一种清热散结胶囊指纹图谱的建立方法
一种清热散结胶囊指纹图谱的建立方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及中药制剂的质量控制方法，特别是设及一种用高效液相色谱法对清热 散结胶囊制剂指纹图谱的构建方法及其指纹图谱。
【背景技术】
[0002] 中药质量控制是中药现代化的重要内容，指纹图谱技术被认为是中药质量控制研 究的有效手段。中药指纹图谱能比较全面地反映中药中化学物质的种类与数量，是实现中 药真实性、质量可控性和产品稳定性的可行模式，能更好地反映中药的内在品质。随着中药 指纹图谱及化学模式识别技术的发展，指纹图谱技术已日益成为国内外广泛接受的中药质 量评价模式。基于定量指纹图谱技术的中药质量控制模式是W传统中医药理论体系为基础 的综合控制模式，体现了中医药整体治疗的特色。定量指纹图谱技术在原有指纹图谱的方 法上赋予指纹图谱大量的定性、定量信息共同应用于中药质量控制，对指纹图谱中目标成 分尤其是有效成分进行准确定量，使中药质量控制更加准确，能更真实反映中药的质量状 况和产品组成，产品的质量和稳定性更加可靠。
[0003] 清热散结胶囊是由千里光提取制成的纯中药制剂，具有消炎解毒、散结止痛、抗肿 瘤的作用，用于急性结膜炎、急性咽喉炎、急性扁桃腺炎、急性菌频、上呼吸道炎、急性支气 管炎、淋己结炎、疮巧疼痛、中耳炎、皮炎湿疹等。文献报道千里光的主要有效成分是绿原 酸，常作为含量测定中质量控制指标性成分。随着现代医药的高速发展，现行的清热散结胶 囊的质量控制标准已不能真实反映清热解散胶囊的内在品质及批次之间产品质的一致性。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种清热散结胶囊指纹 图谱的建立方法及其指纹图谱，该方法用高效液相色谱法对清热散结胶囊种的指标成分进 行含量测定，获得指纹图谱，用于评价和控制清热散结胶囊的质量，可W保证清热散结胶囊 的质量稳定性、一致性和可控性，从而确保清热散结胶囊的安全性和有效性。
[000引为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
[0006] 本发明一种清热散结胶囊指纹图谱的建立方法:取清热散结胶囊内容物用甲醇溶 液超声波提取；W绿原酸为对照品；W千里光浸膏粉及千里光药材为对照品，照高效液相色 谱法建立指纹图谱，洗脱过程为梯度洗脱。
[0007] 进一步的，上述清热散结胶囊指纹图谱的建立方法:取清热散结胶囊内容物，研细 后用75%甲醇溶液超声波提取，再用0.22WI1~0.45μπι微孔滤头滤过，取滤液；W绿原酸为对 照品，加75%甲醇溶剂溶解；W千里光浸膏粉为对照品，用75%甲醇溶液超声波提取，滤过， 取滤液；W千里光药材为对照药材，用75 %甲醇溶液于75~85°C水浴加热回流提取，滤过， 取滤液，照高效液相色谱法建立指纹图谱，洗脱过程为梯度洗脱。
[000引前述方法中所述高效液相色谱法的色谱条件为:0DS C18色谱柱，流动相A为乙腊， 流动相B为憐酸水溶液，梯度洗脱，流速1.0ml/min，柱溫25~35°C，检测波长:Omin-22化m， 15min-280nm，30min-325nm，40min-360nm。
[0009] 超声处理条件为功率250W，频率50kHz下，超声提取20~40分钟。
[0010] 具体的，前述清热散结胶囊指纹图谱的建立方法如下：
[0011] (a)供试品溶液的制备:取清热散结胶囊内容物0.5~5. Og，充分研细后加入75% 甲醇溶液25~250ml，称定重量，超声处理20~40分钟，取出放冷，用75 %甲醇补足减失的重 量，滤过，取滤液作为供试品溶液，
[0012] 所述超声处理条件为功率250W，频率50kHz下，超声提取20~40分钟；所述滤过为 义用0.22曲1~0.45曲1微孔滤头滤过；
[0013] (b)对照品溶液的配制：
[0014] 绿原酸对照品溶液的配制:精密称取绿原酸对照品适量，加75%甲醇制成每1ml含 绿原酸0. 〇5mg的溶液，作为绿原酸对照品溶液；
[0015] 千里光浸膏粉对照品溶液的配制：取浸膏0.2~Ig，加入75%甲醇溶液10~50ml， 称定重量，超声处理20~40分钟，取出放冷，用75%甲醇补足减失的重量，滤过，取滤液作为 千里光浸膏粉对照品溶液；
[0016] 千里光药材对照品溶液的配制：取千里光药材0.5~5. Og，精密称定，置具塞锥形 瓶中，精密加入75%甲醇25~250ml，称定重量，于75~85°C水浴加热回流1小时，取出放冷， 用75%甲醇补足减失的重量，滤过，取滤液作为千里光药材对照品溶液，
[0017] 所述超声提取条件为功率250W，频率50kHz下，超声提取20~40分钟；所述滤过为 义用0.22曲1~0.45曲1微孔滤头滤过；
[0018] (C)色谱条件为:0DS C18色谱柱，流动相A为乙腊，流动相B为憐酸水溶液，梯度洗 脱，流速 l.Oml/min，柱溫 25 ~35°C，检测波长：0min-220nm，15min-280nm，30min-325nm， 40min-360nm；
[0019] (d)测定:精密吸取供试品溶液、对照品溶液化1，分别注入液相色谱仪，照高效液 相色谱法测定，得到清热散结胶囊的指纹图谱。
[0020] 进一步地，前述清热散结胶囊指纹图谱的方法优选方案如下：
[0021] (a)供试品溶液的制备:取清热散结胶囊内容物Ig，充分研细后加入75%甲醇溶液 50ml，称定重量，超声处理30分钟，取出放冷，用75%甲醇补足减失的重量，滤过，取滤液作 为供试品溶液，超声提取条件为功率250W，频率50曲Z下，超声提取30分钟，
[0022] 所述超声处理条件为功率250W，频率50kHz下，超声提取20~40分钟；所述滤过为 义用0.22曲1~0.45曲1微孔滤头滤过；
[0023] (b)对照品溶液的配制：
[0024] 绿原酸对照品溶液的配制:精密称取绿原酸对照品2.5mg，加75%甲醇50ml充分溶 解，作为绿原酸对照品溶液；
[0025] 千里光浸膏粉对照品溶液的配制：取浸膏0.4g，加入75%甲醇溶液20ml，称定重 量，超声处理30分钟，取出放冷，用75%甲醇补足减失的重量，滤过，取滤液作为千里光浸膏 粉对照品溶液，超声提取条件为功率250W，频率50曲Z下，超声提取30分钟；
[0026] 千里光药材对照品溶液的配制：取千里光药材Ig，精密称定，置具塞锥形瓶中，精 密加入75%甲醇50ml，称定重量，于75~85°C水浴加热回流1小时，取出放冷，用75%甲醇补 足减失的重量，滤过，取滤液作为千里光药材对照品溶液，
[0027] 所述超声处理条件为功率250W，频率50kHz下，超声提取20~40分钟；所述滤过为 义用0.22曲1~0.45曲1微孔滤头滤过；
[0028] (C)色谱条件为:0DS C18色谱柱，流动相A为乙腊，流动相B为0.05%憐酸水溶液， 梯度洗脱，流速 l.Oml/min，柱溫 30°C，检测波长：0min-220nm，15min-280nm，30min-325nm， 40min-360nm；
[0029] (d)测定:精密吸取供试品溶液、对照品溶液化1，分别注入液相色谱仪，照高效液 相色谱法测定，得到清热散结胶囊的指纹图谱。
[0030] 前述方法中千里光浸膏粉的制备方法：
[0031 ]取千里光90g，加水煎煮2次，每次2小时，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度1.18-1.19(25°C)的稠膏，加入相当于稠膏1倍量的乙醇，静置12小时使沉淀，滤过，滤液回收乙 醇，浓缩至相对密度为1.30(80°C)的稠膏，真空干燥，粉碎成细粉，即得浸膏粉。
[0032] 前述方法中所述梯度洗脱的程序W如下体积比浓度配置进行：
[0033]
[0034]
[003引用前述方法建立的指纹图谱中有12特征峰，其中峰7为绿原酸，图谱总长度为 60min。
[0036]上述指纹图谱中所述12个特征共有峰的平均保留时间(min)如下： 「00371
[0038] 与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
[0039] (1)用本发明所提供的方法建立的清热散结胶囊HP1X指纹图谱与对照图谱的相似 度均大于0.9，能有效的表征其质量，有利于全面监控产品的质量。
[0040] (2)指纹图谱注重各特征峰的关联性和指纹图谱的整体面貌特征，避免了清热散 结胶囊质量控制的单一性和片面性，减少了人为处理产品质量达标的可能性。
[0041] (3)本发明基于指纹图谱用特征指标成分控制产品质量，保证了产品质量的长期 稳定性，疗效的安全性和可靠性。
[0042] (4)本发明具有方便、快捷、稳定、精密度高和重现性好等优点，可准确可靠的控制 清热散结胶囊的质量。
【附图说明】
[0043] 图1清热散结胶囊指纹图谱。
[0044] 图2 8批次清热散结胶囊的指纹图谱。
[004引图3绿原酸特征图谱对照图谱。
[0046] 图4千里光浸膏粉特征图谱对照图谱。
[0047] 图5千里光药材特征图谱对照图谱。
【具体实施方式】
[0048] 除非另有定义，本发明使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属技术领域 普通技术人员通常理解的含义相同。通常，本发明使用的命名及下述实验方法都是本领域 公知的或常用的。为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，W 下结合具体实施例，对本发明作进一步的说明。
[0049] 仪器:Waters高效液相色谱仪(Waters2695分离单元，Waters2996二极管阵列检测 器，Empower色谱工作站）；AB104-N万分之一天平(梅特勒-托利多）；AUW2200十万分之一天 平（SHIMADZU岛津）；KQ3200超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；Mi 1 i-Q超纯水仪： (美国Milipore公司）。
[0050] 试药和试剂:清热散结胶囊由江西普正制药有限公司提供(批号：121101、121102、 121103、121104、121201、121202、130702、130703);千里光药材、甲醇(分析纯）、乙腊(色谱 纯）、憐酸(分析纯)均购于市售。
[0051 ]实施例1:清热散结胶囊基于指纹 图谱的质量控制方法
[0052] 供试品溶液的制备：取清热散结胶囊内容物Ig，充分研细后加入75%甲醇溶液 50ml，称定重量，超声处理30分钟，取出放冷，用75%甲醇补足减失的重量，滤过，取滤液作 为供试品溶液；
[0053] 对照品溶液的配制：
[0054] 绿原酸对照品溶液的配制:精密称取绿原酸对照品2.5mg，加75%甲醇50ml充分溶 解，作为绿原酸对照品溶液；
[0055] 千里光浸膏粉对照品溶液的配制：取浸膏0.4g，加入75 %甲醇溶液20ml，称定重 量，超声处理30分钟，取出放冷，用75%甲醇补足减失的重量，滤过，取滤液作为千里光浸膏 粉对照品溶液；
[0056] 千里光药材对照品溶液的配制：取千里光药材Ig，精密称定，置具塞锥形瓶中，精 密加入75%甲醇50ml ml,称定重量，于75~85°C水浴加热回流1小时，取出放冷，用75%甲 醇补足减失的重量，滤过，取滤液作为千里光药材对照品溶液；
[0057] 超声提取条件为:功率250W，频率50kHz;
[0058] 色谱条件为:0DS C18色谱柱，流动相A为乙腊，流动相B为0.05%憐酸水溶液，梯度 洗脱，流速 l.Oml/min，柱溫 25 ~35°C，检测波长：0min-220nm，15min-280nm，30min-325nm， 40min-360nm；
[0059] 梯度洗脱的程序W如下体积比浓度配置进行：
[0060]
[0061] ~测定:精密吸取供试品溶液、对照品溶液扣1，分别注入液相色谱仪，照高效液相色胃 谱法测定，得到清热散结胶囊的指纹图谱。
[0062] 实施例2::清热散结胶囊指纹图谱的建立
[0063] 采用实施例1所述方法测定共8个批次的清热散结胶囊（批号：121101、121102、 121103、121104、121201、121202、130702、130703)，得到8个批次的清热散结胶囊指纹图谱。
[0064] 通过8批次清热散结胶囊HPLC图谱的比较，进行相似度评价:采用《中药色谱指纹 图谱相似度评价系统》2012年版相似度软件，进行相似度评价，清热散结胶囊指纹图谱相似 度研究结果如下表：
[0065] 8个批次清热散结胶囊指纹图谱相似度计算结果
[0066]
[0067] ~上表显示，不同批次清热散结ik囊指纹图谱的相似度大于0.9,说明各批次的样品I 色谱模式相似，其化学成分一致性较好。
[0068] 实施例3:精密度试验
[0069] 取批号121104清热散结胶囊样品，按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液， 连续进样5次，将结果数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012年版相似度软件， 进行分析其结果(如下表)显示相似度在0.95W上，即本方法仪器精密度良好。
[0070]
[0071] ~实施例4:重现性试验
[0072] 取批号130702的清热散结胶囊样品，按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶 液，平行溶液6份连续进样，将结果数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012年版 相似度软件，进行分析其结果(如下表)显示相似度在0.95W上，即本方法重现性良好。
[0073]
[0074] ~实施例5:溶液稳定性试验重现性试验 ' ' ' '
[0075] 取批号121202的清热散结胶囊样品，按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶 液，分别于0、2、4、8、12、24小时后进样，将结果数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系 统》2012年版相似度软件，进行分析其结果(如下表)显示相似度在0.95W上，即供试品溶液 在24小时内稳定。
[0076]
[0077] 应当说明的是，虽然本发明W较佳实施例掲露如上，然其并非用W限定本发明，任 何熟习此项技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，所作的任何修改、等同替换和改进 等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种清热散结胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于清热散结胶囊用甲醇溶液 超声提取，以绿原酸、千里光浸膏粉、千里光药材为对照品，照高效液相色谱法建立指纹图 谱；高效液相色谱法的色谱条件为:ODS C18色谱柱;流动相A为乙腈;流动相B为磷酸水溶 液;检测波长220~360nm;柱温为15~40°C;流速1.0 ml/min;洗脱程序为梯度洗脱。2. 根据权利要求1所述的一种清热散结胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于清 热散结胶囊内容物用75%甲醇溶液超声波提取，滤过，取滤液；以绿原酸为对照品，加75% 甲醇溶剂溶解；以千里光浸膏粉为对照品，用75%甲醇溶液超声波提取，滤过，取滤液；以千 里光药材为对照药材，用75%甲醇溶液加热回流提取，滤过，取滤液，照高效液相色谱法建 立指纹图谱，其中梯度洗脱的程序按下述体积比浓度配置进行： 洗脱时间（min) 流动相A-乙腈 流动相B-0.05%磷酸水溶液 0 5% 95% 8 5% 95% 15 10% 90% 20 10% 90% 30 16% 84% 50 40% 60% 60 50% 50% 70 90% 10%,:3. 根据权利要求2所述的一种清热散结胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于： (a) 供试品溶液的制备:取清热散结胶囊内容物0.5~5. Og，充分研细后加入75 %甲醇 溶液25~250ml，称定重量，超声处理20~40分钟，取出放冷，用75%甲醇补足减失的重量， 滤过，取滤液作为供试品溶液； (b) 对照品溶液的配制： 绿原酸对照品溶液的配制:精密称取绿原酸对照品适量，加75 %甲醇制成每1ml含绿原 酸0.05mg的溶液，作为绿原酸对照品溶液； 千里光浸膏粉对照品溶液的配制：取浸膏〇. 2~I g，加入7 5 %甲醇溶液10~5 0 m 1，称定 重量，超声处理20~40分钟，取出放冷，用75%甲醇补足减失的重量，滤过，取滤液作为千里 光浸膏粉对照品溶液； 千里光药材对照品溶液的配制:取千里光药材0.5~5. Og，精密称定，置具塞锥形瓶中， 精密加入75%甲醇25~250ml，称定重量，水浴加热回流1小时，取出放冷，用75%甲醇补足 减失的重量，滤过，取滤液作为千里光药材对照品溶液； (c) 色谱条件为:ODS C18色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为磷酸水溶液，梯度洗脱，流 速1 · Oml/min，柱温25~35°C，检测波长：0min-220nm，15min_280nm，30min-325nm，40min-360nm； (d) 测定:精密吸取供试品溶液、对照品溶液5μ1，分别注入液相色谱仪，照高效液相色 谱法测定，得到清热散结胶囊的指纹图谱。4. 根据权利要求2所述的一种清热散结胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于： (a) 供试品溶液的制备：取清热散结胶囊内容物Ig，充分研细后加入75 %甲醇溶液 50ml，称定重量，超声处理30分钟，取出放冷，用75%甲醇补足减失的重量，滤过，取滤液作 为供试品溶液； (b) 对照品溶液的配制： 绿原酸对照品溶液的配制：精密称取绿原酸对照品2.5mg，加75%甲醇50ml充分溶解， 作为绿原酸对照品溶液； 千里光浸膏粉对照品溶液的配制：取浸膏〇.4g，加入75%甲醇溶液20ml，称定重量，超 声处理30分钟，取出放冷，用75 %甲醇补足减失的重量，滤过，取滤液作为千里光浸膏粉对 照品溶液； 千里光药材对照品溶液的配制：取千里光药材lg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加 入75 %甲醇50ml，称定重量，水浴加热回流1小时，取出放冷，用75%甲醇补足减失的重量， 滤过，取滤液作为千里光药材对照品溶液； (c) 色谱条件为:ODS C18色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.05%磷酸水溶液，梯度 洗脱，流速 1 · 〇ml/min，柱温 25 ~35°C，检测波长：0min-220nm，15min-280nm，30min-325nm， 40min-360nm； (d) 测定:精密吸取供试品溶液、对照品溶液5μ1，分别注入液相色谱仪，照高效液相色 谱法测定，得到清热散结胶囊的指纹图谱。5. 根据权利要求3或4所述的一种清热散结胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于 供试品溶液和对照品溶液的制备过程中超声提取条件为功率250W，频率50kHz，超声处理20 ~40分钟。6. 根据权利要求3或4所述的一种清热散结胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于 供试品溶液和对照品溶液的制备过程中过滤为采用〇. 22μπι~0.45μπι微孔滤头滤过。7. 根据权利要求3或4所述的一种清热散结胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于 色谱条件中柱温为30°C。8. 根据权利要求3或4所述的一种清热散结胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于 千里光药材对照品溶液的配制过程中水浴加热回流温度为75~85°C。9. 根据权利要求3或4所述的一种清热散结胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于 所述指纹图谱中有12个特征共有峰，其中第7号峰分别为绿原酸，图谱总长度为60min。10. 根据权利要求3或4所述的一种清热散结胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在 于指纹图谱中所述的12个特征共有峰的平均保留时间如下： 峰I:5.2min;峰2:7.8min;峰3:8.2min;峰4:10.Imin;峰5:18.Imin;峰6:20.Imin;峰7: 24.8minJ$8:26.1minJ$9:27.3minJ$10:21.8minJ$ll :50.6minJ$12:56.3min。
【专利摘要】一种清热散结胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，涉及中药制剂质量控制方法。清热散结胶囊用甲醇溶液超声波提取，以绿原酸、千里光浸膏粉、千里光药材为对照品，照高效液相色谱法建立指纹图谱，洗脱程序为梯度洗脱程序。本发明建立的清热散结胶囊指纹图谱与相应的对照图谱进行相似度评价，其相似度大于0.9，能有效的表征产品质量，更有利于监控产品的质量，能更有效的保证产品质量的长期稳定性，进而保障疗效的安全性和有效性。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105486769
【申请号】CN201510906632
【发明人】肖军平, 吴永忠, 陈梁, 杜建松, 陈金德
【申请人】江西普正制药有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月9日
【技术领域】
[0001] 本发明设及中药制剂的质量控制方法，特别是设及一种用高效液相色谱法对清热 散结胶囊制剂指纹图谱的构建方法及其指纹图谱。
【背景技术】
[0002] 中药质量控制是中药现代化的重要内容，指纹图谱技术被认为是中药质量控制研 究的有效手段。中药指纹图谱能比较全面地反映中药中化学物质的种类与数量，是实现中 药真实性、质量可控性和产品稳定性的可行模式，能更好地反映中药的内在品质。随着中药 指纹图谱及化学模式识别技术的发展，指纹图谱技术已日益成为国内外广泛接受的中药质 量评价模式。基于定量指纹图谱技术的中药质量控制模式是W传统中医药理论体系为基础 的综合控制模式，体现了中医药整体治疗的特色。定量指纹图谱技术在原有指纹图谱的方 法上赋予指纹图谱大量的定性、定量信息共同应用于中药质量控制，对指纹图谱中目标成 分尤其是有效成分进行准确定量，使中药质量控制更加准确，能更真实反映中药的质量状 况和产品组成，产品的质量和稳定性更加可靠。
[0003] 清热散结胶囊是由千里光提取制成的纯中药制剂，具有消炎解毒、散结止痛、抗肿 瘤的作用，用于急性结膜炎、急性咽喉炎、急性扁桃腺炎、急性菌频、上呼吸道炎、急性支气 管炎、淋己结炎、疮巧疼痛、中耳炎、皮炎湿疹等。文献报道千里光的主要有效成分是绿原 酸，常作为含量测定中质量控制指标性成分。随着现代医药的高速发展，现行的清热散结胶 囊的质量控制标准已不能真实反映清热解散胶囊的内在品质及批次之间产品质的一致性。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种清热散结胶囊指纹 图谱的建立方法及其指纹图谱，该方法用高效液相色谱法对清热散结胶囊种的指标成分进 行含量测定，获得指纹图谱，用于评价和控制清热散结胶囊的质量，可W保证清热散结胶囊 的质量稳定性、一致性和可控性，从而确保清热散结胶囊的安全性和有效性。
[000引为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
[0006] 本发明一种清热散结胶囊指纹图谱的建立方法:取清热散结胶囊内容物用甲醇溶 液超声波提取；W绿原酸为对照品；W千里光浸膏粉及千里光药材为对照品，照高效液相色 谱法建立指纹图谱，洗脱过程为梯度洗脱。
[0007] 进一步的，上述清热散结胶囊指纹图谱的建立方法:取清热散结胶囊内容物，研细 后用75%甲醇溶液超声波提取，再用0.22WI1~0.45μπι微孔滤头滤过，取滤液；W绿原酸为对 照品，加75%甲醇溶剂溶解；W千里光浸膏粉为对照品，用75%甲醇溶液超声波提取，滤过， 取滤液；W千里光药材为对照药材，用75 %甲醇溶液于75~85°C水浴加热回流提取，滤过， 取滤液，照高效液相色谱法建立指纹图谱，洗脱过程为梯度洗脱。
[000引前述方法中所述高效液相色谱法的色谱条件为:0DS C18色谱柱，流动相A为乙腊， 流动相B为憐酸水溶液，梯度洗脱，流速1.0ml/min，柱溫25~35°C，检测波长:Omin-22化m， 15min-280nm，30min-325nm，40min-360nm。
[0009] 超声处理条件为功率250W，频率50kHz下，超声提取20~40分钟。
[0010] 具体的，前述清热散结胶囊指纹图谱的建立方法如下：
[0011] (a)供试品溶液的制备:取清热散结胶囊内容物0.5~5. Og，充分研细后加入75% 甲醇溶液25~250ml，称定重量，超声处理20~40分钟，取出放冷，用75 %甲醇补足减失的重 量，滤过，取滤液作为供试品溶液，
[0012] 所述超声处理条件为功率250W，频率50kHz下，超声提取20~40分钟；所述滤过为 义用0.22曲1~0.45曲1微孔滤头滤过；
[0013] (b)对照品溶液的配制：
[0014] 绿原酸对照品溶液的配制:精密称取绿原酸对照品适量，加75%甲醇制成每1ml含 绿原酸0. 〇5mg的溶液，作为绿原酸对照品溶液；
[0015] 千里光浸膏粉对照品溶液的配制：取浸膏0.2~Ig，加入75%甲醇溶液10~50ml， 称定重量，超声处理20~40分钟，取出放冷，用75%甲醇补足减失的重量，滤过，取滤液作为 千里光浸膏粉对照品溶液；
[0016] 千里光药材对照品溶液的配制：取千里光药材0.5~5. Og，精密称定，置具塞锥形 瓶中，精密加入75%甲醇25~250ml，称定重量，于75~85°C水浴加热回流1小时，取出放冷， 用75%甲醇补足减失的重量，滤过，取滤液作为千里光药材对照品溶液，
[0017] 所述超声提取条件为功率250W，频率50kHz下，超声提取20~40分钟；所述滤过为 义用0.22曲1~0.45曲1微孔滤头滤过；
[0018] (C)色谱条件为:0DS C18色谱柱，流动相A为乙腊，流动相B为憐酸水溶液，梯度洗 脱，流速 l.Oml/min，柱溫 25 ~35°C，检测波长：0min-220nm，15min-280nm，30min-325nm， 40min-360nm；
[0019] (d)测定:精密吸取供试品溶液、对照品溶液化1，分别注入液相色谱仪，照高效液 相色谱法测定，得到清热散结胶囊的指纹图谱。
[0020] 进一步地，前述清热散结胶囊指纹图谱的方法优选方案如下：
[0021] (a)供试品溶液的制备:取清热散结胶囊内容物Ig，充分研细后加入75%甲醇溶液 50ml，称定重量，超声处理30分钟，取出放冷，用75%甲醇补足减失的重量，滤过，取滤液作 为供试品溶液，超声提取条件为功率250W，频率50曲Z下，超声提取30分钟，
[0022] 所述超声处理条件为功率250W，频率50kHz下，超声提取20~40分钟；所述滤过为 义用0.22曲1~0.45曲1微孔滤头滤过；
[0023] (b)对照品溶液的配制：
[0024] 绿原酸对照品溶液的配制:精密称取绿原酸对照品2.5mg，加75%甲醇50ml充分溶 解，作为绿原酸对照品溶液；
[0025] 千里光浸膏粉对照品溶液的配制：取浸膏0.4g，加入75%甲醇溶液20ml，称定重 量，超声处理30分钟，取出放冷，用75%甲醇补足减失的重量，滤过，取滤液作为千里光浸膏 粉对照品溶液，超声提取条件为功率250W，频率50曲Z下，超声提取30分钟；
[0026] 千里光药材对照品溶液的配制：取千里光药材Ig，精密称定，置具塞锥形瓶中，精 密加入75%甲醇50ml，称定重量，于75~85°C水浴加热回流1小时，取出放冷，用75%甲醇补 足减失的重量，滤过，取滤液作为千里光药材对照品溶液，
[0027] 所述超声处理条件为功率250W，频率50kHz下，超声提取20~40分钟；所述滤过为 义用0.22曲1~0.45曲1微孔滤头滤过；
[0028] (C)色谱条件为:0DS C18色谱柱，流动相A为乙腊，流动相B为0.05%憐酸水溶液， 梯度洗脱，流速 l.Oml/min，柱溫 30°C，检测波长：0min-220nm，15min-280nm，30min-325nm， 40min-360nm；
[0029] (d)测定:精密吸取供试品溶液、对照品溶液化1，分别注入液相色谱仪，照高效液 相色谱法测定，得到清热散结胶囊的指纹图谱。
[0030] 前述方法中千里光浸膏粉的制备方法：
[0031 ]取千里光90g，加水煎煮2次，每次2小时，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度1.18-1.19(25°C)的稠膏，加入相当于稠膏1倍量的乙醇，静置12小时使沉淀，滤过，滤液回收乙 醇，浓缩至相对密度为1.30(80°C)的稠膏，真空干燥，粉碎成细粉，即得浸膏粉。
[0032] 前述方法中所述梯度洗脱的程序W如下体积比浓度配置进行：
[0033]
[0034]
[003引用前述方法建立的指纹图谱中有12特征峰，其中峰7为绿原酸，图谱总长度为 60min。
[0036]上述指纹图谱中所述12个特征共有峰的平均保留时间(min)如下： 「00371
[0038] 与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
[0039] (1)用本发明所提供的方法建立的清热散结胶囊HP1X指纹图谱与对照图谱的相似 度均大于0.9，能有效的表征其质量，有利于全面监控产品的质量。
[0040] (2)指纹图谱注重各特征峰的关联性和指纹图谱的整体面貌特征，避免了清热散 结胶囊质量控制的单一性和片面性，减少了人为处理产品质量达标的可能性。
[0041] (3)本发明基于指纹图谱用特征指标成分控制产品质量，保证了产品质量的长期 稳定性，疗效的安全性和可靠性。
[0042] (4)本发明具有方便、快捷、稳定、精密度高和重现性好等优点，可准确可靠的控制 清热散结胶囊的质量。
【附图说明】
[0043] 图1清热散结胶囊指纹图谱。
[0044] 图2 8批次清热散结胶囊的指纹图谱。
[004引图3绿原酸特征图谱对照图谱。
[0046] 图4千里光浸膏粉特征图谱对照图谱。
[0047] 图5千里光药材特征图谱对照图谱。
【具体实施方式】
[0048] 除非另有定义，本发明使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属技术领域 普通技术人员通常理解的含义相同。通常，本发明使用的命名及下述实验方法都是本领域 公知的或常用的。为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，W 下结合具体实施例，对本发明作进一步的说明。
[0049] 仪器:Waters高效液相色谱仪(Waters2695分离单元，Waters2996二极管阵列检测 器，Empower色谱工作站）；AB104-N万分之一天平(梅特勒-托利多）；AUW2200十万分之一天 平（SHIMADZU岛津）；KQ3200超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；Mi 1 i-Q超纯水仪： (美国Milipore公司）。
[0050] 试药和试剂:清热散结胶囊由江西普正制药有限公司提供(批号：121101、121102、 121103、121104、121201、121202、130702、130703);千里光药材、甲醇(分析纯）、乙腊(色谱 纯）、憐酸(分析纯)均购于市售。
[0051 ]实施例1:清热散结胶囊基于指纹 图谱的质量控制方法
[0052] 供试品溶液的制备：取清热散结胶囊内容物Ig，充分研细后加入75%甲醇溶液 50ml，称定重量，超声处理30分钟，取出放冷，用75%甲醇补足减失的重量，滤过，取滤液作 为供试品溶液；
[0053] 对照品溶液的配制：
[0054] 绿原酸对照品溶液的配制:精密称取绿原酸对照品2.5mg，加75%甲醇50ml充分溶 解，作为绿原酸对照品溶液；
[0055] 千里光浸膏粉对照品溶液的配制：取浸膏0.4g，加入75 %甲醇溶液20ml，称定重 量，超声处理30分钟，取出放冷，用75%甲醇补足减失的重量，滤过，取滤液作为千里光浸膏 粉对照品溶液；
[0056] 千里光药材对照品溶液的配制：取千里光药材Ig，精密称定，置具塞锥形瓶中，精 密加入75%甲醇50ml ml,称定重量，于75~85°C水浴加热回流1小时，取出放冷，用75%甲 醇补足减失的重量，滤过，取滤液作为千里光药材对照品溶液；
[0057] 超声提取条件为:功率250W，频率50kHz;
[0058] 色谱条件为:0DS C18色谱柱，流动相A为乙腊，流动相B为0.05%憐酸水溶液，梯度 洗脱，流速 l.Oml/min，柱溫 25 ~35°C，检测波长：0min-220nm，15min-280nm，30min-325nm， 40min-360nm；
[0059] 梯度洗脱的程序W如下体积比浓度配置进行：
[0060]
[0061] ~测定:精密吸取供试品溶液、对照品溶液扣1，分别注入液相色谱仪，照高效液相色胃 谱法测定，得到清热散结胶囊的指纹图谱。
[0062] 实施例2::清热散结胶囊指纹图谱的建立
[0063] 采用实施例1所述方法测定共8个批次的清热散结胶囊（批号：121101、121102、 121103、121104、121201、121202、130702、130703)，得到8个批次的清热散结胶囊指纹图谱。
[0064] 通过8批次清热散结胶囊HPLC图谱的比较，进行相似度评价:采用《中药色谱指纹 图谱相似度评价系统》2012年版相似度软件，进行相似度评价，清热散结胶囊指纹图谱相似 度研究结果如下表：
[0065] 8个批次清热散结胶囊指纹图谱相似度计算结果
[0066]
[0067] ~上表显示，不同批次清热散结ik囊指纹图谱的相似度大于0.9,说明各批次的样品I 色谱模式相似，其化学成分一致性较好。
[0068] 实施例3:精密度试验
[0069] 取批号121104清热散结胶囊样品，按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液， 连续进样5次，将结果数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012年版相似度软件， 进行分析其结果(如下表)显示相似度在0.95W上，即本方法仪器精密度良好。
[0070]
[0071] ~实施例4:重现性试验
[0072] 取批号130702的清热散结胶囊样品，按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶 液，平行溶液6份连续进样，将结果数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012年版 相似度软件，进行分析其结果(如下表)显示相似度在0.95W上，即本方法重现性良好。
[0073]
[0074] ~实施例5:溶液稳定性试验重现性试验 ' ' ' '
[0075] 取批号121202的清热散结胶囊样品，按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶 液，分别于0、2、4、8、12、24小时后进样，将结果数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系 统》2012年版相似度软件，进行分析其结果(如下表)显示相似度在0.95W上，即供试品溶液 在24小时内稳定。
[0076]
[0077] 应当说明的是，虽然本发明W较佳实施例掲露如上，然其并非用W限定本发明，任 何熟习此项技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，所作的任何修改、等同替换和改进 等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种清热散结胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于清热散结胶囊用甲醇溶液 超声提取，以绿原酸、千里光浸膏粉、千里光药材为对照品，照高效液相色谱法建立指纹图 谱；高效液相色谱法的色谱条件为:ODS C18色谱柱;流动相A为乙腈;流动相B为磷酸水溶 液;检测波长220~360nm;柱温为15~40°C;流速1.0 ml/min;洗脱程序为梯度洗脱。2. 根据权利要求1所述的一种清热散结胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于清 热散结胶囊内容物用75%甲醇溶液超声波提取，滤过，取滤液；以绿原酸为对照品，加75% 甲醇溶剂溶解；以千里光浸膏粉为对照品，用75%甲醇溶液超声波提取，滤过，取滤液；以千 里光药材为对照药材，用75%甲醇溶液加热回流提取，滤过，取滤液，照高效液相色谱法建 立指纹图谱，其中梯度洗脱的程序按下述体积比浓度配置进行： 洗脱时间（min) 流动相A-乙腈 流动相B-0.05%磷酸水溶液 0 5% 95% 8 5% 95% 15 10% 90% 20 10% 90% 30 16% 84% 50 40% 60% 60 50% 50% 70 90% 10%,:3. 根据权利要求2所述的一种清热散结胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于： (a) 供试品溶液的制备:取清热散结胶囊内容物0.5~5. Og，充分研细后加入75 %甲醇 溶液25~250ml，称定重量，超声处理20~40分钟，取出放冷，用75%甲醇补足减失的重量， 滤过，取滤液作为供试品溶液； (b) 对照品溶液的配制： 绿原酸对照品溶液的配制:精密称取绿原酸对照品适量，加75 %甲醇制成每1ml含绿原 酸0.05mg的溶液，作为绿原酸对照品溶液； 千里光浸膏粉对照品溶液的配制：取浸膏〇. 2~I g，加入7 5 %甲醇溶液10~5 0 m 1，称定 重量，超声处理20~40分钟，取出放冷，用75%甲醇补足减失的重量，滤过，取滤液作为千里 光浸膏粉对照品溶液； 千里光药材对照品溶液的配制:取千里光药材0.5~5. Og，精密称定，置具塞锥形瓶中， 精密加入75%甲醇25~250ml，称定重量，水浴加热回流1小时，取出放冷，用75%甲醇补足 减失的重量，滤过，取滤液作为千里光药材对照品溶液； (c) 色谱条件为:ODS C18色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为磷酸水溶液，梯度洗脱，流 速1 · Oml/min，柱温25~35°C，检测波长：0min-220nm，15min_280nm，30min-325nm，40min-360nm； (d) 测定:精密吸取供试品溶液、对照品溶液5μ1，分别注入液相色谱仪，照高效液相色 谱法测定，得到清热散结胶囊的指纹图谱。4. 根据权利要求2所述的一种清热散结胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于： (a) 供试品溶液的制备：取清热散结胶囊内容物Ig，充分研细后加入75 %甲醇溶液 50ml，称定重量，超声处理30分钟，取出放冷，用75%甲醇补足减失的重量，滤过，取滤液作 为供试品溶液； (b) 对照品溶液的配制： 绿原酸对照品溶液的配制：精密称取绿原酸对照品2.5mg，加75%甲醇50ml充分溶解， 作为绿原酸对照品溶液； 千里光浸膏粉对照品溶液的配制：取浸膏〇.4g，加入75%甲醇溶液20ml，称定重量，超 声处理30分钟，取出放冷，用75 %甲醇补足减失的重量，滤过，取滤液作为千里光浸膏粉对 照品溶液； 千里光药材对照品溶液的配制：取千里光药材lg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加 入75 %甲醇50ml，称定重量，水浴加热回流1小时，取出放冷，用75%甲醇补足减失的重量， 滤过，取滤液作为千里光药材对照品溶液； (c) 色谱条件为:ODS C18色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.05%磷酸水溶液，梯度 洗脱，流速 1 · 〇ml/min，柱温 25 ~35°C，检测波长：0min-220nm，15min-280nm，30min-325nm， 40min-360nm； (d) 测定:精密吸取供试品溶液、对照品溶液5μ1，分别注入液相色谱仪，照高效液相色 谱法测定，得到清热散结胶囊的指纹图谱。5. 根据权利要求3或4所述的一种清热散结胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于 供试品溶液和对照品溶液的制备过程中超声提取条件为功率250W，频率50kHz，超声处理20 ~40分钟。6. 根据权利要求3或4所述的一种清热散结胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于 供试品溶液和对照品溶液的制备过程中过滤为采用〇. 22μπι~0.45μπι微孔滤头滤过。7. 根据权利要求3或4所述的一种清热散结胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于 色谱条件中柱温为30°C。8. 根据权利要求3或4所述的一种清热散结胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于 千里光药材对照品溶液的配制过程中水浴加热回流温度为75~85°C。9. 根据权利要求3或4所述的一种清热散结胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于 所述指纹图谱中有12个特征共有峰，其中第7号峰分别为绿原酸，图谱总长度为60min。10. 根据权利要求3或4所述的一种清热散结胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在 于指纹图谱中所述的12个特征共有峰的平均保留时间如下： 峰I:5.2min;峰2:7.8min;峰3:8.2min;峰4:10.Imin;峰5:18.Imin;峰6:20.Imin;峰7: 24.8minJ$8:26.1minJ$9:27.3minJ$10:21.8minJ$ll :50.6minJ$12:56.3min。
【专利摘要】一种清热散结胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，涉及中药制剂质量控制方法。清热散结胶囊用甲醇溶液超声波提取，以绿原酸、千里光浸膏粉、千里光药材为对照品，照高效液相色谱法建立指纹图谱，洗脱程序为梯度洗脱程序。本发明建立的清热散结胶囊指纹图谱与相应的对照图谱进行相似度评价，其相似度大于0.9，能有效的表征产品质量，更有利于监控产品的质量，能更有效的保证产品质量的长期稳定性，进而保障疗效的安全性和有效性。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105486769
【申请号】CN201510906632
【发明人】肖军平, 吴永忠, 陈梁, 杜建松, 陈金德
【申请人】江西普正制药有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月9日
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