采用hplc同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法
采用hplc同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药、食品、保健品等行业领域，具体是一种同时测定具有生物活性的天然产物的HPLC方法，特别是涉及一种应用于HPLC中的波长转换技术，用于同时检测金银花中绿原酸，木犀草素，木犀草苷3种抗氧化活性成分。
【背景技术】
[0002]金银花是我国传统中药，为忍冬科忍冬属植物忍冬的干燥花蕾或待初开的花。其味甘，性寒，具有清热解毒、疏散风热，疏利咽喉、消暑除烦的作用，可治疗暑热症、泻痢、流感、疮疖肿毒、急慢性扁桃体炎、牙周炎等病。金银花主要含有挥发油、有机酸类、黄酮类、三萜皂苷类、环烯醚萜苷类等生物活性成分。其中，以木犀草苷及其代谢前体木犀草素为代表的黄酮类化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌等多种药理作用。
[0003]目前天然产物的检测方法有很多，主要有:紫外分光光度法、可见分光光度法、二阶导数光谱法、系数倍率法薄层色谱扫描法(TLC法)、高效液相色谱法(HPLC法)、反相高效液相色谱法(RP-HPLC法)、导数极谱法和HPLC法与其它方法的联用。目前，随着分析检测技术的快速发展，传统的检测方法比如薄层色谱、分光光度法等逐渐地被精确的检测方法所取代。高效液相色谱法、气相色谱法等已经成为主流的检测方法。这些方法相对于传统方法，能够检测到天然产物单体化合物的含量，得到的试验数据更精确。
[0004]绿原酸和木犀草苷是药材金银花中的代表性药效成分，中国药典2000年版公布了用高效液相法测定金银花中绿原酸含量的方法，2005年版新增并建立了用高效液相色谱法(HPLC法)来测定木犀草苷含量的标准方法，但由于绿原酸与木犀草苷分子结构差异较大，要采用不同的HPLC分析方法对两种物质含量进行分别测定，需要用到两种不同的色谱柱及检测条件，工作量大，测定时间长，不利于快速分析和大批量样品质量控制的需要。
[0005]中国发明专利201110031466.4提出一种HPLC波长切换同时测定白芍及炮制品中9种成分含量方法，该方法利用同一种检测条件和波长切换的方法，既可以达到增加质量覆盖面的目的，又可以保证每种成分在最大吸收波长处被检测，提高检测灵敏度。中国发明专利201210079072.0提出一种HPLC波长切换技术同时测定牡丹皮、大黄牡丹皮药对及含大黄牡丹皮药对的制剂中多种成分含量的方法，该方法利用多不同时间段的不同梯度洗脱条件以及不同的检测波长，可依次测定样品中1-6种成分的含量。
【发明内容】
[0006]针对目前对于金银花中多种有效成分同时检测方法的存在空白缺失，以及HPLC检测方法在多种中药材成分检测中的应用现状，本发明提供一种灵敏度和精确度高，工作流程简便的采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法。
[0007]本发明建立一种基于HPLC的检测方法，首次提出基于HPLC转换波长技术及梯度洗脱技术应用于同时检测金银花中的3种标志性有效成分绿原酸、木犀草素和木犀草苷的方法。本发明方法根据金银花中3种有效成分分子性质的差异，运用HPLC梯度洗脱技术控制其洗脱时间，以及根据其分子结构及波谱性质差异，运用波长转换技术，达到同时检测的目的；采用梯度洗脱和检测器波长转换技术，通过调节色谱条件(流动相、柱温、流速、波长等)，实现金银花中绿原酸、木犀草素和木犀草苷3种抗氧化活性成分的同时定量检测。
[0008]本发明目的通过如下技术方案实现:
[0009]采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法，包括如下步骤:
[0010]1)测试样溶液的配制:取干燥的金银花或其植物叶茎0.5?2.0g，切细并搅碎后放置容器中，加质量浓度为50?80%乙醇5?20ml，超声处理，过0.45μπι的滤膜，添加乙醇定容，得测试样溶液；
[0011]2)测定金银花中3种有效成分绿原酸、木犀草素和木犀草苷的含量:取步骤1)的测试样溶液，上0DS色谱柱，梯度洗脱:洗脱液为乙腈与磷酸水的混合液，乙腈在所述混合液中的质量浓度为0.1?1.0% ;流动相中乙腈的浓度梯度随时刻的变化情况如下:
[00?2] (1)第一梯度，从起始时刻Omin至时刻ti，质量百分比计，乙腈由初始的Caq上升到CAi;ti = 5?13min;CAo = 0.1 ?10% ;Cai=13?18% ；
[0013](2)第二梯度，从起始时刻乜至时刻t2，乙腈A由CA1上升到CA2 ； t2= 15?22min ； CA2 =20?26% ；
[0014](3)第三梯度，从时刻t2至时刻t3，乙腈A由Ca2上升到Ca3; t3 = 23?30min;CA3 = 28?35% ；
[0015](4)第四梯度，从t3至时刻t4，乙腈A由Ca3下降至Caq; t4=35?45min;
[0016]控制洗脱液流速为0.5?1.0mL/min，柱温为20?40°C，检测波长在初始时刻to至时刻丨5期间采用320?340nm，然后转换波长为345?365nm进行检测；t5 = 10?18min;依次测定，计算出金银花中3种有效成分绿原酸、木犀草素和木犀草苷的含量。
[0017]优选地，所述超声处理的时间为10?50分钟。
[0018]优选地，所述超声处理重复2次，合并2次超声处理的提取液。
[0019]相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果:
[0020]1)本发明首次提出基于HPLC转换波长技术及梯度洗脱技术，应用于同时检测金银花中的3种标志性有效成分绿原酸、木犀草素、木犀草苷的方法，该方法与传统检测手段相比具有简单、准确、快速、精密度高、重复性好的特点，对金银花药材及相关产品的质量控制具有较高的应用价值。
[0021]2)减少工作流程。与中国药典(2010年版)中所录方法相比，本发明方法运用波长转换技术，能在同一色谱柱、同一色谱条件下上完成3种标志性有效成分的检测，缩短了一半以上的检测工作流程；
[0022]3)提高检测的灵敏度和精确度。本发明方法采用梯度洗脱，洗脱过程中调整流动相乙腈与磷酸水的混合比例，使极性小的组分加快洗脱流出，使三个组分出峰时间分得较开，峰形好，大大提高了检测的灵敏度和精确度。
[0023]4)增加金银花样品质量覆盖面。中国药典(2010年版)把绿原酸与木犀草苷的含量作为金银花的检测指标，而实际上木犀草素作为木犀草苷的代谢前体或代谢产物，同样存在在植物体内，并且木犀草苷进入人体后经代谢成木犀草素后发挥其生物活性。因此同时测定绿原酸、木犀草素、木犀草苷3种有效成分有利于增加金银花样品质量的检测指标，扩大其有效成分检测的覆盖面。
【具体实施方式】
[0024]为更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的实施方式不限如此。
[0025]实施例1
[0026]采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法，包括如下步骤:
[0027]1.测试样溶液的配制:取干燥金银花0.5g，精密称定，切细并置具塞锥形瓶中，加入10m质量浓度为60 %乙醇，超声处理20min，倒出上清液，再加入10ml质量浓度为60 %乙醇，重复超声提取20min，合并提取液，过0.45μηι的滤膜，添加乙醇定容至50ml，得到金银花测试样溶液。
[0028]2.对照样溶液的配制:分别精确称取一定量的绿原酸、木犀草素、木犀草苷对照品，于三个烧杯中充分溶解，用乙醇制成分别含绿原酸20yg/mL、木犀草素15yg/mL、木犀草苷15yg/mL的对照样溶液。
[0029]3.测定金银花中3种有效成分绿原酸，木犀草素，木犀草苷的含量，采用高效液相色谱法，应用波长转换及梯度洗脱技术:取一份步骤1制备得到的测试样溶液，上0DS色谱柱(150X4.6πιπι，2μπι)，梯度洗脱，以质量百分比计，洗脱液为乙腈-0.2%磷酸水混合液；第一梯度洗脱，由初始Omin时刻乙腈3 % (0.2 %磷酸水占97 % )上升至9min时乙腈13 % (0.2 %磷酸水占87%);第二梯度洗脱间，由9min乙腈13%上升至18min时乙腈22% (0.2%磷酸水占78%)；第三梯度洗脱由18min时乙腈22 %上升至27min时乙腈占32 % (0.2 %磷酸水68 % )；第四梯度洗脱由27min时乙腈32 %下降至42min时乙腈占3 % (0.2 %磷酸水97 % )。洗脱液流速控制为0.5mL/min，柱温为25°C，检测波长初始为325nm，在12min后转换为350nm;理论塔板数不低于3000。
[0030]4.对步骤2的三个对照品混合溶液分别摇匀，过0.45μπι的滤膜，分别精密吸取混合对照品溶液适量，在步骤3的色谱条件下分别进样进行测定；以进样量(X，yg)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。
[0031]5.将步骤3测得的测试结果与步骤4得到的标准曲线对比。
[0032]精密度考察
[0033]精密吸取测试样溶液lOyL，连续进样5次，测得绿原酸、木犀草素、木犀草苷峰面积的1?0均小于3%。
[0034]稳定性考察
[0035]取测试样溶液，分别在12小时内进样10yL，测得绿原酸、木犀草素、木犀草苷峰面积的1?0均小于3%。
[0036]重复性考察
[0037]取金银花样品5份，每份0.5?2.0g，精密称定，按步骤1方法平行制备5份测试样溶液，分别进样10yL进行测定。结果测得绿原酸、木犀草素、木犀草苷峰面积的RSD均小于3%。
[0038]加样回收率考察
[0039]取已知绿原 酸、木犀草素、木犀草苷含量的金银花5份，每份0.5?2.0g，精密称定，分别置于圆底烧瓶中，精密加入绿原酸、木犀草素、木犀草苷对照样溶液适量。按技术方案步骤1方法操作并以步骤3方法进行测定，在上述色谱条件下进行测定后计算回收率在95%?105%。
[0040]本实施例采用梯度洗脱，洗脱过程中调整流动相乙腈与磷酸水的混合比例，使极性小的组分加快洗脱流出，使三个组分出峰时间分得较开，峰形好，大大提高了检测的灵敏度和精确度。
[0041 ] 实施例2
[0042]采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法，包括如下步骤:
[0043]1.取干燥的金银花叶1.0g，切细并搅碎后在置具塞锥形瓶中，加入质量浓度为70%乙醇15ml，超声处理40分钟，重复2次超声提取，合并提取液，过0.45μπι的滤膜，添加乙醇定容至50ml，得到金银花测试样溶液。
[0044]2.对照样溶液的配制:分别精确称取取绿原酸5.0mg、木犀草素6.0mg、木犀草苷
6.0mg对照品，于三个烧杯中充分溶解，用乙醇制成分别含绿原酸50yg/mL、木犀草素30yg/mL、木犀草苷30yg/mL的对照样溶液。
[0045]3.测定金银花叶中3种有效成分绿原酸，木犀草素，木犀草苷的含量，采用高效液相色谱法，应用波长转换及梯度洗脱技术:取一份制备得到的测试样溶液，上0DS色谱柱(150 X 4.6mm，2μπι)，梯度洗脱，以质量百分比计，洗脱液为乙腈-0.5%磷酸水混合液;第一梯度洗脱，由初始Omin时刻乙腈11% (0.5%磷酸水占89%)上升至12min时乙腈16% (0.5%磷酸水占84%);第二梯度洗脱间，由12min乙腈16%上升至20min时乙腈24% (0.5%磷酸水占76%);第三梯度洗脱由20111丨11时乙腈24%上升至251^11时乙腈占34%(0.5%磷酸水66 % );第四梯度洗脱由25min时乙腈34 %下降至38min时乙腈占11 % (0.5 %磷酸水89 % )。洗脱流速为1.0mL/min，柱温为30°C，检测波长初始为330nm，在lOmin后转换为360nm。理论塔板数不低于3000。
[0046]4.对步骤2的三个对照品混合溶液分别摇匀，过0.45μπι的滤膜，分别精密吸取混合对照品溶液适量，在步骤3的色谱条件下分别进样进行测定；以进样量(X，yg)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。
[0047]5.将步骤3测得的测试结果与步骤4得到的标准曲线对比。
[0048]精密度考察
[0049]精密吸取测试样溶液10yL，连续进样5次，测得绿原酸、木犀草素、木犀草苷峰面积的1?0均小于3%。
[0050]稳定性考察
[0051]取测试样溶液，分别在12小时内进样10yL，测得绿原酸、木犀草素、木犀草苷峰面积的1?0均小于3%。
[0052]重复性考察
[0053]取金银花样品5份，每份0.5?2.0g，精密称定，按步骤1方法平行制备5份测试样溶液，分别进样10yL进行测定。结果测得绿原酸、木犀草素、木犀草苷峰面积的RSD均小于3%。
[0054]加样回收率考察
[0055]取已知绿原酸、木犀草素、木犀草苷含量的金银花5份，每份0.5?2.0g，精密称定，分别置于圆底烧瓶中，精密加入绿原酸、木犀草素、木犀草苷对照样溶液适量。按技术方案步骤1方法操作并以步骤3方法进行测定，在上述色谱条件下进行测定后计算回收率在95%?105%。
[0056]实施例3
[0057]采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法，包括如下步骤:
[0058]1.取干燥的金银花叶1.5g，切细并搅碎后在置具塞锥形瓶中，加入质量浓度为80 %乙醇20ml，超声处理30分钟，重复2次超声提取，合并提取液，过0.45μπι的滤膜，添加乙醇定容至50ml，得到金银花测试样溶液。
[0059]2.对照样溶液的配制:分别精确称取取绿原酸5.0mg、木犀草素6.0mg、木犀草苷
6.0mg对照品，于三个烧杯中充分溶解，用乙醇制成分别含绿原酸50yg/mL、木犀草素30yg/mL、木犀草苷30yg/mL的对照样溶液。
[0060]3.测定金银花叶中3种有效成分绿原酸，木犀草素，木犀草苷的含量，采用高效液相色谱法，应用波长转换及梯度洗脱技术:取一份制备得到的测试样溶液，上0DS色谱柱(150X4.6πιπι，2μπι)，梯度洗脱，以质量百分比计，洗脱液为乙腈-0.4%磷酸水混合液;第一梯度洗脱，由初始Omin时刻乙腈10% (0.4%磷酸水占90%)上升至llmin时乙腈15% (0.4%磷酸水占85% );第二梯度洗脱间，由llmin乙腈15%上升至21min时乙腈26% (0.4%磷酸水占74%);第三梯度洗脱由21min时乙腈26%上升至26min时乙腈占35% (0.4%磷酸水65 % );第四梯度洗脱由26min时乙腈35 %下降至40min时乙腈占10 % (0.4 %磷酸水90 % )。洗脱流速为0.8mL/min，柱温为35°C，检测波长初始为335nm，在14min后转换为355nm。理论塔板数不低于3000。
[0061 ] 4.对步骤2的三个对照品混合溶液分别摇匀，过0.45μπι的滤膜，分别精密吸取混合对照品溶液适量，在步骤3的色谱条件下分别进样进行测定；以进样量(X，yg)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。
[0062]5.将步骤3测得的测试结果与步骤4得到的标准曲线对比。
[0063]精密度考察
[0064]精密吸取测试样溶液10uL，连续进样5次，测得绿原酸、木犀草素、木犀草苷峰面积的1?0均小于3%。
[0065]稳定性考察
[0066]取测试样溶液，分别在12小时内进样10yL，测得绿原酸、木犀草素、木犀草苷峰面积的1?0均小于3%。
[0067]重复性考察
[0068]取金银花样品5份，每份0.5?2.0g，精密称定，按步骤1方法平行制备5份测试样溶液，分别进样10yL进行测定。结果测得绿原酸、木犀草素、木犀草苷峰面积的RSD均小于3%。
[0069]加样回收率考察
[°07°]取已知绿原酸、木犀草素、木犀草苷含量的金银花5份，每份0.5?2.0g，精密称定，分别置于圆底烧瓶中，精密加入绿原酸、木犀草素、木犀草苷对照样溶液适量。按技术方案步骤1方法操作并以步骤3方法进行测定，在上述色谱条件下进行测定后计算回收率在95%ο η / ο r\ τ
【主权项】
1.采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法，其特征在于包括如下步骤: 1)测试样溶液的配制:取干燥的金银花或其植物叶茎0.5?2.0g，切细并搅碎后放置容器中，加质量浓度为50?80%乙醇5?20ml，超声处理，过0.45μπι的滤膜，添加乙醇定容，得测试样溶液； 2)测定金银花中3种有效成分绿原酸、木犀草素和木犀草苷的含量:取步骤1)的测试样溶液，上0DS色谱柱，梯度洗脱:洗脱液为乙腈与磷酸水的混合液，乙腈在所述混合液中的质量浓度为0.1?1.0% ;流动相中乙腈的浓度梯度随时刻的变化情况如下: (1)第一梯度，从起始时刻Omin至时刻ti，质量百分比计，乙腈由初始的Caq上升到CAi;ti=5?13min;CAo = 0.1 ?10% ;Cai=13?18% ； (2)第二梯度，从起始时刻ti至时刻t2，乙腈A由Cai上升到Ca2;t2 = 15?22min;CA2 = 20?26% ； (3)第三梯度，从时刻12至时刻t3，乙腈A由Ca2上升到Ca3； t3 = 23?30min; Ca3 = 28?35% ； (4)第四梯度，从t3至时刻t4，乙腈A由CA3下降至CAQ;t4= 35?45min; 控制洗脱液流速为0.5?1.0mL/min，柱温为20?40°C，检测波长在初始时刻to至时刻t5期间采用320?340nm，然后转换波长为345?365nm进行检测；t5 = 10?18min;依次测定，计算出金银花中3种有效成分绿原酸、木犀草素和木犀草苷的含量。2.根据权利要求1所述的采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法，其特征在于，所述超声处理的时间为10?50分钟。3.根据权利要求1所述的采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法，其特征在于，所述超声处理重复2次，合并2次超声处理的提取液。
【专利摘要】本发明公开了采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法；该方法取干燥的金银花或其植物叶茎0.5～2.0g，切细并搅碎后放置容器中，加乙醇，超声处理，得测试样溶液；取测试样溶液，上ODS色谱柱，梯度洗脱：洗脱液为乙腈与磷酸水的混合液；流动相中乙腈的浓度梯度随时刻的变化：检测波长在初始时刻t0至时刻t5期间采用320～340nm，然后转换波长为345～365nm进行检测；t5＝10～18min；依次测定，计算出金银花中3种有效成分绿原酸、木犀草素和木犀草苷的含量。本发明提供一种灵敏度和精确度高，工作流程简便的采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105486766
【申请号】CN201510656723
【发明人】郑必胜, 陆建超, 扶雄, 刘瑞海, 颜盛繁
【申请人】华南理工大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年10月13日
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药、食品、保健品等行业领域，具体是一种同时测定具有生物活性的天然产物的HPLC方法，特别是涉及一种应用于HPLC中的波长转换技术，用于同时检测金银花中绿原酸，木犀草素，木犀草苷3种抗氧化活性成分。
【背景技术】
[0002]金银花是我国传统中药，为忍冬科忍冬属植物忍冬的干燥花蕾或待初开的花。其味甘，性寒，具有清热解毒、疏散风热，疏利咽喉、消暑除烦的作用，可治疗暑热症、泻痢、流感、疮疖肿毒、急慢性扁桃体炎、牙周炎等病。金银花主要含有挥发油、有机酸类、黄酮类、三萜皂苷类、环烯醚萜苷类等生物活性成分。其中，以木犀草苷及其代谢前体木犀草素为代表的黄酮类化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌等多种药理作用。
[0003]目前天然产物的检测方法有很多，主要有:紫外分光光度法、可见分光光度法、二阶导数光谱法、系数倍率法薄层色谱扫描法(TLC法)、高效液相色谱法(HPLC法)、反相高效液相色谱法(RP-HPLC法)、导数极谱法和HPLC法与其它方法的联用。目前，随着分析检测技术的快速发展，传统的检测方法比如薄层色谱、分光光度法等逐渐地被精确的检测方法所取代。高效液相色谱法、气相色谱法等已经成为主流的检测方法。这些方法相对于传统方法，能够检测到天然产物单体化合物的含量，得到的试验数据更精确。
[0004]绿原酸和木犀草苷是药材金银花中的代表性药效成分，中国药典2000年版公布了用高效液相法测定金银花中绿原酸含量的方法，2005年版新增并建立了用高效液相色谱法(HPLC法)来测定木犀草苷含量的标准方法，但由于绿原酸与木犀草苷分子结构差异较大，要采用不同的HPLC分析方法对两种物质含量进行分别测定，需要用到两种不同的色谱柱及检测条件，工作量大，测定时间长，不利于快速分析和大批量样品质量控制的需要。
[0005]中国发明专利201110031466.4提出一种HPLC波长切换同时测定白芍及炮制品中9种成分含量方法，该方法利用同一种检测条件和波长切换的方法，既可以达到增加质量覆盖面的目的，又可以保证每种成分在最大吸收波长处被检测，提高检测灵敏度。中国发明专利201210079072.0提出一种HPLC波长切换技术同时测定牡丹皮、大黄牡丹皮药对及含大黄牡丹皮药对的制剂中多种成分含量的方法，该方法利用多不同时间段的不同梯度洗脱条件以及不同的检测波长，可依次测定样品中1-6种成分的含量。
【发明内容】
[0006]针对目前对于金银花中多种有效成分同时检测方法的存在空白缺失，以及HPLC检测方法在多种中药材成分检测中的应用现状，本发明提供一种灵敏度和精确度高，工作流程简便的采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法。
[0007]本发明建立一种基于HPLC的检测方法，首次提出基于HPLC转换波长技术及梯度洗脱技术应用于同时检测金银花中的3种标志性有效成分绿原酸、木犀草素和木犀草苷的方法。本发明方法根据金银花中3种有效成分分子性质的差异，运用HPLC梯度洗脱技术控制其洗脱时间，以及根据其分子结构及波谱性质差异，运用波长转换技术，达到同时检测的目的；采用梯度洗脱和检测器波长转换技术，通过调节色谱条件(流动相、柱温、流速、波长等)，实现金银花中绿原酸、木犀草素和木犀草苷3种抗氧化活性成分的同时定量检测。
[0008]本发明目的通过如下技术方案实现:
[0009]采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法，包括如下步骤:
[0010]1)测试样溶液的配制:取干燥的金银花或其植物叶茎0.5?2.0g，切细并搅碎后放置容器中，加质量浓度为50?80%乙醇5?20ml，超声处理，过0.45μπι的滤膜，添加乙醇定容，得测试样溶液；
[0011]2)测定金银花中3种有效成分绿原酸、木犀草素和木犀草苷的含量:取步骤1)的测试样溶液，上0DS色谱柱，梯度洗脱:洗脱液为乙腈与磷酸水的混合液，乙腈在所述混合液中的质量浓度为0.1?1.0% ;流动相中乙腈的浓度梯度随时刻的变化情况如下:
[00?2] (1)第一梯度，从起始时刻Omin至时刻ti，质量百分比计，乙腈由初始的Caq上升到CAi;ti = 5?13min;CAo = 0.1 ?10% ;Cai=13?18% ；
[0013](2)第二梯度，从起始时刻乜至时刻t2，乙腈A由CA1上升到CA2 ； t2= 15?22min ； CA2 =20?26% ；
[0014](3)第三梯度，从时刻t2至时刻t3，乙腈A由Ca2上升到Ca3; t3 = 23?30min;CA3 = 28?35% ；
[0015](4)第四梯度，从t3至时刻t4，乙腈A由Ca3下降至Caq; t4=35?45min;
[0016]控制洗脱液流速为0.5?1.0mL/min，柱温为20?40°C，检测波长在初始时刻to至时刻丨5期间采用320?340nm，然后转换波长为345?365nm进行检测；t5 = 10?18min;依次测定，计算出金银花中3种有效成分绿原酸、木犀草素和木犀草苷的含量。
[0017]优选地，所述超声处理的时间为10?50分钟。
[0018]优选地，所述超声处理重复2次，合并2次超声处理的提取液。
[0019]相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果:
[0020]1)本发明首次提出基于HPLC转换波长技术及梯度洗脱技术，应用于同时检测金银花中的3种标志性有效成分绿原酸、木犀草素、木犀草苷的方法，该方法与传统检测手段相比具有简单、准确、快速、精密度高、重复性好的特点，对金银花药材及相关产品的质量控制具有较高的应用价值。
[0021]2)减少工作流程。与中国药典(2010年版)中所录方法相比，本发明方法运用波长转换技术，能在同一色谱柱、同一色谱条件下上完成3种标志性有效成分的检测，缩短了一半以上的检测工作流程；
[0022]3)提高检测的灵敏度和精确度。本发明方法采用梯度洗脱，洗脱过程中调整流动相乙腈与磷酸水的混合比例，使极性小的组分加快洗脱流出，使三个组分出峰时间分得较开，峰形好，大大提高了检测的灵敏度和精确度。
[0023]4)增加金银花样品质量覆盖面。中国药典(2010年版)把绿原酸与木犀草苷的含量作为金银花的检测指标，而实际上木犀草素作为木犀草苷的代谢前体或代谢产物，同样存在在植物体内，并且木犀草苷进入人体后经代谢成木犀草素后发挥其生物活性。因此同时测定绿原酸、木犀草素、木犀草苷3种有效成分有利于增加金银花样品质量的检测指标，扩大其有效成分检测的覆盖面。
【具体实施方式】
[0024]为更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的实施方式不限如此。
[0025]实施例1
[0026]采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法，包括如下步骤:
[0027]1.测试样溶液的配制:取干燥金银花0.5g，精密称定，切细并置具塞锥形瓶中，加入10m质量浓度为60 %乙醇，超声处理20min，倒出上清液，再加入10ml质量浓度为60 %乙醇，重复超声提取20min，合并提取液，过0.45μηι的滤膜，添加乙醇定容至50ml，得到金银花测试样溶液。
[0028]2.对照样溶液的配制:分别精确称取一定量的绿原酸、木犀草素、木犀草苷对照品，于三个烧杯中充分溶解，用乙醇制成分别含绿原酸20yg/mL、木犀草素15yg/mL、木犀草苷15yg/mL的对照样溶液。
[0029]3.测定金银花中3种有效成分绿原酸，木犀草素，木犀草苷的含量，采用高效液相色谱法，应用波长转换及梯度洗脱技术:取一份步骤1制备得到的测试样溶液，上0DS色谱柱(150X4.6πιπι，2μπι)，梯度洗脱，以质量百分比计，洗脱液为乙腈-0.2%磷酸水混合液；第一梯度洗脱，由初始Omin时刻乙腈3 % (0.2 %磷酸水占97 % )上升至9min时乙腈13 % (0.2 %磷酸水占87%);第二梯度洗脱间，由9min乙腈13%上升至18min时乙腈22% (0.2%磷酸水占78%)；第三梯度洗脱由18min时乙腈22 %上升至27min时乙腈占32 % (0.2 %磷酸水68 % )；第四梯度洗脱由27min时乙腈32 %下降至42min时乙腈占3 % (0.2 %磷酸水97 % )。洗脱液流速控制为0.5mL/min，柱温为25°C，检测波长初始为325nm，在12min后转换为350nm;理论塔板数不低于3000。
[0030]4.对步骤2的三个对照品混合溶液分别摇匀，过0.45μπι的滤膜，分别精密吸取混合对照品溶液适量，在步骤3的色谱条件下分别进样进行测定；以进样量(X，yg)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。
[0031]5.将步骤3测得的测试结果与步骤4得到的标准曲线对比。
[0032]精密度考察
[0033]精密吸取测试样溶液lOyL，连续进样5次，测得绿原酸、木犀草素、木犀草苷峰面积的1?0均小于3%。
[0034]稳定性考察
[0035]取测试样溶液，分别在12小时内进样10yL，测得绿原酸、木犀草素、木犀草苷峰面积的1?0均小于3%。
[0036]重复性考察
[0037]取金银花样品5份，每份0.5?2.0g，精密称定，按步骤1方法平行制备5份测试样溶液，分别进样10yL进行测定。结果测得绿原酸、木犀草素、木犀草苷峰面积的RSD均小于3%。
[0038]加样回收率考察
[0039]取已知绿原 酸、木犀草素、木犀草苷含量的金银花5份，每份0.5?2.0g，精密称定，分别置于圆底烧瓶中，精密加入绿原酸、木犀草素、木犀草苷对照样溶液适量。按技术方案步骤1方法操作并以步骤3方法进行测定，在上述色谱条件下进行测定后计算回收率在95%?105%。
[0040]本实施例采用梯度洗脱，洗脱过程中调整流动相乙腈与磷酸水的混合比例，使极性小的组分加快洗脱流出，使三个组分出峰时间分得较开，峰形好，大大提高了检测的灵敏度和精确度。
[0041 ] 实施例2
[0042]采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法，包括如下步骤:
[0043]1.取干燥的金银花叶1.0g，切细并搅碎后在置具塞锥形瓶中，加入质量浓度为70%乙醇15ml，超声处理40分钟，重复2次超声提取，合并提取液，过0.45μπι的滤膜，添加乙醇定容至50ml，得到金银花测试样溶液。
[0044]2.对照样溶液的配制:分别精确称取取绿原酸5.0mg、木犀草素6.0mg、木犀草苷
6.0mg对照品，于三个烧杯中充分溶解，用乙醇制成分别含绿原酸50yg/mL、木犀草素30yg/mL、木犀草苷30yg/mL的对照样溶液。
[0045]3.测定金银花叶中3种有效成分绿原酸，木犀草素，木犀草苷的含量，采用高效液相色谱法，应用波长转换及梯度洗脱技术:取一份制备得到的测试样溶液，上0DS色谱柱(150 X 4.6mm，2μπι)，梯度洗脱，以质量百分比计，洗脱液为乙腈-0.5%磷酸水混合液;第一梯度洗脱，由初始Omin时刻乙腈11% (0.5%磷酸水占89%)上升至12min时乙腈16% (0.5%磷酸水占84%);第二梯度洗脱间，由12min乙腈16%上升至20min时乙腈24% (0.5%磷酸水占76%);第三梯度洗脱由20111丨11时乙腈24%上升至251^11时乙腈占34%(0.5%磷酸水66 % );第四梯度洗脱由25min时乙腈34 %下降至38min时乙腈占11 % (0.5 %磷酸水89 % )。洗脱流速为1.0mL/min，柱温为30°C，检测波长初始为330nm，在lOmin后转换为360nm。理论塔板数不低于3000。
[0046]4.对步骤2的三个对照品混合溶液分别摇匀，过0.45μπι的滤膜，分别精密吸取混合对照品溶液适量，在步骤3的色谱条件下分别进样进行测定；以进样量(X，yg)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。
[0047]5.将步骤3测得的测试结果与步骤4得到的标准曲线对比。
[0048]精密度考察
[0049]精密吸取测试样溶液10yL，连续进样5次，测得绿原酸、木犀草素、木犀草苷峰面积的1?0均小于3%。
[0050]稳定性考察
[0051]取测试样溶液，分别在12小时内进样10yL，测得绿原酸、木犀草素、木犀草苷峰面积的1?0均小于3%。
[0052]重复性考察
[0053]取金银花样品5份，每份0.5?2.0g，精密称定，按步骤1方法平行制备5份测试样溶液，分别进样10yL进行测定。结果测得绿原酸、木犀草素、木犀草苷峰面积的RSD均小于3%。
[0054]加样回收率考察
[0055]取已知绿原酸、木犀草素、木犀草苷含量的金银花5份，每份0.5?2.0g，精密称定，分别置于圆底烧瓶中，精密加入绿原酸、木犀草素、木犀草苷对照样溶液适量。按技术方案步骤1方法操作并以步骤3方法进行测定，在上述色谱条件下进行测定后计算回收率在95%?105%。
[0056]实施例3
[0057]采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法，包括如下步骤:
[0058]1.取干燥的金银花叶1.5g，切细并搅碎后在置具塞锥形瓶中，加入质量浓度为80 %乙醇20ml，超声处理30分钟，重复2次超声提取，合并提取液，过0.45μπι的滤膜，添加乙醇定容至50ml，得到金银花测试样溶液。
[0059]2.对照样溶液的配制:分别精确称取取绿原酸5.0mg、木犀草素6.0mg、木犀草苷
6.0mg对照品，于三个烧杯中充分溶解，用乙醇制成分别含绿原酸50yg/mL、木犀草素30yg/mL、木犀草苷30yg/mL的对照样溶液。
[0060]3.测定金银花叶中3种有效成分绿原酸，木犀草素，木犀草苷的含量，采用高效液相色谱法，应用波长转换及梯度洗脱技术:取一份制备得到的测试样溶液，上0DS色谱柱(150X4.6πιπι，2μπι)，梯度洗脱，以质量百分比计，洗脱液为乙腈-0.4%磷酸水混合液;第一梯度洗脱，由初始Omin时刻乙腈10% (0.4%磷酸水占90%)上升至llmin时乙腈15% (0.4%磷酸水占85% );第二梯度洗脱间，由llmin乙腈15%上升至21min时乙腈26% (0.4%磷酸水占74%);第三梯度洗脱由21min时乙腈26%上升至26min时乙腈占35% (0.4%磷酸水65 % );第四梯度洗脱由26min时乙腈35 %下降至40min时乙腈占10 % (0.4 %磷酸水90 % )。洗脱流速为0.8mL/min，柱温为35°C，检测波长初始为335nm，在14min后转换为355nm。理论塔板数不低于3000。
[0061 ] 4.对步骤2的三个对照品混合溶液分别摇匀，过0.45μπι的滤膜，分别精密吸取混合对照品溶液适量，在步骤3的色谱条件下分别进样进行测定；以进样量(X，yg)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。
[0062]5.将步骤3测得的测试结果与步骤4得到的标准曲线对比。
[0063]精密度考察
[0064]精密吸取测试样溶液10uL，连续进样5次，测得绿原酸、木犀草素、木犀草苷峰面积的1?0均小于3%。
[0065]稳定性考察
[0066]取测试样溶液，分别在12小时内进样10yL，测得绿原酸、木犀草素、木犀草苷峰面积的1?0均小于3%。
[0067]重复性考察
[0068]取金银花样品5份，每份0.5?2.0g，精密称定，按步骤1方法平行制备5份测试样溶液，分别进样10yL进行测定。结果测得绿原酸、木犀草素、木犀草苷峰面积的RSD均小于3%。
[0069]加样回收率考察
[°07°]取已知绿原酸、木犀草素、木犀草苷含量的金银花5份，每份0.5?2.0g，精密称定，分别置于圆底烧瓶中，精密加入绿原酸、木犀草素、木犀草苷对照样溶液适量。按技术方案步骤1方法操作并以步骤3方法进行测定，在上述色谱条件下进行测定后计算回收率在95%ο η / ο r\ τ
【主权项】
1.采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法，其特征在于包括如下步骤: 1)测试样溶液的配制:取干燥的金银花或其植物叶茎0.5?2.0g，切细并搅碎后放置容器中，加质量浓度为50?80%乙醇5?20ml，超声处理，过0.45μπι的滤膜，添加乙醇定容，得测试样溶液； 2)测定金银花中3种有效成分绿原酸、木犀草素和木犀草苷的含量:取步骤1)的测试样溶液，上0DS色谱柱，梯度洗脱:洗脱液为乙腈与磷酸水的混合液，乙腈在所述混合液中的质量浓度为0.1?1.0% ;流动相中乙腈的浓度梯度随时刻的变化情况如下: (1)第一梯度，从起始时刻Omin至时刻ti，质量百分比计，乙腈由初始的Caq上升到CAi;ti=5?13min;CAo = 0.1 ?10% ;Cai=13?18% ； (2)第二梯度，从起始时刻ti至时刻t2，乙腈A由Cai上升到Ca2;t2 = 15?22min;CA2 = 20?26% ； (3)第三梯度，从时刻12至时刻t3，乙腈A由Ca2上升到Ca3； t3 = 23?30min; Ca3 = 28?35% ； (4)第四梯度，从t3至时刻t4，乙腈A由CA3下降至CAQ;t4= 35?45min; 控制洗脱液流速为0.5?1.0mL/min，柱温为20?40°C，检测波长在初始时刻to至时刻t5期间采用320?340nm，然后转换波长为345?365nm进行检测；t5 = 10?18min;依次测定，计算出金银花中3种有效成分绿原酸、木犀草素和木犀草苷的含量。2.根据权利要求1所述的采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法，其特征在于，所述超声处理的时间为10?50分钟。3.根据权利要求1所述的采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法，其特征在于，所述超声处理重复2次，合并2次超声处理的提取液。
【专利摘要】本发明公开了采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法；该方法取干燥的金银花或其植物叶茎0.5～2.0g，切细并搅碎后放置容器中，加乙醇，超声处理，得测试样溶液；取测试样溶液，上ODS色谱柱，梯度洗脱：洗脱液为乙腈与磷酸水的混合液；流动相中乙腈的浓度梯度随时刻的变化：检测波长在初始时刻t0至时刻t5期间采用320～340nm，然后转换波长为345～365nm进行检测；t5＝10～18min；依次测定，计算出金银花中3种有效成分绿原酸、木犀草素和木犀草苷的含量。本发明提供一种灵敏度和精确度高，工作流程简便的采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105486766
【申请号】CN201510656723
【发明人】郑必胜, 陆建超, 扶雄, 刘瑞海, 颜盛繁
【申请人】华南理工大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年10月13日
最新回复(0)