图13、香附丽分子离子峰图
[0150] 图14、10批样品共有峰比较图
[0151] 图15、坤灵丸拟合对照指纹图谱
【具体实施方式】：
[0152] W下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
[0153] 实施例1，坤灵丸的气相指纹图谱测定
[0154] 取坤灵丸糖衣丸，批号为20120901
[0155] 步骤1，供试品溶液的制备
[0156] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取l.Og，加水25111以超声处理 30min，加己酸己醋萃取2次，第1次15ml，第2次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中，加己 酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，即得。
[0157] 步骤2,气相指纹图谱的建立
[0158] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程序升温条件见下表；进样口温度：18(TC ;检id器；FID ; 温度；25(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1 ;进样量；1 μ 1。
[0159] 程序升温表
[0160]
[0161]
[0162] 在此条件下分析供试品溶液，得到待测坤灵丸的指纹图谱。
[0163] 实施例2,坤灵丸气相指纹图谱测定
[0164] 取坤灵丸薄膜衣丸，批号20120809
[0165] 步骤1，供试品溶液的制备
[0166] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取l.Og，加水25111以超声处理 30min，加己酸己醋萃取2次，第1次15ml，第2次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中，加己 酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，即得。
[0167] 步骤2,气相指纹图谱的建立
[0168] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程序升温条件见下表；进样口温度：18(TC ;检id器；FID ; 温度；25(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1 ;进样量；1 μ 1。
[0169] 程序升温表
[0170]
[0171] 在此条件下分析供试品溶液，得到待测坤灵丸的指纹图谱。
[0172] 实施例3,坤灵丸气相指纹图谱测定
[0173] 取坤灵丸糖衣丸，批号20120903
[0174] 步骤1，供试品溶液的制备
[0Π 5] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取l.Og，加水25111以超声处理 30min，加己酸己醋萃取2次，第1次15ml，第2次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中，加己 酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，即得。
[0176] 步骤2,气相指纹图谱的建立
[0177] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程序升温条件见下表；进样口温度：18(TC ;检id器；FID ; 温度；25(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1 ;进样量；1 μ 1。
[0178] 程序升温表
[0179]
[0180] 在此条件下分析供试品溶液，得到待测坤灵丸的指纹图谱。
[0181] 实施例4,坤灵丸气相指纹图谱测定
[0182] 色谱条件变更为：
[0183] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程序升温条件见下表；进样口温度：18(TC ;检id器；FID ; 温度；25(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1 ;进样量；1 μ 1。
[0184] 程序升温表
[0185]
[0186] 在此条件下分析供试品溶液，得到待测坤灵丸的指纹图谱。
[0187] 实施例6,坤灵丸的气相指纹图谱测定 [018引取坤灵丸糖衣丸，批号为20120901
[0189] 步骤1，供试品溶液的制备
[0190] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取0. 8g，加水20mL，超声处理 20min，加己酸己醋萃取2次，第1次10ml，第2次5ml，合并萃取液至15ml容量瓶中，加己 酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 2 μ m微孔滤膜，即得。
[0191] 步骤2,气相指纹图谱的建立
[0192] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程序升温条件见下表；进样口温度：15(TC ;检id器；FID ; 温度；23(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1 ;进样量；0. 5μ 1。
[0193] 程序升温表
[0194]
[0195] 在此条件下分析供试品溶液，得到待测坤灵丸的指纹图谱。
[0196] 实施例7,坤灵丸的气相指纹图谱测定
[0197] 取坤灵丸糖衣丸，批号为20120901
[019引步骤1，供试品溶液的制备
[0199] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取1. 2g，加水30mL，超声处理 40min，加己酸己醋萃取2次，第1次20ml，第2次15ml，合并萃取液至35ml容量瓶中，加己 酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，即得。
[0200] 步骤2,气相指纹图谱的建立
[0201] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程序升温条 件见下表；进样口温度；20(TC ;检id器；FID ; 温度；25(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；5 : 1 ;进样量；1 μ 1。
[0202] 程序升温表
[0203]
[0204] 在此条件下分析供试品溶液，得到待测坤灵丸的指纹图谱。
[0205] 实施例8,坤灵丸的气相指纹图谱测定
[0206] 取坤灵丸糖衣丸，批号为20120903
[0207] 步骤1，供试品溶液的制备
[020引取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取1. Og，加水25mL，超声处理 30min，加己酸己醋萃取2次，第1次15ml，第2次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中，加己 酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，即得。
[0209] 步骤2,气相指纹图谱的建立
[0210] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料， (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程序升温条件见下表；进样口温度：18(TC ;检id器；FID ; 温度；25(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1 ;进样量；1 μ 1。
[0211] 程序升温表
[0212]
[0213] 在此条件下分析供试品溶液，得到待测坤灵丸的指纹图谱。
[0214] 实施例9,坤灵丸的气相指纹图谱测定
[0215] 取坤灵丸糖衣丸，批号为20120901
[0216] 步骤1，供试品溶液的制备
[0217] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取1. Og，加水25mL，超声处理 30min，加己酸己醋萃取2次，第1次15ml，第2次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中，加己 酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，即得。
[021引步骤2,气相指纹图谱的建立
[0219] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程序升温条件见下表；进样口温度：18(TC ;检id器；FID ; 温度；25(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1 ;进样量；1 μ 1。
[0220] 程序升温表
[0221]
[0222]
[0223] 在此条件下分析供试品溶液，得到待测坤灵丸的指纹图谱。
[0224] 实施例10,标准坤灵丸对照气相指纹图谱的制备 [022引1)供试品溶液的制备，方法如下：
[0226] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取l.Og，加水25111以超声处理 30min，加己酸己醋萃取2次，第1次15ml，第2次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中，加己 酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，即得。
[0227] 2)对照品溶液的制备，方法如下：
[022引取丹皮酪对照品，加己酸己醋制成每ImL含12. 5μ g的溶液，作为参照物对照品溶 液。
[0229] 3)指纹图谱的确定，方法如下：
[0230] 将供试品溶液和对照品溶液注入气相色谱仪，得到色谱图，
[0231] 其中气相色谱的色谱条件如下：
[0232] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程序升温条件见下表；进样口温度：18(TC ;检id器；FID ; 温度；25(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1 ;进样量；1 μ 1。
[0233] 表1程序升温表
[0234]
[0235] 对11批坤灵丸（薄膜衣丸7批、糖衣丸4批）的气相指纹图谱进行分析比较，确 定了 10个共有峰，色谱图中，与丹皮酪对照品峰保留时间相同的色谱峰为5号峰，计算其它 9个共有峰的相对保留时间分别为；0. 365(1)、0. 372(2)、0. 769(3)、0. 772(4)、1. 000巧）、 1. 263(6)、1. 283(7)、1. 359(8)、1. 395 巧）、1. 565 (10)，各峰的相对保留时间在 ±3% W 内， 利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2. 0版），拟合确定得到坤灵丸标准对照气相指纹 图谱。
[0236] 实施例11，标准坤灵丸对照气相指纹图谱的制备
[0237] 1)供试品溶液的制备，方法如下：
[0238] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取，0. 8g，加水20mL，超声处理 20min，加己酸己醋萃取2次，第1次10ml，第2次5ml，合并萃取液至15ml容量瓶中，加己 酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 2 μ m微孔滤膜，即得。
[023引。对照品溶液的制备，方法如下：
[0240] 取丹皮酪对照品，加己酸己醋制成每ImL含10μ g的溶液，作为参照物对照品溶 液。
[0241] 3)指纹图谱的确定，方法如下：
[0242] 将供试品溶液和对照品溶液注入气相色谱仪，得到色谱图，
[0243] 其中气相色谱的色谱条件如下：
[0244] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程序升温条件见下表；进样口温度：15(TC ;检id器；FID ; 温度；23(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1 ;进样量；0. 5μ 1。
[0245] 表1程序升温表
[0246]
[0247] 对11批坤灵丸（薄膜衣丸7批、糖衣丸4批）的气相指纹图谱进行分析比较，确 定了 10个共有峰，色谱图中，与丹皮酪对照品峰保留时间相同的色谱峰为5号峰，计算其它 9个共有峰的相对保留时间分别为；0. 365(1)、0. 372(2)、0. 769(3)、0. 772(4)、1. 000巧）、 1. 263(6)、1. 283(7)、1. 359(8)、1. 395 巧）、1. 565 (10)，各峰的相对保留时间在 ±3% W 内， 利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2. 0版），拟合确定得到坤灵丸标准对照气相指纹 图谱。
[024引实施例12,标准坤灵丸对照气相指纹图谱的制备 [024引 1)供试品溶液的制备，方法如下：
[0巧0] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取1. 2g，加水30mL，超声处理 40min，加己酸己醋萃取2次，第1次20ml，第2次15ml，合并萃取液至35ml容量瓶中，加己 酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 3 μ m微孔滤膜，即得。
[0巧1] 2)对照品溶液的制备，方法如下：
[0巧引取丹皮酪对照品，加己酸己醋制成每ImL含15μ g的溶液，作为参照物对照品溶 液。
[0巧3] 3)指纹图谱的确定，方法如下：
[0254] 将供试品溶液和对照品溶液注入气相色谱仪，得到色谱图，
[0255] 其中气相色谱的色谱条件如下：
[0256] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程序升温条件见下表；进样口温度；20(TC ;检id器；FID ; 温度；28(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；5 : 1 ;进样量；1 μ 1。
[0巧7] 表1程序升温表
[0巧引
[0259] 对11批坤灵丸（薄膜衣丸7批、糖衣丸4批）的气相指纹图谱进行分析比较，确 定了 10个共有峰，色谱图中，与丹皮酪对照品峰保留时间相同的色谱峰为5号峰，计算其它 9个共有峰的相对保留时间分别为；0. 365(1)、0. 372(2)、0. 769(3)、0. 772(4)、1. 000巧）、 1. 263(6)、1. 283(7)、1. 359(8)、1. 395 巧）、1. 565 (10)，各峰的相对保留时间在 ±3% W 内， 利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2. 0版），拟合确定得到坤灵丸标准对照气相指纹 图谱。
[0260] 实施例13
[0261] 步骤1，坤灵丸标准气相指纹图谱的制备，方法如下：
[026引1)供试品溶液的制备，方法如下：
[0263] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取l.Og，加水25111以超声处理 30min，加己酸己醋萃取2次，第1次15ml，第2次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中，加己 酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，即得；
[0264] 。对照品溶液的制备，方法如下：
[0265] 取丹皮酪对照品，加己酸己醋制成每1血含12. 5μ g的溶液，作为参照物对照品溶 液。
[026引扣指纹图谱的确定，方法如下：
[0267] 将供试品溶液和对照品溶液注入气相色谱仪，得到色谱图，
[026引其中气相色谱的色谱条件如下：
[0269] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程 序升温条件见下表；进样口温度：18(TC ;检id器；FID ; 温度；25(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1 ;进样量；1 μ 1。
[0270] 表1程序升温表
[0271]
[0272] 对11批坤灵丸（薄膜衣丸7批、糖衣丸4批）的气相指纹图谱进行分析比较，确 定了 10个共有峰，色谱图中，与丹皮酪对照品峰保留时间相同的色谱峰为5号峰，计算其它 9个共有峰的相对保留时间分别为；0. 365(1)、0. 372(2)、0. 769(3)、0. 772(4)、1. 000巧）、 1. 263(6)、1. 283(7)、1. 359(8)、1. 395 巧）、1. 565 (10)，各峰的相对保留时间在 ±3% W 内， 利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2. 0版），拟合确定得到坤灵丸标准对照气相指纹 图谱。
[0273] 待测坤灵丸气相指纹图谱的制备方法，步骤如下：
[0274] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取l.Og，加水25111以超声处理 30min，加己酸己醋萃取2次，第1次15ml，第2次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中，加 己酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，即得；将溶液注入气相色谱仪，得到色谱 图。
[0275] 其中气相色谱的色谱条件如下：
[0276] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料， (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程序升温条件见下表；进样口温度：18(TC ;检id器；FID ; 温度；25(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1 ;进样量；1 μ 1。
[0277] 表1程序升温表
[0278]
[0279] 步骤3,将步骤1和步骤2得到的坤灵丸气相指纹图谱比较，相似度为0. 90 W上 为合格。
【主权项】
1. 一种坤灵丸气相色谱标准对照指纹图谱，其建立方法如下： 1) 供试品洛液制备： 取坤灵丸，加水，超声提取，提取液加乙酸乙酯萃取，萃取液取乙酸乙酯层，加乙酸乙酯 定容至刻度，摇匀，过微孔滤膜，既得； 2) 获得气相色谱图： 将供试品溶液进气相色谱仪，得到气相色谱图； 3) 生成对照指纹图谱 选择合格的多批坤灵丸样品的气相指纹图谱中确定共有峰，利用中药色谱指纹图谱相 似度评价系统，确定坤灵丸对照指纹图谱，根据需要可以加入有效成分的标准对照品以作 为参照物峰， 其中气相色谱的色谱条件如下： 色谱柱：固定相以14%氰丙基-苯基86 %二甲基聚硅氧烷为填料，柱温：程序升温条 件见下表；进样口温度：150~200°C ;检测器：FID ;温度：230~280°C ;载气：氮气；分流进 样；分流比：1 : 1~5 : 1 ;进样量：0. 5~1 μ 1 ; 程序升温表 初始温度cC 升溢速举CMn 升至温度D 保持时间取tn: ~6(1. ............ ............. i,Q: - 15-·2δ 90-110 --I ............. 3-8 ITQ--IiO 2~4 ° - 3--.8 UIO ~2 K) 4~8 - 3~S 2? ~260 8-102. 根据权利要求1所述的气相色谱标准对照指纹图谱，其建立方法如下： 1)供试品溶液的制备，方法如下： 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取〇. 8~I. 2g，加水20~30mL，超 声处理20~40min，加乙酸乙酯萃取2次,第1次10~20ml，第2次5~15ml，合并萃取 液至15~35ml容量瓶中，加乙酸乙酯定容至刻度，摇匀，过0. 2-0. 3 μ m微孔滤膜，即得；2) 获得气相色谱图： 以丹皮酚作为参照物制备标准对照品溶液，方法为：取丹皮酚对照品适量，加乙酸乙 酯制成每ImL含10~15 μ g的溶液，作为对照品溶液； 将供试品溶液和对照品溶液注入气相色谱仪，得到色谱图，其中色谱条件为：色谱柱 固定相以14%氰丙基-苯基86%二甲基聚硅氧烷为填料；柱温：见程序升温条件表；进样 口温度：180°C ;检测器：FID ;温度：250°C ;载气：氮气；分流进样；分流比：1 : 1 ;进样量： luL； 3)生成对照指纹图谱 对十批以上坤灵丸的气相指纹图谱进行分析比较，确定10个共有峰，色谱图中，以与 丹皮酚对照品峰保留时间相同的色谱峰为参照，计算其它9个共有峰的相对保留时间分别 为：0· 365、0· 372、0· 769、0· 772、L 000、L 263、L 283、L 359、L 395、L 565,其相对偏差均为 ±3%，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，拟合确定得到坤灵丸标准对照气相指纹图 谱。3. 根据权利要求1所述的气相色谱标准对照指纹图谱，其1)供试品溶液的制备方法如 下： 取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取I. 〇g，加水25mL，超声处理 30min，加乙酸乙酯萃取2次，第一次15ml，第二次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中，摇 匀，过0.22 μ m微孔滤膜，即得。4. 根据权利要求2所述的气相色谱标准对照指纹图谱，其2)丹皮酚对照品溶液的制 备方法为：取丹皮酚对照品适量，精密称定，加乙酸乙酯制成每ImL含对丹皮酚约12. 55 μ g 的溶液，即得。5. 根据权利要求1所述的气相色谱标准对照指纹图谱，其中程序升温表为： 初始温度'C 升温速率Γ/fnin 升至温度Γ 保持时间min 40 ............. ............ O -- 20 IOO 2 -- 5 .180 3 。 ............ δ 2&0 5 S 260 106. -种坤灵丸的气相色谱指纹图谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 待测样品色谱图的制备： 取坤灵丸，加水，超声提取，提取液加乙酸乙酯萃取，萃取液取乙酸乙酯层，加乙酸乙酯 定容至刻度，摇匀，过微孔滤膜，取滤液，注入气相色谱仪，得到色谱图； 2) 待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算： 将待测样品的色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版"软 件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度； 其中气相色谱的色谱条件如下： 色谱柱：固定相以14%氰丙基-苯基86 %二甲基聚硅氧烷为填料，柱温：程序升温条 件见下表；进样口温度：150~200°C ;检测器：FID ;温度：230~280°C ;载气：氮气；分流进 样；分流比：1 : 1~5 : 1 ;进样量：0. 5~1 μ 1 ; 程序升温表 初始温度cC 升溢速举CMn 升至温度D 保持时间取tn: ·，'? (). - 15-·2δ 90-110 2~4. O ............. 3 ~8 170 ~190 ~4 - 3~8 190~2i() 4~8 -:? ~8 24? ~260 8-107. 根据权利要求6的气相色谱指纹图谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 待测样品色谱图的制备： 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取0. 8~I. 2g，加水20~30mL，超 声处理20~40min，加乙酸乙酯萃取2次,第1次10~20ml，第2次5~15ml，合并萃取液 至15~35ml容量瓶中，加乙酸乙酯定容至刻度，摇匀，过微孔滤膜，取滤液，注入气相色谱 仪，得到色谱图； 2) 待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算： 将待测样品的色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版"软 件比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度。8. 根据权利要求6的气相色谱指纹图谱检测方法，其特征在于，其中步骤1)待测样品 色谱图的制备，方法如下： 取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取I. 〇g，加水25mL，超声处理 30min，加乙酸乙酯萃取2次，第一次15ml，第二次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中，摇 匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，取滤液，注入气相色谱仪，得到色谱图。9. 根据权利要求6的气相色谱指纹图谱检测方法，其特征在于，程序升温表为： 初始温.度"C 升温速率t/min 升至温度Γ 保持时间社η 人·? O1 20 100 2 -- 5 180 3 -- § 200： δ - S mo IO ο
【专利摘要】本发明提供了一种坤灵丸的气相指纹图谱分析方法，所述方法包括：坤灵丸标准气相指纹图谱的建立、待测坤灵丸气相指纹图谱的测定和相似性比较判定等步骤。本发明通过尝试多种程序升温条件，最终确定了坤灵丸的气相指纹图谱分析的色谱条件，考察确定了10个共有峰的对照气相指纹图谱，具有方法简便、速度快、重现性好等特点。所建立的标准气相指纹图谱经方法学验证满足相关要求，适用性强，能够更全面的反映产品质量状况，为质量控制及制定标准提供了重要依据。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/02
【公开号】CN105486764
【申请号】CN201410484066
【发明人】阚红玉, 孙志翠, 刘海涛, 孙玉侠, 曹凤兰, 徐立元, 杨建会, 李建, 杨雪梅, 张淑玉
【申请人】天士力制药集团股份有限公司, 天津天士力（辽宁）制药有限责任公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年9月19日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种坤灵丸的气相指纹图谱分析方法，属于药物分析技术领域。
【背景技术】
[0002] 坤灵丸是一种中药复方制剂，其功能主治为调经养血，逐癒生新。用于月经不调， 或多或少，行经腹痛，子宫寒冷，久不受孕，习惯性流产，赤白带下，崩漏不止，病久气虚，肾 亏腰痛。
[0003] 坤灵丸的处方如下：
[0004] 【处方】
[0005] ( -）香附（制）37g甘草7g白薇14g益母草14g黄茂14g鸡冠花14g麦冬 14g北五味子14g地黄14g红花14g木通lOg白术（炒）14g赤石脂14g巧冬14g厚朴 lOg肉巧蓉（制）14g白巧（酒炒）14g
[0006] (二）香附（制）37g荆芥lOg牡丹皮14g阿胶14g当归14g蔓本lOg红参14g 鹿角胶14g川贝母14g没药（炒）14g砂仁14g延胡索14g小茵香（盐制）14g龟甲胶 14g川写14g
[0007] 【制法】W上处方（一）十走味，加水煎煮二次，第一次3小时，第二次2小时，合并 煎液，滤过，滤液放置24小时，取上清液加入米醋280g，浓缩成稠膏。W上处方（二）十五 味，粉碎成中粉，加入上述稠膏中，混匀，干燥，粉碎成细粉，过筛，混匀，用黄酒泛丸，制成 1800丸，包糖衣或薄膜衣，打光，干燥，即得。
[0008] 由于中药化学成分复杂，作用机制不明确，致使现有中药制药技术难W确保中药 产品质量稳定性，中药指纹图谱建立的可W全面反映中药内在化学成分的种类与数量，进 而反映中药的质量。现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确，采用中药指纹图谱的方式， 将有效地表征中药质量。指纹图谱已为国际社会所认可，有利于中药及产品进入国际市场。
[0009] 坤灵丸现行标准收载于中华人民共和国卫生部药品标准《中药成方制剂》第十册， 标准中未涉及任何针对药味的定性定量控制项目，目前，没有对坤灵丸进行指纹图谱研究 的报道，而指纹图谱能充分表征中药制剂的整体性和复杂性，因此发明人对坤灵丸的有效 成分进行了研究。发现其中含有多种水溶性与醇溶性成分，本发明人有针对性的对送些成 分进行了研究，建立了一种坤灵丸的标准指纹图谱，利用该图谱对生产中的坤灵丸进行质 量监督，W确保产品质量。
【发明内容】
：
[0010] 本发明提供一种坤灵丸气相色谱标准对照指纹图谱，其建立方法如下：
[0011] 1)供试品溶液制备：
[0012] 取坤灵丸，加水，超声提取，提取液加己酸己醋萃取，萃取液己酸己醋层加己酸己 醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，既得；
[0013] 2)获得气相色谱图：
[0014] 供试品溶液气相色谱仪，得到气相色谱图；
[0015] 3)生成对照指纹图谱
[0016] 选择合格的多批坤灵丸样品的气相指纹图谱中确定了 10个共有峰，利用中药色 谱指纹图谱相似度评价系统（2. 0版），拟合确定坤灵丸对照指纹图谱。
[0017] 根据需要可W加入有效成分的标准对照品W作为参照物峰。
[001引其中气相色谱的色谱条件如下：
[0019] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30m X0. 25mm X0. 25 μ m)。柱温；程序升温条件见表1 ;进样口温度：150~200。检id器： FID;温度；230~28(TC;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1~5 : 1;进样量；0. 5~ 1 μ 1。
[0020] 表1程序升温表
[0021]
[00巧]其中，优选的标准对照指纹图谱的建立方法如下：
[002引1)供试品溶液的制备，方法如下：
[0027] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取0. 8~1. 2g，加水20~ 3〇111以超声处理20~40min，加己酸己醋萃取2次，第1次10~20ml，第2次5~15ml，合 并萃取液至15~35ml容量瓶中，加己酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，即 得；
[0028] 优选，取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取1. Og，加水25mU超声 处理30min，加己酸己醋萃取2次，第一次15ml，第二次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中， 摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，即得。
[0029] 2)获得气相色谱图：
[0030] 供试品溶液气相色谱仪，得到气相色谱图；
[0031] 其中W丹皮酪作为参照物制备标准对照品溶液，方法如下：
[003引取丹皮酪对照品适量，加己酸己醋制成每1血含10~15 μ g的溶液，作为对照品 溶液，优取丹皮酪对照品适量，加己酸己醋制成每ImL含对丹皮酪约12. 55 μ g的溶液，即 得。
[003引扣生成对照指纹图谱，方法如下：
[0034] 将供试品溶液和对照品溶液注入气相色谱仪，得到色谱图，
[0035] 对多批批坤灵丸的气相指纹图谱进行分析比较，确定了 10个共有峰，色谱图中， 与丹皮酪对照品峰保留时间相同的色谱参照峰为5号峰，计算其它9个共有峰的相对保 留时间分别为；〇. 365 (1)、0. 372 (2)、0. 769 (3)、0. 772 (4)、1. 000 巧）、1. 263 化）、1. 283 (7)、 1. 359 (8)、1. 395巧）、1. 565 (10)，其相对偏差均在± 3 % W内，利用中药色谱指纹图谱相似 度评价系统（2. 0版），拟合确定得到坤灵丸标准对照气相指纹图谱。
[0036] 本发明还提供一种坤灵丸的气相色谱指纹图谱检测方法，其特征在于，包括如下 步骤
[0037] 1)待测样品色谱图的制备：
[003引取坤灵丸，加水，超声提取，提取液加己酸己醋萃取，萃取液己酸己醋层加己酸己 醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，取滤液，注入气相色谱仪，得到色谱图；
[0039] 2)待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
[0040] 将待测样品的色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版"软件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度；
[0041] 其中气相色谱的色谱条件如下：
[0042] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30m X0. 25mm X0. 25 μ m)。柱温；程序升温条件见表1 ;进样口温度：150~200。检id器： FID;温度；230~28(TC;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1~5 : 1;进样量；0. 5~ 1 μ 1。
[0043] 表1程序升温表
[0044]
[0047] 其中，优选的本发明的检测方法如下：
[0048] 1)待测样品色谱图的制备：
[0049] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取0. 8~1. 2g，加水20~ 3〇111以超声处理20~40min，加己酸己醋萃取2次，第1次10~20ml，第2次5~15ml，合 并萃取液至15~35ml容量瓶中，加己酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，取滤 液，注入气相色谱仪，得到色谱图；
[0050] 优选，取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取1. Og，加水25mU超声 处理30min，加己酸己醋萃取2次，第一次15ml，第二次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中， 摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，即得。
[0051] 2)待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
[0052] 将待测样品的色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版"软件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度；相似度为0. 90 W上为合格， 相似度为0. 95 W上为相符，相似度为0. 98 W上为相同。
[0053] 本发明通过W上指纹图谱的建立，进一步的确立了坤灵丸的分析方法，采用该方 法可W隹确辨别坤灵丸，根据和标准指纹图谱的比较，得出鉴别结论，越和标准指纹图谱接 近，产品质量越好，相似度可W使用计算机方法确认，如相似度为0. 90 W上为合格，相似度 为0. 95 W上为相符，相似度为0. 98 W上为相同。
[0054] 上述方法特别是坤灵丸的标准对照气相指纹图谱的制备方法是经过筛选获得的， W下为筛选过程：
[005引 1仪器与试药
[0056] 仪器；美国 Agilent7890A, Agilent Open LAB Control Panel 工作站。
[0057] 色谱柱；①非极性柱，固定相W 5%苯基95%二甲基聚娃氧焼为填料，Agilent HP-5(30mX0. 32mmX0. 25μπ〇 ;
[005引②中极性柱，固定相W 14%氯丙基-苯基86%二甲基聚娃氧焼为填料，Agilent DB-1701 (30mX 0. 25mmX 0. 25 μ m)。
[005引⑨中极性柱，固定相50 %二苯基50 %二甲基聚娃氧焼，Agilent DB-17 (30mX 0. 25mmXO. 15 μ m)
[0060] 试剂；己酸己醋（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）；水为超纯水。
[0061] 对照品；丹皮酪（中国药品生物制品检定所，批号：110708-200506,含量测定用）； α-香附丽（中国食品药品检定研究院，批号：110748-201111,含量测定用）；和厚朴酪（中 国食品药品检定研究院，批号；110730-201011，含量测定化按98. 4%纯度计）
[006引样品；坤灵丸（天津天±力（迂宁）巧喊有限责任公司），共11化具体批号见表 3，均经质检中必检验合格。
[006引表3样品信息表
[0064]
[0065] 2气相色谱条件的选择
[0066] 2. 1色谱柱的选择
[0067] 因坤灵丸包括糖衣丸和薄膜衣丸两种规格，且糖衣丸糖衣剂增重比例较大（约 40% )，故方法考察时首先采用素丸（批号：20130209)样品进行，待条件基本确定后再针对 糖衣丸和薄膜衣丸进行方法学考察。
[0068] 参照相关文献，考察不同极性毛细管柱进行试验，结果3种不同极性毛细管柱分 离得到的色谱峰个数及峰形基本一致，（见图1~3)，但其中色谱柱②的色谱峰峰形较好， 故使用色谱柱②进行程序升温条件的考察。
[0069] 2. 2程序升温条件的选择
[0070] 使用色谱柱②对程序升温条件进行考察调整，在保证出峰完全的情况下，尽可能 缩短分析时长。结果在调整了 30余次程序升温条件后，确定在此程序升温条件（见表2-1) 下，共分离出约11个色谱峰，分析时间总长为55min，见图4。
[0071] 表2-1程序升温表
[0072]
[0073] 3气相色谱条件的确定
[0074] 综上分析，最终确定坤灵丸气相指纹图谱色谱条件如下：
[00巧]色谱柱；固定相W 14%氯丙基-苯基86%二甲基聚娃氧焼为填料，Agilent DB-1701(30mX0. 25mmX0. 25um)。柱温；程序升温条件见表1 ;进样口温度；18(TC ;检测 器；FID ;温度；25(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1进样量；1 μ L。
[0076] 表1程序升温表
[0077]
[0078]
[0079] 4供试品处理方法的选择
[0080] 4. 1首先采用糖衣丸进行提取溶剂的选择：
[0081] ①取糖衣丸适量，研成细粉，精密称取7g (与素丸折算），加己酸己醋25mU超声处 理30min，离必取上清液，浓缩至干，残渣加己酸己醋复溶并定容至5ml，摇匀，过0. 45 μ m微 孔滤膜，即得。
[0082] ②取糖衣丸适量，研成细粉，精密称取7g (与素丸折算），加环己焼25mU超声处理 30min，离必取上清液，浓缩至干，残渣加环己焼复溶并定容至5ml，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤 膜，即得。
[0083] ⑨取糖衣丸适量，研成细粉，精密称取7g，加水25血，超声处理30min，加环己焼萃 取2次，每次20ml，合并萃取液回收至干，残渣加环己焼复溶，并定容至5ml容量瓶中，摇匀， 过0.45 μ m微孔滤膜，即得。
[0084] ④取糖衣丸适量，研成细粉，精密称取7g，加水25血，超声处理30min，加己酸己醋 萃取2次，每次20ml，合并萃取液回收至干，残渣加己酸己醋复溶，并定容至5ml容量瓶中， 摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，即得。
[0085] 结果见图5~图8,由图可W看出，采用供试品处理方法④即水提己酸己醋萃取得 到的色谱图信息最多，故确定采用供试品处理方法④，继续考察。
[0086] 4. 2根据上述考察结果，采用糖衣丸进行提取方式的选择，即供试品处理方法⑤ 取糖衣丸适量，研成细粉，精密称取7g，加水25mL，加热回流30min，加己酸己醋萃取2次， 每次20ml，合并萃取液回收至干，残渣加己酸己醋复溶，并定容至5ml容量瓶中，摇匀，过 0.45 μ m微孔滤膜，即得。
[0087] 结果见图9,由图可W看出，除保留时间在lOmin之前的3个色谱峰明显变大外，其 余色谱峰均明显变小，故考虑气相指纹图谱信息的整体性及供试品操作的简便性，选择供 试品处理方法④。
[0088] 4. 3采用上述供试品处理方法④，进行糖衣丸方法学考察过程中，出现气相进样针 弯折的现象，仔细观察发现是气相进样针针芯及针筒部分抽动极为粘涩造成的，分析可能 原因为糖衣丸包衣剂用量较大（约占整丸的40% )，且包括藏糖，再加上样品为水提己酸己 醋萃取，在样品中则很有可能引入少量的水溶性成分，如藏糖等，使得进样后采用仅己酸己 醋洗针不够彻底，造成进样针进样次数较多之后出现一定的粘涩现象。
[0089] 考虑上述原因后，则决定将糖衣丸去除糖衣后重新进行供试品处理方法考察，且 在仪器灵敏度允许条件下尽可能降低样品浓度。
[0090] ⑧取糖衣丸适量，除去糖衣，研成细粉，精密称取4g，加水25mU超声处理30min， 加己酸己醋萃取2次，每次20ml，合并萃取液回收至干，残渣加己酸己醋复溶，并定容至5ml 容量瓶中，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，即得。
[0091] ⑦取糖衣丸适量，除去糖衣，研成细粉，精密称取Ig，加水25血，超声处理30min， 加己酸己醋萃取2次，第一次15ml，第二次10ml，合并萃取液至化ml容量瓶中，摇匀，过 0. 22 μ m微孔滤膜，即得。
[0092] ⑨取薄膜衣丸适量，研成细粉，精密称取Ig，加水25血，超声处理30min，加己酸己 醋萃取2次，第一次15ml，第二次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中，摇匀，过0. 22 μ m微 孔滤膜，即得。
[0093] 结果供试品处理方法⑧得到的样品在多次进样后，仍出现了进样针粘涩的现象， 故舍弃。
[0094] 供试品处理方法⑦、⑨因样品浓度较低，故在样品进样后进样针较为顺滑，未出现 粘涩现象，初步确定采用该方法，进行方法学考察。供试品处理方法⑦、⑨的典型色谱图见 图 10,图，11。
[0095] 5供试品处理方法的确定
[0096] 取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取l.Og，加水25111以超声处理 30min，加己酸己醋萃取2次，第一次15ml，第二次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中，摇 匀，过0.22 μ m微孔滤膜，即得。
[0097] 6化学成分定性分析及参照峰的选择
[0098] 为进一步明确坤灵丸中所含成分，采用对照品保留时间对比及GC-MS定性法考 察坤灵丸中可能含有的化学成分。通过对比样品与对照品之间的保留时间及GC-MS中 NIST8. 0谱库对比，在该色谱条件下，在样品中可W定位的化学成分有丹皮酪、α -香附丽， 色谱图中丹皮酪的含量最高，且为产品中含量测定项的指标成分，故选择丹皮酪为参照峰。 详见图12,图13。
[0099] 丹皮酪对照品溶液的制备；取丹皮酪对照品适量，精密称定，加己酸己醋制成每 1血含对丹皮酪约12. 55 μ g的溶液，即得。
[0100] 7坤灵丸气相指纹图谱试验的方法学验证
[0101] 7.1重复性试验
[010引取同一批坤灵丸（薄膜衣丸批号：20130102 ;糖衣丸批号：20130101)，按"5"项下 操作，平行制备6份供试品，采用"3"项下色谱条件，进行分析。
[0103] W丹皮酪的保留时间和峰面积为1，计算其它各共有指纹峰的相对保留时间 巧.Rt)及相对峰面积化A)的比值。结果见表7-1~表7-2。结果重复性良好。
[0104] 表7-1薄膜衣丸重复性相对保留时间、相对峰面积数据表
[0105]
[0106] 表7-2糖衣丸重复性相对保留时间、相对峰面积数据表
[0107]
[01 ο引 7. 2精密度试验
[0109] 取同一批坤灵丸（薄膜衣丸批号：20130102 ;糖衣丸批号：20130101)，按"5"项下 操作，制备1份供试品连续进样6次，采用"3"项下色谱条件，进行分析。
[0110] W丹皮酪的保留时间和峰面积为1，计算其它各共有指纹峰的相对保留时间 巧.Rt)及相对峰面积化A)的比值。结果见表7-3~表7-4。结果除4号峰因未达到基线 分离相对峰面积精密度> 5%外，其余各峰相对保留时间及相对峰面积均精密度良好。
[0111] 表7-3薄膜衣丸精密度相对保留时间、相对峰面积数据表
[0112]
[0113] 表7-4糖衣丸精密度相对保留时间、相对峰面积数据表
[0114]
[0115] 7. 3稳定性试验
[0116] 取同一批坤灵丸（薄膜衣丸批号：20130102 ;糖衣丸批号：20130101),按"5"项下 操作，制备1份供试品于0、2、4、6、8、10、12、14、17、20、2他分别进样，采用"3"项下色谱条 件，进行分析。
[0117] W丹皮酪的保留时间和峰面积为1，计算其它各共有指纹峰的相对保留时间 巧.Rt)及相对峰面积化A)的比值。结果见表7-5~表7-6。结果各峰相对保留时间及相 对峰面积1?50均<5%外，表明2他内样品稳定性良好。< br>[om] 表7-5薄膜衣丸稳定性相对保留时间、相对峰面积数据表 [0119]
[0122]
[0123] 8气相指纹图谱方法分析
[0124] 按W上确定的坤灵丸供试品处理方法及色谱条件，随机选取10批坤灵丸按"5"项 下操作，采用"3"项下色谱条件，进行分析。8. 1对照气相指纹图谱的建立
[0125] 选取坤灵丸薄膜衣丸7批、糖衣丸3批，按"5"项下操作，采用"3"项下色谱条件 下进行测定，根据10批坤灵丸供试品气相图谱所给出的相关参数，坤灵丸测定所得的主要 色谱峰均在45分钟内出现。比较薄膜衣丸、糖衣丸10批样品的色谱图及空白溶剂色谱图 发现有10个色谱峰是各批共有的，见图14。
[0126] 另将10批样品中10个共有峰的相对保留时间进行分析，W 5丹皮酪为参照峰，计 算其它9个共有峰的相对保留时间，则11批样品的共有峰平均相对保留时间（峰号）依 次为；0. 365 (1)、0. 372 (2)、0. 769 (3)、0. 772 (4)、1. 000 巧）、1. 263 (6)、1. 283 (7)、1. 359 (8)、 1. 395巧）、1. 565(10)，其相对偏差均在±3% W内。见表8-1。
[0127] 表8-110批样品相对保留时间数据表 [012 引
[0129] 8. 2对照气相指纹图谱的拟合
[0130] W上述10批样品的指纹图谱中10个峰为共有峰，利用中药色谱指纹图谱相似度 评价系统（2. 0版），拟合确定坤灵丸对照气相指纹图谱，见图15
[0131] 8. 3指纹图谱的标准限定
[0132] 根据W上考察结果，确定坤灵丸的气相指纹图谱相似度在0. 90 W上即为合格。
[0133] 本发明的有益效果在于：
[0134] 本发明通过尝试多种色谱条件及供试品处理方法，最终确定了程序升温法对坤灵 丸进行气相指纹图谱分析的色谱条件，考察确定了 10个共有峰的对照气相指纹图谱，方法 简便、快速、重复性好，经方法学验证满足相关要求。
[0135] 应用本发明建立的一种坤灵丸的气相指纹图谱分析方法，对10批样品进行了气 相指纹图谱分析，结果与对照指纹图谱进行比对计算相似度均在0. 90 W上，表明本发明建 立的该方法适用于产品的质量控制要求。
[0136] 本发明建立的一种坤灵丸的气相指纹图谱分析方法适用性强，能够更全面反映产 品的质量状况。
【附图说明】
[0137] 图UHP-5毛细管色谱柱色谱图
[013引 图2、DB-1701毛细管色谱柱色谱图
[0139] 图3、DB-17毛细管色谱柱色谱图
[0140] 图4、DB-1701毛细管色谱柱色谱图
[0141] 图5、供试品处理方法①色谱图
[0142] 图6、供试品处理方法②色谱图
[0143] 图7、供试品处理方法⑨色谱图
[0144] 图8、供试品处理方法④色谱图
[0145] 图9、供试品处理方法⑤色谱图
[0146] 图10、供试品处理方法⑦糖衣丸色谱图
[0147] 图11、供试品处理方法⑨薄膜衣丸色谱图 [014引图12、丹皮酪分子离子峰图
[0149] 图13、香附丽分子离子峰图
[0150] 图14、10批样品共有峰比较图
[0151] 图15、坤灵丸拟合对照指纹图谱
【具体实施方式】：
[0152] W下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
[0153] 实施例1，坤灵丸的气相指纹图谱测定
[0154] 取坤灵丸糖衣丸，批号为20120901
[0155] 步骤1，供试品溶液的制备
[0156] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取l.Og，加水25111以超声处理 30min，加己酸己醋萃取2次，第1次15ml，第2次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中，加己 酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，即得。
[0157] 步骤2,气相指纹图谱的建立
[0158] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程序升温条件见下表；进样口温度：18(TC ;检id器；FID ; 温度；25(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1 ;进样量；1 μ 1。
[0159] 程序升温表
[0160]
[0161]
[0162] 在此条件下分析供试品溶液，得到待测坤灵丸的指纹图谱。
[0163] 实施例2,坤灵丸气相指纹图谱测定
[0164] 取坤灵丸薄膜衣丸，批号20120809
[0165] 步骤1，供试品溶液的制备
[0166] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取l.Og，加水25111以超声处理 30min，加己酸己醋萃取2次，第1次15ml，第2次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中，加己 酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，即得。
[0167] 步骤2,气相指纹图谱的建立
[0168] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程序升温条件见下表；进样口温度：18(TC ;检id器；FID ; 温度；25(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1 ;进样量；1 μ 1。
[0169] 程序升温表
[0170]
[0171] 在此条件下分析供试品溶液，得到待测坤灵丸的指纹图谱。
[0172] 实施例3,坤灵丸气相指纹图谱测定
[0173] 取坤灵丸糖衣丸，批号20120903
[0174] 步骤1，供试品溶液的制备
[0Π 5] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取l.Og，加水25111以超声处理 30min，加己酸己醋萃取2次，第1次15ml，第2次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中，加己 酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，即得。
[0176] 步骤2,气相指纹图谱的建立
[0177] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程序升温条件见下表；进样口温度：18(TC ;检id器；FID ; 温度；25(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1 ;进样量；1 μ 1。
[0178] 程序升温表
[0179]
[0180] 在此条件下分析供试品溶液，得到待测坤灵丸的指纹图谱。
[0181] 实施例4,坤灵丸气相指纹图谱测定
[0182] 色谱条件变更为：
[0183] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程序升温条件见下表；进样口温度：18(TC ;检id器；FID ; 温度；25(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1 ;进样量；1 μ 1。
[0184] 程序升温表
[0185]
[0186] 在此条件下分析供试品溶液，得到待测坤灵丸的指纹图谱。
[0187] 实施例6,坤灵丸的气相指纹图谱测定 [018引取坤灵丸糖衣丸，批号为20120901
[0189] 步骤1，供试品溶液的制备
[0190] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取0. 8g，加水20mL，超声处理 20min，加己酸己醋萃取2次，第1次10ml，第2次5ml，合并萃取液至15ml容量瓶中，加己 酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 2 μ m微孔滤膜，即得。
[0191] 步骤2,气相指纹图谱的建立
[0192] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程序升温条件见下表；进样口温度：15(TC ;检id器；FID ; 温度；23(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1 ;进样量；0. 5μ 1。
[0193] 程序升温表
[0194]
[0195] 在此条件下分析供试品溶液，得到待测坤灵丸的指纹图谱。
[0196] 实施例7,坤灵丸的气相指纹图谱测定
[0197] 取坤灵丸糖衣丸，批号为20120901
[019引步骤1，供试品溶液的制备
[0199] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取1. 2g，加水30mL，超声处理 40min，加己酸己醋萃取2次，第1次20ml，第2次15ml，合并萃取液至35ml容量瓶中，加己 酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，即得。
[0200] 步骤2,气相指纹图谱的建立
[0201] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程序升温条 件见下表；进样口温度；20(TC ;检id器；FID ; 温度；25(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；5 : 1 ;进样量；1 μ 1。
[0202] 程序升温表
[0203]
[0204] 在此条件下分析供试品溶液，得到待测坤灵丸的指纹图谱。
[0205] 实施例8,坤灵丸的气相指纹图谱测定
[0206] 取坤灵丸糖衣丸，批号为20120903
[0207] 步骤1，供试品溶液的制备
[020引取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取1. Og，加水25mL，超声处理 30min，加己酸己醋萃取2次，第1次15ml，第2次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中，加己 酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，即得。
[0209] 步骤2,气相指纹图谱的建立
[0210] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料， (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程序升温条件见下表；进样口温度：18(TC ;检id器；FID ; 温度；25(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1 ;进样量；1 μ 1。
[0211] 程序升温表
[0212]
[0213] 在此条件下分析供试品溶液，得到待测坤灵丸的指纹图谱。
[0214] 实施例9,坤灵丸的气相指纹图谱测定
[0215] 取坤灵丸糖衣丸，批号为20120901
[0216] 步骤1，供试品溶液的制备
[0217] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取1. Og，加水25mL，超声处理 30min，加己酸己醋萃取2次，第1次15ml，第2次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中，加己 酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，即得。
[021引步骤2,气相指纹图谱的建立
[0219] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程序升温条件见下表；进样口温度：18(TC ;检id器；FID ; 温度；25(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1 ;进样量；1 μ 1。
[0220] 程序升温表
[0221]
[0222]
[0223] 在此条件下分析供试品溶液，得到待测坤灵丸的指纹图谱。
[0224] 实施例10,标准坤灵丸对照气相指纹图谱的制备 [022引1)供试品溶液的制备，方法如下：
[0226] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取l.Og，加水25111以超声处理 30min，加己酸己醋萃取2次，第1次15ml，第2次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中，加己 酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，即得。
[0227] 2)对照品溶液的制备，方法如下：
[022引取丹皮酪对照品，加己酸己醋制成每ImL含12. 5μ g的溶液，作为参照物对照品溶 液。
[0229] 3)指纹图谱的确定，方法如下：
[0230] 将供试品溶液和对照品溶液注入气相色谱仪，得到色谱图，
[0231] 其中气相色谱的色谱条件如下：
[0232] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程序升温条件见下表；进样口温度：18(TC ;检id器；FID ; 温度；25(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1 ;进样量；1 μ 1。
[0233] 表1程序升温表
[0234]
[0235] 对11批坤灵丸（薄膜衣丸7批、糖衣丸4批）的气相指纹图谱进行分析比较，确 定了 10个共有峰，色谱图中，与丹皮酪对照品峰保留时间相同的色谱峰为5号峰，计算其它 9个共有峰的相对保留时间分别为；0. 365(1)、0. 372(2)、0. 769(3)、0. 772(4)、1. 000巧）、 1. 263(6)、1. 283(7)、1. 359(8)、1. 395 巧）、1. 565 (10)，各峰的相对保留时间在 ±3% W 内， 利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2. 0版），拟合确定得到坤灵丸标准对照气相指纹 图谱。
[0236] 实施例11，标准坤灵丸对照气相指纹图谱的制备
[0237] 1)供试品溶液的制备，方法如下：
[0238] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取，0. 8g，加水20mL，超声处理 20min，加己酸己醋萃取2次，第1次10ml，第2次5ml，合并萃取液至15ml容量瓶中，加己 酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 2 μ m微孔滤膜，即得。
[023引。对照品溶液的制备，方法如下：
[0240] 取丹皮酪对照品，加己酸己醋制成每ImL含10μ g的溶液，作为参照物对照品溶 液。
[0241] 3)指纹图谱的确定，方法如下：
[0242] 将供试品溶液和对照品溶液注入气相色谱仪，得到色谱图，
[0243] 其中气相色谱的色谱条件如下：
[0244] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程序升温条件见下表；进样口温度：15(TC ;检id器；FID ; 温度；23(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1 ;进样量；0. 5μ 1。
[0245] 表1程序升温表
[0246]
[0247] 对11批坤灵丸（薄膜衣丸7批、糖衣丸4批）的气相指纹图谱进行分析比较，确 定了 10个共有峰，色谱图中，与丹皮酪对照品峰保留时间相同的色谱峰为5号峰，计算其它 9个共有峰的相对保留时间分别为；0. 365(1)、0. 372(2)、0. 769(3)、0. 772(4)、1. 000巧）、 1. 263(6)、1. 283(7)、1. 359(8)、1. 395 巧）、1. 565 (10)，各峰的相对保留时间在 ±3% W 内， 利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2. 0版），拟合确定得到坤灵丸标准对照气相指纹 图谱。
[024引实施例12,标准坤灵丸对照气相指纹图谱的制备 [024引 1)供试品溶液的制备，方法如下：
[0巧0] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取1. 2g，加水30mL，超声处理 40min，加己酸己醋萃取2次，第1次20ml，第2次15ml，合并萃取液至35ml容量瓶中，加己 酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 3 μ m微孔滤膜，即得。
[0巧1] 2)对照品溶液的制备，方法如下：
[0巧引取丹皮酪对照品，加己酸己醋制成每ImL含15μ g的溶液，作为参照物对照品溶 液。
[0巧3] 3)指纹图谱的确定，方法如下：
[0254] 将供试品溶液和对照品溶液注入气相色谱仪，得到色谱图，
[0255] 其中气相色谱的色谱条件如下：
[0256] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程序升温条件见下表；进样口温度；20(TC ;检id器；FID ; 温度；28(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；5 : 1 ;进样量；1 μ 1。
[0巧7] 表1程序升温表
[0巧引
[0259] 对11批坤灵丸（薄膜衣丸7批、糖衣丸4批）的气相指纹图谱进行分析比较，确 定了 10个共有峰，色谱图中，与丹皮酪对照品峰保留时间相同的色谱峰为5号峰，计算其它 9个共有峰的相对保留时间分别为；0. 365(1)、0. 372(2)、0. 769(3)、0. 772(4)、1. 000巧）、 1. 263(6)、1. 283(7)、1. 359(8)、1. 395 巧）、1. 565 (10)，各峰的相对保留时间在 ±3% W 内， 利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2. 0版），拟合确定得到坤灵丸标准对照气相指纹 图谱。
[0260] 实施例13
[0261] 步骤1，坤灵丸标准气相指纹图谱的制备，方法如下：
[026引1)供试品溶液的制备，方法如下：
[0263] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取l.Og，加水25111以超声处理 30min，加己酸己醋萃取2次，第1次15ml，第2次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中，加己 酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，即得；
[0264] 。对照品溶液的制备，方法如下：
[0265] 取丹皮酪对照品，加己酸己醋制成每1血含12. 5μ g的溶液，作为参照物对照品溶 液。
[026引扣指纹图谱的确定，方法如下：
[0267] 将供试品溶液和对照品溶液注入气相色谱仪，得到色谱图，
[026引其中气相色谱的色谱条件如下：
[0269] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料 (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程 序升温条件见下表；进样口温度：18(TC ;检id器；FID ; 温度；25(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1 ;进样量；1 μ 1。
[0270] 表1程序升温表
[0271]
[0272] 对11批坤灵丸（薄膜衣丸7批、糖衣丸4批）的气相指纹图谱进行分析比较，确 定了 10个共有峰，色谱图中，与丹皮酪对照品峰保留时间相同的色谱峰为5号峰，计算其它 9个共有峰的相对保留时间分别为；0. 365(1)、0. 372(2)、0. 769(3)、0. 772(4)、1. 000巧）、 1. 263(6)、1. 283(7)、1. 359(8)、1. 395 巧）、1. 565 (10)，各峰的相对保留时间在 ±3% W 内， 利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2. 0版），拟合确定得到坤灵丸标准对照气相指纹 图谱。
[0273] 待测坤灵丸气相指纹图谱的制备方法，步骤如下：
[0274] 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取l.Og，加水25111以超声处理 30min，加己酸己醋萃取2次，第1次15ml，第2次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中，加 己酸己醋定容至刻度，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，即得；将溶液注入气相色谱仪，得到色谱 图。
[0275] 其中气相色谱的色谱条件如下：
[0276] 色谱柱：固定相W 14 %氯丙基-苯基86 %二甲基聚娃氧焼为填料， (30mX0. 25mmX0. 25l·! m)。柱温；程序升温条件见下表；进样口温度：18(TC ;检id器；FID ; 温度；25(TC ;载气；氮气；分流进样；分流比；1 : 1 ;进样量；1 μ 1。
[0277] 表1程序升温表
[0278]
[0279] 步骤3,将步骤1和步骤2得到的坤灵丸气相指纹图谱比较，相似度为0. 90 W上 为合格。
【主权项】
1. 一种坤灵丸气相色谱标准对照指纹图谱，其建立方法如下： 1) 供试品洛液制备： 取坤灵丸，加水，超声提取，提取液加乙酸乙酯萃取，萃取液取乙酸乙酯层，加乙酸乙酯 定容至刻度，摇匀，过微孔滤膜，既得； 2) 获得气相色谱图： 将供试品溶液进气相色谱仪，得到气相色谱图； 3) 生成对照指纹图谱 选择合格的多批坤灵丸样品的气相指纹图谱中确定共有峰，利用中药色谱指纹图谱相 似度评价系统，确定坤灵丸对照指纹图谱，根据需要可以加入有效成分的标准对照品以作 为参照物峰， 其中气相色谱的色谱条件如下： 色谱柱：固定相以14%氰丙基-苯基86 %二甲基聚硅氧烷为填料，柱温：程序升温条 件见下表；进样口温度：150~200°C ;检测器：FID ;温度：230~280°C ;载气：氮气；分流进 样；分流比：1 : 1~5 : 1 ;进样量：0. 5~1 μ 1 ; 程序升温表 初始温度cC 升溢速举CMn 升至温度D 保持时间取tn: ~6(1. ............ ............. i,Q: - 15-·2δ 90-110 --I ............. 3-8 ITQ--IiO 2~4 ° - 3--.8 UIO ~2 K) 4~8 - 3~S 2? ~260 8-102. 根据权利要求1所述的气相色谱标准对照指纹图谱，其建立方法如下： 1)供试品溶液的制备，方法如下： 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取〇. 8~I. 2g，加水20~30mL，超 声处理20~40min，加乙酸乙酯萃取2次,第1次10~20ml，第2次5~15ml，合并萃取 液至15~35ml容量瓶中，加乙酸乙酯定容至刻度，摇匀，过0. 2-0. 3 μ m微孔滤膜，即得；2) 获得气相色谱图： 以丹皮酚作为参照物制备标准对照品溶液，方法为：取丹皮酚对照品适量，加乙酸乙 酯制成每ImL含10~15 μ g的溶液，作为对照品溶液； 将供试品溶液和对照品溶液注入气相色谱仪，得到色谱图，其中色谱条件为：色谱柱 固定相以14%氰丙基-苯基86%二甲基聚硅氧烷为填料；柱温：见程序升温条件表；进样 口温度：180°C ;检测器：FID ;温度：250°C ;载气：氮气；分流进样；分流比：1 : 1 ;进样量： luL； 3)生成对照指纹图谱 对十批以上坤灵丸的气相指纹图谱进行分析比较，确定10个共有峰，色谱图中，以与 丹皮酚对照品峰保留时间相同的色谱峰为参照，计算其它9个共有峰的相对保留时间分别 为：0· 365、0· 372、0· 769、0· 772、L 000、L 263、L 283、L 359、L 395、L 565,其相对偏差均为 ±3%，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，拟合确定得到坤灵丸标准对照气相指纹图 谱。3. 根据权利要求1所述的气相色谱标准对照指纹图谱，其1)供试品溶液的制备方法如 下： 取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取I. 〇g，加水25mL，超声处理 30min，加乙酸乙酯萃取2次，第一次15ml，第二次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中，摇 匀，过0.22 μ m微孔滤膜，即得。4. 根据权利要求2所述的气相色谱标准对照指纹图谱，其2)丹皮酚对照品溶液的制 备方法为：取丹皮酚对照品适量，精密称定，加乙酸乙酯制成每ImL含对丹皮酚约12. 55 μ g 的溶液，即得。5. 根据权利要求1所述的气相色谱标准对照指纹图谱，其中程序升温表为： 初始温度'C 升温速率Γ/fnin 升至温度Γ 保持时间min 40 ............. ............ O -- 20 IOO 2 -- 5 .180 3 。 ............ δ 2&0 5 S 260 106. -种坤灵丸的气相色谱指纹图谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 待测样品色谱图的制备： 取坤灵丸，加水，超声提取，提取液加乙酸乙酯萃取，萃取液取乙酸乙酯层，加乙酸乙酯 定容至刻度，摇匀，过微孔滤膜，取滤液，注入气相色谱仪，得到色谱图； 2) 待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算： 将待测样品的色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版"软 件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度； 其中气相色谱的色谱条件如下： 色谱柱：固定相以14%氰丙基-苯基86 %二甲基聚硅氧烷为填料，柱温：程序升温条 件见下表；进样口温度：150~200°C ;检测器：FID ;温度：230~280°C ;载气：氮气；分流进 样；分流比：1 : 1~5 : 1 ;进样量：0. 5~1 μ 1 ; 程序升温表 初始温度cC 升溢速举CMn 升至温度D 保持时间取tn: ·，'? (). - 15-·2δ 90-110 2~4. O ............. 3 ~8 170 ~190 ~4 - 3~8 190~2i() 4~8 -:? ~8 24? ~260 8-107. 根据权利要求6的气相色谱指纹图谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 待测样品色谱图的制备： 取坤灵丸适量，研成细粉，糖衣丸除去糖衣，精密称取0. 8~I. 2g，加水20~30mL，超 声处理20~40min，加乙酸乙酯萃取2次,第1次10~20ml，第2次5~15ml，合并萃取液 至15~35ml容量瓶中，加乙酸乙酯定容至刻度，摇匀，过微孔滤膜，取滤液，注入气相色谱 仪，得到色谱图； 2) 待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算： 将待测样品的色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版"软 件比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度。8. 根据权利要求6的气相色谱指纹图谱检测方法，其特征在于，其中步骤1)待测样品 色谱图的制备，方法如下： 取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取I. 〇g，加水25mL，超声处理 30min，加乙酸乙酯萃取2次，第一次15ml，第二次10ml，合并萃取液至25ml容量瓶中，摇 匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，取滤液，注入气相色谱仪，得到色谱图。9. 根据权利要求6的气相色谱指纹图谱检测方法，其特征在于，程序升温表为： 初始温.度"C 升温速率t/min 升至温度Γ 保持时间社η 人·? O1 20 100 2 -- 5 180 3 -- § 200： δ - S mo IO ο
【专利摘要】本发明提供了一种坤灵丸的气相指纹图谱分析方法，所述方法包括：坤灵丸标准气相指纹图谱的建立、待测坤灵丸气相指纹图谱的测定和相似性比较判定等步骤。本发明通过尝试多种程序升温条件，最终确定了坤灵丸的气相指纹图谱分析的色谱条件，考察确定了10个共有峰的对照气相指纹图谱，具有方法简便、速度快、重现性好等特点。所建立的标准气相指纹图谱经方法学验证满足相关要求，适用性强，能够更全面的反映产品质量状况，为质量控制及制定标准提供了重要依据。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/02
【公开号】CN105486764
【申请号】CN201410484066
【发明人】阚红玉, 孙志翠, 刘海涛, 孙玉侠, 曹凤兰, 徐立元, 杨建会, 李建, 杨雪梅, 张淑玉
【申请人】天士力制药集团股份有限公司, 天津天士力（辽宁）制药有限责任公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年9月19日
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