小柴胡颗粒复方制剂的指纹图谱检测方法
小柴胡颗粒复方制剂的指纹图谱检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种中药复方制剂检测技术领域，且特别设及一种小柴胡颗粒复方制 剂的指纹图谱检测方法。
【背景技术】
[0002] 小柴胡颗粒复方制剂是由柴胡、黄琴、姜半夏、党参、生姜、甘草和大要经提取精制 而成，具有解表散热，疏肝和胃的功效。用于外感病，邪犯少阳证，症见寒热往来，胸胁苦满， 食欲不振，屯、烦喜呕，口苦咽干。
[0003] 小柴胡颗粒复方制剂目前《中国药典》现行的质量控制鉴别项仅通过黄琴巧、甘草 对照药材和柴胡对照药材进行薄层鉴别，含量测定选择测定其中一种成分黄琴巧；另外现 行的许多文献报道也仅仅是选择其中两Ξ种药材进行指纹鉴别或者薄层鉴别，含量测定则 选择黄琴和柴胡，仍缺乏对产品质量的全面控制。如果只通过控制柴胡或者黄琴药材品质 来说明整个复方制剂的内在质量，是非常片面的。所W现有的质量标准和其他现有技术中 尚无较好较完整的质量控制方法来全面准确的控制产品质量，不能较好的保证其临床疗 效。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种小柴胡颗粒复方制剂的指纹图谱检测方法，W建立完 整的指纹图谱对小柴胡颗粒复方制剂进行了全面的检测，有利于更为全面有效地控制小柴 胡颗粒复方制剂的质量。
[000引本发明解决其技术问题是采用W下技术方案来实现的。
[0006] -种小柴胡颗粒复方制剂的指纹图谱检测方法，其中包括柴胡、黄琴、党参、生姜、 甘草，首先，取黄琴素、黄琴巧、党参烘巧、柴胡皂巧C、汉黄琴素、6-姜辣素、甘草酸锭、柴胡 皂巧A和柴胡皂巧B2配置成对照品混合溶液。其次，取待测试小柴胡颗粒复方制剂提取制成 供试品溶液。再次，吸取对照品混合溶液注入高效液相色谱仪，记录对照色谱图。接着，吸取 供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录供试品色谱图。然后，比较供试品色谱图与对照色 谱图。
[0007] 进一步地，上述所述的指纹图谱检测方法，所述黄琴素、所述黄琴巧、所述党参烘 巧、所述柴胡皂巧C、所述汉黄琴素、所述6-姜辣素、所述甘草酸锭、所述柴胡皂巧A和所述柴 胡皂巧B2通过加入甲醇进行溶解并定容配置成所述对照品混合溶液。
[0008] 小柴胡颗粒复方制剂进一步地，上述所述的指纹图谱检测方法，配置所述供试品 溶液包括:将所述待测试小柴胡颗粒研成细粉，再加入甲醇，进行超声提取，放冷后过滤，将 过滤后的滤液浓缩至干，残渣用甲醇定容溶解，摇匀后离屯、，取上清液为所述供试品溶液。
[0009] 进一步地，上述所述的指纹图谱检测方法，利用所述高效液相色谱仪记录所述对 照色谱图和所述供试品色谱图，W乙腊为流动相A，W甲醇为流动相B，W低浓度酸水为流动 相C，进行梯度洗脱。
[0010] 进一步地，上述所述的指纹图谱检测方法，吸取所述供试品溶液，注入高效液相色 谱仪，记录所述供试品色谱图包括:取多个批次的所述供试品溶液依次进样，得到多个供试 品色谱图；
[0011] 比较所述供试品色谱图与所述对照色谱图包括：W黄琴素峰为参照峰，计算所述 对照色谱图和每个所述供试品色谱图中多个特征峰的相对保留时间，相对峰面积W及峰面 积比值；W及利用所述相对保留时间，相对峰面积W及峰面积比值比较所述对照色谱图与 所述多个供试品色谱图的相似度，用W判定所述待测试小柴胡颗粒复方制剂是否含有所述 活性成分。
[0012] 进一步地，上述所述的指纹图谱检测方法，所述多个供试品色谱图之间对应的相 对保留时间的相对标准偏差小于等于20%。
[0013] 进一步地，上述所述的指纹图谱检测方法，所述指纹图谱检测方法检测小柴胡颗 粒复方制剂相似度应为0.8-1.0时小柴胡颗粒复方制剂。
[0014] 进一步地，上述所述的指纹图谱检测方法，还包括系统适应性，所述系统适应性包 括：
[0015] 取同一所述供试品溶液，连续多次进样，获得多个供试品色谱图，考察所述多个供 试品色谱图的多个色谱峰的保留时间、峰面积的一致性；
[0016] 取同一所述供试品溶液，分别在多个时间检测，获得多个供试品色谱图，考察所述 多个供试品色谱图的多个色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性；W及
[0017] 再取同一批号的所述待测试小柴胡颗粒复方制剂多次配置成的多个所述供试品 溶液检测，获得多个供试品色谱图，考察所述多个供试品色谱图的多个色谱峰的相对保留 时间、峰面积比值的一致性。
[0018] 进一步地，上述所述的指纹图谱检测方法，所述高效液相色谱的色谱柱的柱溫为 25~45摄氏度，流速为0.9~1. Iml/min，检测波长为190nm~400nm。
[0019] 本发明实施例的提供的小柴胡颗粒复方制剂的指纹图谱检测方法的有益效果是： 选用党参烘巧、黄琴巧、汉黄琴素、柴胡皂巧C，6-姜辣素、甘草酸锭、柴胡皂巧A和柴胡皂巧C 作为小柴胡颗粒复方制剂中的柴胡、黄琴、党参、生姜和甘草五种活性成分的指标成分，配 置对照品溶液和供试品溶液来采用高效液相色谱法测试得到对应的对照色谱图和供试品 色谱图，通过比较对照色谱图和供试品色谱图判定供试品溶液是否含有上述九种对照成 分，从而对小柴胡颗粒复方制剂中的五种配方成分做出定性判断，测试过程简单方便，相对 于现有的小柴胡颗粒复方制剂的质量控制鉴别，运种检测方法对小柴胡颗粒复方制剂的检 测更为全面、准确，能够更为有效地控制小柴胡颗粒复方制剂的质量。
【附图说明】
[0020] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附 图作简单地介绍，应当理解，W下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对 范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可W根据运 些附图获得其他相关的附图。
[0021] 图1为本发明实施例的对照品混合溶液与五个批次的供试品溶液的色谱比较图。
【具体实施方式】
[0022] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中 的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建 议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可W通过市售购买获得的常规产 品。
[0023] 中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的具有特征性的某类或者某数 类成分的色谱谱图。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱 对于有效控制中药材或者中成药的质量具有重要的意义。
[0024] 下面对本发明实施例的小柴胡颗粒复方制剂的指纹图谱检测方法进行具体说明。
[0025] 本发明实施例的小柴胡颗粒复方制剂活性成分的指纹图谱检测方法选用党参烘 巧、黄琴素、黄琴巧、汉黄琴素、柴胡皂巧C，6-姜辣素、甘草酸锭、柴胡皂巧A和柴胡皂巧B2作 为小柴胡颗粒复方制剂中的五种配方组成(包括柴胡、黄琴、党参、生姜和甘草）的指标成 分。
[0026] 首先，配置对照品混合溶液：即取黄琴素、黄琴巧、党参烘巧、柴胡皂巧C、汉黄琴 素、6-姜辣素、甘草酸锭、柴胡皂巧A和柴胡皂巧B2配置成对照品混合溶液。
[0027] 具体地，选取其中上述其中一种成分，置于容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度， 配成该种成分的对照品储备溶液。参照上述成分对照品储备溶液的配置方法，分别配置其 他8种成分的对照品储备溶液。在进行指纹图谱检测时，将上述黄琴素、黄琴巧、党参烘巧、 柴胡皂巧C、汉黄琴素、6-姜辣素、甘草酸锭、柴胡皂巧A和柴胡皂巧B2对照品储备溶液等量 混合形成对照品混合溶液，采用配置成的对照品混合溶液进行后续操作。
[0028] 在国家标准的小柴胡颗粒复方制剂中上述九种成分的含量具有一个标准值，因 此，上述黄琴素、黄琴巧、党参烘巧、柴胡皂巧C、汉黄琴素、6-姜辣素、甘草酸锭、柴胡皂巧A 和柴胡皂巧B2对照品溶液的浓度比是按照与国家标准小柴胡颗粒复方制剂中对应的成分 的浓度比的换算值相等来进行配置，使得对照品混合溶液与实际的小柴胡颗粒标准制剂的 条件越接近，最终进行测试供试品中是否含有对应成分的结论更加具有可靠性、科学性。
[0029] 其次，配置供试品溶液:即取待测试小柴胡颗粒复方制剂提取制成供试品溶液。
[0030] 具体地，将待测试小柴胡颗粒复方制剂研磨成细粉，取适量，加入甲醇，进行超声 混合，放置冷却后，对溶液进行过滤，将滤液浓缩至干，浓缩后的残渣再用甲醇溶解并定容。 将上述定容溶解后的溶液摇匀，取适量进行离屯、操作，取上清液，即得供试品溶液。
[0 031] 再次，获取对照色谱图：即吸取对照品混合溶液注入高效液相色谱仪，记录对照色 谱图。
[0032] 本实施例是利用高效液相色谱仪进行检测，检测器为紫外检测器，检测波长190nm ~400皿;流速:0.5~1.5ml/min;色谱柱:十八烷基键合硅胶为填料，柱溫25~45°C。对照色 谱图具有9个特征峰从左往右依次对应党参烘巧，黄琴巧，黄琴素，柴胡皂巧C，汉黄琴素，6-姜辣素，甘草酸锭，柴胡皂巧A，柴胡皂巧B2运9种成分。
[0033] 接着，获取供试品色谱图：即吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录供试品 色谱图。具体地，可W取多个批次的小柴胡颗粒复方制剂多次配置成多个供试品溶液进行 检测。
[0034] 用于检测的高效液相色谱仪的检测器为紫外检测器;检测波长190nm~400皿;流 速:0.5~1.5ml/min;色谱柱:十八烷基键合硅胶为填料;柱溫25~35°C。
[0035] 然后，判定指纹图谱：即比较供试品色谱图与对照色谱图。
[0036] 具体地，通过将供试品色谱图与对照色谱图进行比较，看在供试品色谱图中与对 照色谱图特征峰对应的位置是否有相应的特征峰，即可判定是否含有该种成分物质。
[0037] 但为了保证测试结果的稳定性与科学性W及测试结果的可靠性，还需要进一步比 较多组供试品色谱图的相似度是否满足要求。
[0038] 例如，W黄琴素峰为参照峰，计算各供试品色谱图中12个特征峰的相对保留时间 及相对峰面积和可变范围；输入指纹图谱分析软件，对各批次样品指纹图谱进行相似度比 较，W平均谱图为共有模式，计算相似度，建立小柴胡颗粒复方制剂中柴胡、黄琴、党参、生 姜和甘草的指纹图谱。得到的指纹图谱应同时符合W下要求:检测的小柴胡颗粒复方制剂 的指纹相似度应为0.8~1.0;非共有峰面积不得超过总峰面积的10%;除参照峰外的其他 共有峰与参照峰的相对保留时间之间的相对标准偏差不得超过20%;供试品图谱中各共有 峰面积的比值与指纹图谱各共有峰面积的比值比较，单峰面积占总峰面积大于20%的峰， 其差值不得大于20%。单峰面积占总峰面积大于等于10%而小于20%的峰，其差值不得大 于25%。单峰面积占总峰面积小于10%的峰，其峰面积不做要求。
[0039] 进一步地，此指纹图谱检测方法还包括色谱洗脱程序。
[0040] 具体地，色谱洗脱程序中，高效液相色谱仪的检测器为紫外检测器；检测波长 190皿~400皿;流速:0.5~1.5ml/min;色谱柱:十八烷基键合硅胶为填料;柱溫25~35°C。 色谱洗脱步骤中通过W乙腊为流动相A，W甲醇为流动相B，W〇. 2%憐酸溶液为流动相C，进 行梯度洗脱，随着时间的变化Ξ种组分的百分比随梯度洗脱程序发生变化，如表1所示。
[0041] 表 1
[0042]
[0043] 进一步地，该指纹图谱检测方法还包括系统适应性。
[0044] 系统适应性的检测方法与获取对照色谱图和供试品色谱图相同。系统适应性具体 包括W下步骤。
[004引第一步，取同一供试品溶液，连续多次进样，考察色谱峰的保留时间、峰面积的一 致性。较佳地，在指纹图谱中共有峰面积比值的各色谱峰，其峰面积比值的相对标准偏差 1?50不得大于2%。
[0046]第二步，取同一所述供试品溶液，分别在多个时间检测，获得多个供试品色谱图， 考察所述多个供试品色谱图的多个色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性；W及
[0047] 第Ξ步，再取同一批号的所述待测试小柴胡颗粒复方制剂多次配置成的多个所述 供试品溶液检测，获得多个供试品色谱图，考察所述多个供试品色谱图的多个色谱峰的相 对保留时间、峰面积比值的一致性。
[0048] 较佳地，在指纹图谱中共有峰面积比值的各色谱峰，其峰面积比值的相对标准偏 差不得大于3 %。理论塔板数按黄琴素峰计应不低于5000。
[0049] 通过上述的系统适应性试验，使得在上述的色谱参数条件下对供试品溶液的测试 结果比较稳定，进行调整，使得进行后续检测时，得到的色谱图比较准确客观，更能反映客 观的事实。
[0050] W下结合实施例对本发明的检测方法作进一步的详细描述。
[0051 ]实施例1
[0052] 首先，配置对照品混合溶液:选取黄琴素对照品6. lOmg，置于5mL容量瓶中，用甲醇 溶解并定容至刻度，作为党黄琴素储备液。取黄琴素储备液1.0ml置于10ml容量瓶中，用甲 醇稀释至刻度，配成浓度为〇.122mg/mL的黄琴素对照品储备溶液。参照上述黄琴素对照品 储备溶液的配置方法，分别配置黄琴巧、党参烘巧、柴胡皂巧C、汉黄琴素、6-姜辣素、甘草酸 锭、柴胡皂巧A和柴胡皂巧B2对照品储备溶液，其溶液的浓度依次为0.142mg/ml、0.176mg/ ml、0.143mg/ml、0. lllmg/ml、0.06mg/ml、0.171mg/ml、0.139mg/ml、0.154mg/ml。在进行指 纹图谱检测时，将上述黄琴素、黄琴巧、党参烘巧、柴胡皂巧C、汉黄琴素、6-姜辣素、甘草酸 锭、柴胡皂巧A和柴胡皂巧B2对照品储备溶液等量混合形成对照品混合溶液，采用配置成的 对照品混合溶液进行后续操作。需要说明的是，上述黄琴素、黄琴巧、党参烘巧、柴胡皂巧C、 汉黄琴素、6-姜辣素、甘草酸锭、柴胡皂巧A和柴胡皂巧B2来自成都普思生物科技股份有限 公司。
[0053] 其次，配置供试品溶液:将待测试小柴胡颗粒复方制剂研磨成细粉，取5.Og，加入 20ml甲醇，进行超声混合30min，放置冷却后，对溶液进行过滤，将滤液浓缩至干，残渣再用 甲醇溶解并定容至5ml。将上述定容溶解后的溶液摇匀，取适量Wl20(K)r/min的转速进行离 屯、操作4min，取上清液，即得供试品溶液。本实施例中，选取来自广州白云山光华制药股份 有限公司的5个批次的小柴胡颗粒复方制剂制成5个批次的供试品溶液。
[0054] 其中，高效液相色谱仪的型号为:Waters HPLC;检测器为紫外检测器Photodiode Array Detector 996;柱溫箱：捷岛科技JD-1000;累及自动进样器：Separations Module 2695;软件:Empower Pro2，检测波长210皿;流速：1.0ml/min;色谱柱:十八烷基键合硅胶为 填料;柱溫35°C。色谱洗脱程序中W乙腊为流动相A，W甲醇为流动相B，W0.2 %憐酸溶液为 流动相C，进行梯度洗脱，随着时间的变化Ξ种组分的百分比随梯度洗脱程序发生变化，如 表2所示。
[00巧]表2
[0056]
[0057]
[0058] 进一步地，进行色谱系统的适应性调试。色谱条件与色谱洗脱步骤相同。
[0059] 第一步，取同一供试品溶液，连续多次进样，每次进样lOul，考察色谱峰的保留时 间、峰面积的一致性。较佳地，在指纹图谱中共有峰面积比值的各色谱峰，其峰面积比值的 相对标准偏差RSD不得大于2 %。
[0060] 第二步，取同一供试品溶液，分别在多个不同时间检测，每次进样lOul，考察色谱 峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。较佳地，在检测时间内样品稳定即峰面积相对标 准偏差不得大于2 %。
[0061] 第Ξ步，再取同一批号的供试品多次，每次进样lOul，考察色谱峰的相对保留时 间、峰面积比值的一致性。较佳地，在指纹图谱中共有峰面积比值的各色谱峰，其峰面积比 值的相对标准偏差不得大于3%。理论塔板数按黄琴素峰计应不低于5000。
[0062] 完成色谱系统的适应性调试后，获取对照色谱图：即吸取对照品混合溶液lOul注 入高效液相色谱仪，记录对照色谱图。
[0063] 本实施例是利用高效液相色谱仪进行检测，检测器为紫外检测器，检测波长 210皿;流速：1.0ml/min;色谱柱:十八烷基键合硅胶为填料，柱溫35°C。对照色谱图具有9个 特征峰从左往右依次对应党参烘巧，黄琴巧，黄琴素，柴胡皂巧C，汉黄琴素，6-姜辣素，甘草 酸锭，柴胡皂巧A，柴胡皂巧B2运9种成分。
[0064] 接着，再获取供试品色谱图：即分别吸取5个批次的供试品溶液lOul，依次注入高 效液相色谱仪，记录供试品色谱图。
[0065] 然后，判定指纹图谱：即比较供试品色谱图与对照色谱图。将对照色谱图与供试品 色谱图组合到一个图中进行比较。
[0066] 参考附图1，图1中反应了对照混合溶液与5个批次的供试品溶液的色谱图的组合 比较，图1中从上往下分别为依次为5个批次的 供试品溶液、对照品混合溶液的色谱图，图中 1~12为12个特征峰，峰1为党参烘巧，峰2为黄琴巧，峰6为黄琴素，峰7为柴胡皂巧C，峰8为 汉黄琴素，峰9为6-姜辣素，峰10为甘草酸锭，峰11为柴胡皂巧A，峰12为柴胡皂巧B2,从图中 的对照图谱中，可W明显看出对照混合溶液含有9个特征峰从左往右依次对应党参烘巧，黄 琴巧，黄琴素，柴胡皂巧C，汉黄琴素，6-姜辣素，甘草酸锭，柴胡皂巧A，柴胡皂巧B2运9种成 分，5个批次的供试品色谱图中含有12个特征峰，其中9个特征峰与上述九种成分对应，通过 从组合的色谱图中对比对照混合溶液的色谱图，单独将某一批次的供试品溶液的供试品色 谱图与对照色谱图比较，可W看出5个批次的供试品色谱图中与对照色谱图中特征峰对应 的位置均有相应的特征峰，因此，可得出运5个批次的供试品溶液中含有与对照混合溶液相 同的成分，即运5个批次的小柴胡颗粒复方制剂具有对应的五种配方组分(包括柴胡、黄琴、 党参、生姜和甘草）。
[0067] 但为了保证测试结果的稳定性与科学性W及测试结果的可靠性，还需要进一步比 较多组供试品色谱图的相似度是否满足要求。
[0068] 进一步地，W黄琴素峰为参照峰，计算各供试品色谱图中12个特征峰的相对保留 时间及相对峰面积和可变范围；输入指纹图谱分析软件，对各批次样品指纹图谱进行相似 度比较，W平均谱图为共有模式，计算相似度，建立小柴胡颗粒复方制剂中柴胡、黄琴、党 参、生姜和甘草的指纹图谱。得到的指纹图谱应同时符合W下要求:检测的小柴胡颗粒复方 制剂的指纹相似度应为0.8~1.0;非共有峰面积不得超过总峰面积的10%;除参照峰外的 其他共有峰与参照峰的相对保留时间之间的相对标准偏差不得超过20%;供试品图谱中各 共有峰面积的比值与指纹图谱各共有峰面积的比值比较，单峰面积占总峰面积大于20%的 峰，其差值不得大于20%。单峰面积占总峰面积大于等于10%而小于20%的峰，其差值不得 大于25%。单峰面积占总峰面积小于10%的峰，其峰面积不做要求。
[0069] 只有测试生成的供试品色谱图同时满足上述的要求，上述的色谱图才能作为有效 的色谱图，从而对小该柴胡颗粒制剂是否含有柴胡、黄琴、党参、生姜和甘草的成分进行判 断。
[0070] 分别对5个批次的12个特征峰的相对保留时间及相对峰面积进行计算，结果如表 3、表4。
[0071 ]表3共有峰相对保留时间
[0072]
[0076] 通过上述的表格中的数据可W看出，5个批次的供试溶液的供试品色谱图中的12 个特征峰的相对保留时间均符合指纹图谱的要求即对应的特征峰之间的可变范围小于等 于20%。且其中共有峰相对峰面积峰的可变范围也均符合上述指纹图谱的要求。其中最大 差值为峰2:7.92-11.52，峰5:1.76-2.55。
[0077] 将对照色谱图与供试品色谱图输入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行相似 度比较。
[0078] 表5指纹图谱相似度软件比对数据
[0079]
[0080] 小柴胡颗粒复方制剂通过对5个批次的试品溶液的供试品色谱图之间的相似度进 行比较，其相似度处于0.8~1.0之间，则可W判断5个批次的测量结果比较稳定，在运种色 谱条件下测得的数值是比较可靠有效地，能够非常有效地反应供试品之间的相似性，从而 对小柴胡颗粒复方制剂指纹图谱检测方法的可行性有了较准确的判定
[0081] 综上所述，选用党参烘巧、黄琴巧、汉黄琴素、柴胡皂巧C，6-姜辣素、甘草酸锭、柴 胡皂巧A和柴胡皂巧B2作为小柴胡颗粒复方制剂中的柴胡、黄琴、党参、生姜和甘草五种组 分的指标成分，配置对照品溶液和供试品溶液采用高效液相色谱法测试得到对应的对照色 谱图和供试品色谱图，通过比较对照色谱图和供试品色谱图判定供试品是否含有上述五种 活性成分，从而对小柴胡颗粒复方制剂中的五种组分做出定性判断，测试过程简单方便，相 对于现有的小柴胡颗粒复方制剂的质量控制鉴别，运种检测方法对小柴胡颗粒复方制剂活 性成分的检测更为全面、准确，能够更为有效地控制小柴胡颗粒复方制剂的质量。
[0082] W上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实 施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施 例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的 所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
【主权项】
1. 一种小柴胡颗粒复方制剂的指纹图谱检测方法，所述复方制剂配方组分包括柴胡、 黄芩、党参、生姜、甘草，其特征在于，所述指纹图谱检测方法包括： 取黄芩素、黄芩苷、党参炔苷、柴胡皂苷C、汉黄芩素、6-姜辣素、甘草酸铵、柴胡皂苷A和 柴胡皂苷出配置成对照品混合溶液； 取待测试小柴胡颗粒复方制剂提取制成供试品溶液； 吸取对照品混合溶液注入高效液相色谱仪，记录对照色谱图； 吸取所述供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录供试品色谱图；以及 比较所述供试品色谱图与所述对照色谱图。2. 根据权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述黄芩素、所述黄芩苷、所 述党参炔苷、所述柴胡皂苷C、所述汉黄芩素、所述6-姜辣素、所述甘草酸铵、所述柴胡皂苷A 和所述柴胡皂苷出通过加入甲醇进行溶解并定容配置成所述对照品混合溶液。3. 根据权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，配置所述供试品溶液包括： 将所述待测试小柴胡颗粒研成细粉，再加入甲醇，进行超声提取，再放冷后过滤，将过滤后 的滤液浓缩至干，残渣用甲醇定容溶解，摇匀后离心，取上清液作为所述供试品溶液。4. 根据权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，利用所述高效液相色谱仪记 录所述对照色谱图和所述供试品色谱图，以乙腈为流动相A，以甲醇为流动相B，以低浓度酸 水为流动相C，进行梯度洗脱。5. 根据权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，吸取所述供试品溶液，注入 高效液相色谱仪，记录所述供试品色谱图包括:取多个批次的所述供试品溶液依次进样，得 到多个供试品色谱图； 比较所述供试品色谱图与所述对照色谱图包括：以黄芩素峰为参照峰，计算所述对照 色谱图和每个所述供试品色谱图中多个特征峰的相对保留时间，相对峰面积以及峰面积比 值；以及利用所述相对保留时间，相对峰面积以及峰面积比值比较所述对照色谱图与所述 多个供试品色谱图的相似度，用以判定所述待测试小柴胡颗粒复方制剂是否含有所述活性 成分。6. 根据权利要求5所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述多个供试品色谱图之间 对应的相对保留时间的相对标准偏差小于等于20%。7. 根据权利要求5所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述指纹图谱检测方法检测 小柴胡颗粒复方制剂相似度应为〇. 8-1.0小柴胡颗粒复方制剂。8. 根据权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述指纹图谱检测方法还包 括系统适应性，所述系统适应性包括： 取同一所述供试品溶液，连续多次进样，获得多个供试品色谱图，考察所述多个供试品 色谱图的多个色谱峰的保留时间、峰面积的一致性； 取同一所述供试品溶液，分别在多个时间检测，获得多个供试品色谱图，考察所述多个 供试品色谱图的多个色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性； 再取同一批号的所述待测试小柴胡颗粒复方制剂多次配置成的多个所述供试品溶液 检测，获得多个供试品色谱图，考察所述多个供试品色谱图的多个色谱峰的相对保留时间、 峰面积比值的一致性。9. 根据权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱的色谱柱
【专利摘要】本发明提供了一种小柴胡颗粒复方制剂的指纹图谱检测方法，复方制剂中包含柴胡、黄芩、党参、生姜和甘草。首先，取黄芩素、黄芩苷、党参炔苷、柴胡皂苷C、汉黄芩素、6-姜辣素、甘草酸铵、柴胡皂苷A和柴胡皂苷B2配置成对照品混合溶液。其次，取待测试小柴胡颗粒复方制剂提取制成供试品溶液。再次，吸取对照品混合溶液注入高效液相色谱仪，记录对照色谱图。接着，吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录供试品色谱图。然后，比较供试品色谱图与对照色谱图。此检测方法建立了较完整的指纹图谱检测方法，对小柴胡颗粒复方制剂进行了较全面的检测，可以更为全面有效地控制小柴胡颗粒复方制剂的质量。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105486771
【申请号】CN201510975885
【发明人】肖斌, 赖小红, 文焕松, 白兰辉, 刘丁
【申请人】成都普思生物科技股份有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月23日
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种中药复方制剂检测技术领域，且特别设及一种小柴胡颗粒复方制 剂的指纹图谱检测方法。
【背景技术】
[0002] 小柴胡颗粒复方制剂是由柴胡、黄琴、姜半夏、党参、生姜、甘草和大要经提取精制 而成，具有解表散热，疏肝和胃的功效。用于外感病，邪犯少阳证，症见寒热往来，胸胁苦满， 食欲不振，屯、烦喜呕，口苦咽干。
[0003] 小柴胡颗粒复方制剂目前《中国药典》现行的质量控制鉴别项仅通过黄琴巧、甘草 对照药材和柴胡对照药材进行薄层鉴别，含量测定选择测定其中一种成分黄琴巧；另外现 行的许多文献报道也仅仅是选择其中两Ξ种药材进行指纹鉴别或者薄层鉴别，含量测定则 选择黄琴和柴胡，仍缺乏对产品质量的全面控制。如果只通过控制柴胡或者黄琴药材品质 来说明整个复方制剂的内在质量，是非常片面的。所W现有的质量标准和其他现有技术中 尚无较好较完整的质量控制方法来全面准确的控制产品质量，不能较好的保证其临床疗 效。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种小柴胡颗粒复方制剂的指纹图谱检测方法，W建立完 整的指纹图谱对小柴胡颗粒复方制剂进行了全面的检测，有利于更为全面有效地控制小柴 胡颗粒复方制剂的质量。
[000引本发明解决其技术问题是采用W下技术方案来实现的。
[0006] -种小柴胡颗粒复方制剂的指纹图谱检测方法，其中包括柴胡、黄琴、党参、生姜、 甘草，首先，取黄琴素、黄琴巧、党参烘巧、柴胡皂巧C、汉黄琴素、6-姜辣素、甘草酸锭、柴胡 皂巧A和柴胡皂巧B2配置成对照品混合溶液。其次，取待测试小柴胡颗粒复方制剂提取制成 供试品溶液。再次，吸取对照品混合溶液注入高效液相色谱仪，记录对照色谱图。接着，吸取 供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录供试品色谱图。然后，比较供试品色谱图与对照色 谱图。
[0007] 进一步地，上述所述的指纹图谱检测方法，所述黄琴素、所述黄琴巧、所述党参烘 巧、所述柴胡皂巧C、所述汉黄琴素、所述6-姜辣素、所述甘草酸锭、所述柴胡皂巧A和所述柴 胡皂巧B2通过加入甲醇进行溶解并定容配置成所述对照品混合溶液。
[0008] 小柴胡颗粒复方制剂进一步地，上述所述的指纹图谱检测方法，配置所述供试品 溶液包括:将所述待测试小柴胡颗粒研成细粉，再加入甲醇，进行超声提取，放冷后过滤，将 过滤后的滤液浓缩至干，残渣用甲醇定容溶解，摇匀后离屯、，取上清液为所述供试品溶液。
[0009] 进一步地，上述所述的指纹图谱检测方法，利用所述高效液相色谱仪记录所述对 照色谱图和所述供试品色谱图，W乙腊为流动相A，W甲醇为流动相B，W低浓度酸水为流动 相C，进行梯度洗脱。
[0010] 进一步地，上述所述的指纹图谱检测方法，吸取所述供试品溶液，注入高效液相色 谱仪，记录所述供试品色谱图包括:取多个批次的所述供试品溶液依次进样，得到多个供试 品色谱图；
[0011] 比较所述供试品色谱图与所述对照色谱图包括：W黄琴素峰为参照峰，计算所述 对照色谱图和每个所述供试品色谱图中多个特征峰的相对保留时间，相对峰面积W及峰面 积比值；W及利用所述相对保留时间，相对峰面积W及峰面积比值比较所述对照色谱图与 所述多个供试品色谱图的相似度，用W判定所述待测试小柴胡颗粒复方制剂是否含有所述 活性成分。
[0012] 进一步地，上述所述的指纹图谱检测方法，所述多个供试品色谱图之间对应的相 对保留时间的相对标准偏差小于等于20%。
[0013] 进一步地，上述所述的指纹图谱检测方法，所述指纹图谱检测方法检测小柴胡颗 粒复方制剂相似度应为0.8-1.0时小柴胡颗粒复方制剂。
[0014] 进一步地，上述所述的指纹图谱检测方法，还包括系统适应性，所述系统适应性包 括：
[0015] 取同一所述供试品溶液，连续多次进样，获得多个供试品色谱图，考察所述多个供 试品色谱图的多个色谱峰的保留时间、峰面积的一致性；
[0016] 取同一所述供试品溶液，分别在多个时间检测，获得多个供试品色谱图，考察所述 多个供试品色谱图的多个色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性；W及
[0017] 再取同一批号的所述待测试小柴胡颗粒复方制剂多次配置成的多个所述供试品 溶液检测，获得多个供试品色谱图，考察所述多个供试品色谱图的多个色谱峰的相对保留 时间、峰面积比值的一致性。
[0018] 进一步地，上述所述的指纹图谱检测方法，所述高效液相色谱的色谱柱的柱溫为 25~45摄氏度，流速为0.9~1. Iml/min，检测波长为190nm~400nm。
[0019] 本发明实施例的提供的小柴胡颗粒复方制剂的指纹图谱检测方法的有益效果是： 选用党参烘巧、黄琴巧、汉黄琴素、柴胡皂巧C，6-姜辣素、甘草酸锭、柴胡皂巧A和柴胡皂巧C 作为小柴胡颗粒复方制剂中的柴胡、黄琴、党参、生姜和甘草五种活性成分的指标成分，配 置对照品溶液和供试品溶液来采用高效液相色谱法测试得到对应的对照色谱图和供试品 色谱图，通过比较对照色谱图和供试品色谱图判定供试品溶液是否含有上述九种对照成 分，从而对小柴胡颗粒复方制剂中的五种配方成分做出定性判断，测试过程简单方便，相对 于现有的小柴胡颗粒复方制剂的质量控制鉴别，运种检测方法对小柴胡颗粒复方制剂的检 测更为全面、准确，能够更为有效地控制小柴胡颗粒复方制剂的质量。
【附图说明】
[0020] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附 图作简单地介绍，应当理解，W下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对 范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可W根据运 些附图获得其他相关的附图。
[0021] 图1为本发明实施例的对照品混合溶液与五个批次的供试品溶液的色谱比较图。
【具体实施方式】
[0022] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中 的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建 议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可W通过市售购买获得的常规产 品。
[0023] 中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的具有特征性的某类或者某数 类成分的色谱谱图。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱 对于有效控制中药材或者中成药的质量具有重要的意义。
[0024] 下面对本发明实施例的小柴胡颗粒复方制剂的指纹图谱检测方法进行具体说明。
[0025] 本发明实施例的小柴胡颗粒复方制剂活性成分的指纹图谱检测方法选用党参烘 巧、黄琴素、黄琴巧、汉黄琴素、柴胡皂巧C，6-姜辣素、甘草酸锭、柴胡皂巧A和柴胡皂巧B2作 为小柴胡颗粒复方制剂中的五种配方组成(包括柴胡、黄琴、党参、生姜和甘草）的指标成 分。
[0026] 首先，配置对照品混合溶液：即取黄琴素、黄琴巧、党参烘巧、柴胡皂巧C、汉黄琴 素、6-姜辣素、甘草酸锭、柴胡皂巧A和柴胡皂巧B2配置成对照品混合溶液。
[0027] 具体地，选取其中上述其中一种成分，置于容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度， 配成该种成分的对照品储备溶液。参照上述成分对照品储备溶液的配置方法，分别配置其 他8种成分的对照品储备溶液。在进行指纹图谱检测时，将上述黄琴素、黄琴巧、党参烘巧、 柴胡皂巧C、汉黄琴素、6-姜辣素、甘草酸锭、柴胡皂巧A和柴胡皂巧B2对照品储备溶液等量 混合形成对照品混合溶液，采用配置成的对照品混合溶液进行后续操作。
[0028] 在国家标准的小柴胡颗粒复方制剂中上述九种成分的含量具有一个标准值，因 此，上述黄琴素、黄琴巧、党参烘巧、柴胡皂巧C、汉黄琴素、6-姜辣素、甘草酸锭、柴胡皂巧A 和柴胡皂巧B2对照品溶液的浓度比是按照与国家标准小柴胡颗粒复方制剂中对应的成分 的浓度比的换算值相等来进行配置，使得对照品混合溶液与实际的小柴胡颗粒标准制剂的 条件越接近，最终进行测试供试品中是否含有对应成分的结论更加具有可靠性、科学性。
[0029] 其次，配置供试品溶液:即取待测试小柴胡颗粒复方制剂提取制成供试品溶液。
[0030] 具体地，将待测试小柴胡颗粒复方制剂研磨成细粉，取适量，加入甲醇，进行超声 混合，放置冷却后，对溶液进行过滤，将滤液浓缩至干，浓缩后的残渣再用甲醇溶解并定容。 将上述定容溶解后的溶液摇匀，取适量进行离屯、操作，取上清液，即得供试品溶液。
[0 031] 再次，获取对照色谱图：即吸取对照品混合溶液注入高效液相色谱仪，记录对照色 谱图。
[0032] 本实施例是利用高效液相色谱仪进行检测，检测器为紫外检测器，检测波长190nm ~400皿;流速:0.5~1.5ml/min;色谱柱:十八烷基键合硅胶为填料，柱溫25~45°C。对照色 谱图具有9个特征峰从左往右依次对应党参烘巧，黄琴巧，黄琴素，柴胡皂巧C，汉黄琴素，6-姜辣素，甘草酸锭，柴胡皂巧A，柴胡皂巧B2运9种成分。
[0033] 接着，获取供试品色谱图：即吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录供试品 色谱图。具体地，可W取多个批次的小柴胡颗粒复方制剂多次配置成多个供试品溶液进行 检测。
[0034] 用于检测的高效液相色谱仪的检测器为紫外检测器;检测波长190nm~400皿;流 速:0.5~1.5ml/min;色谱柱:十八烷基键合硅胶为填料;柱溫25~35°C。
[0035] 然后，判定指纹图谱：即比较供试品色谱图与对照色谱图。
[0036] 具体地，通过将供试品色谱图与对照色谱图进行比较，看在供试品色谱图中与对 照色谱图特征峰对应的位置是否有相应的特征峰，即可判定是否含有该种成分物质。
[0037] 但为了保证测试结果的稳定性与科学性W及测试结果的可靠性，还需要进一步比 较多组供试品色谱图的相似度是否满足要求。
[0038] 例如，W黄琴素峰为参照峰，计算各供试品色谱图中12个特征峰的相对保留时间 及相对峰面积和可变范围；输入指纹图谱分析软件，对各批次样品指纹图谱进行相似度比 较，W平均谱图为共有模式，计算相似度，建立小柴胡颗粒复方制剂中柴胡、黄琴、党参、生 姜和甘草的指纹图谱。得到的指纹图谱应同时符合W下要求:检测的小柴胡颗粒复方制剂 的指纹相似度应为0.8~1.0;非共有峰面积不得超过总峰面积的10%;除参照峰外的其他 共有峰与参照峰的相对保留时间之间的相对标准偏差不得超过20%;供试品图谱中各共有 峰面积的比值与指纹图谱各共有峰面积的比值比较，单峰面积占总峰面积大于20%的峰， 其差值不得大于20%。单峰面积占总峰面积大于等于10%而小于20%的峰，其差值不得大 于25%。单峰面积占总峰面积小于10%的峰，其峰面积不做要求。
[0039] 进一步地，此指纹图谱检测方法还包括色谱洗脱程序。
[0040] 具体地，色谱洗脱程序中，高效液相色谱仪的检测器为紫外检测器；检测波长 190皿~400皿;流速:0.5~1.5ml/min;色谱柱:十八烷基键合硅胶为填料;柱溫25~35°C。 色谱洗脱步骤中通过W乙腊为流动相A，W甲醇为流动相B，W〇. 2%憐酸溶液为流动相C，进 行梯度洗脱，随着时间的变化Ξ种组分的百分比随梯度洗脱程序发生变化，如表1所示。
[0041] 表 1
[0042]
[0043] 进一步地，该指纹图谱检测方法还包括系统适应性。
[0044] 系统适应性的检测方法与获取对照色谱图和供试品色谱图相同。系统适应性具体 包括W下步骤。
[004引第一步，取同一供试品溶液，连续多次进样，考察色谱峰的保留时间、峰面积的一 致性。较佳地，在指纹图谱中共有峰面积比值的各色谱峰，其峰面积比值的相对标准偏差 1?50不得大于2%。
[0046]第二步，取同一所述供试品溶液，分别在多个时间检测，获得多个供试品色谱图， 考察所述多个供试品色谱图的多个色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性；W及
[0047] 第Ξ步，再取同一批号的所述待测试小柴胡颗粒复方制剂多次配置成的多个所述 供试品溶液检测，获得多个供试品色谱图，考察所述多个供试品色谱图的多个色谱峰的相 对保留时间、峰面积比值的一致性。
[0048] 较佳地，在指纹图谱中共有峰面积比值的各色谱峰，其峰面积比值的相对标准偏 差不得大于3 %。理论塔板数按黄琴素峰计应不低于5000。
[0049] 通过上述的系统适应性试验，使得在上述的色谱参数条件下对供试品溶液的测试 结果比较稳定，进行调整，使得进行后续检测时，得到的色谱图比较准确客观，更能反映客 观的事实。
[0050] W下结合实施例对本发明的检测方法作进一步的详细描述。
[0051 ]实施例1
[0052] 首先，配置对照品混合溶液:选取黄琴素对照品6. lOmg，置于5mL容量瓶中，用甲醇 溶解并定容至刻度，作为党黄琴素储备液。取黄琴素储备液1.0ml置于10ml容量瓶中，用甲 醇稀释至刻度，配成浓度为〇.122mg/mL的黄琴素对照品储备溶液。参照上述黄琴素对照品 储备溶液的配置方法，分别配置黄琴巧、党参烘巧、柴胡皂巧C、汉黄琴素、6-姜辣素、甘草酸 锭、柴胡皂巧A和柴胡皂巧B2对照品储备溶液，其溶液的浓度依次为0.142mg/ml、0.176mg/ ml、0.143mg/ml、0. lllmg/ml、0.06mg/ml、0.171mg/ml、0.139mg/ml、0.154mg/ml。在进行指 纹图谱检测时，将上述黄琴素、黄琴巧、党参烘巧、柴胡皂巧C、汉黄琴素、6-姜辣素、甘草酸 锭、柴胡皂巧A和柴胡皂巧B2对照品储备溶液等量混合形成对照品混合溶液，采用配置成的 对照品混合溶液进行后续操作。需要说明的是，上述黄琴素、黄琴巧、党参烘巧、柴胡皂巧C、 汉黄琴素、6-姜辣素、甘草酸锭、柴胡皂巧A和柴胡皂巧B2来自成都普思生物科技股份有限 公司。
[0053] 其次，配置供试品溶液:将待测试小柴胡颗粒复方制剂研磨成细粉，取5.Og，加入 20ml甲醇，进行超声混合30min，放置冷却后，对溶液进行过滤，将滤液浓缩至干，残渣再用 甲醇溶解并定容至5ml。将上述定容溶解后的溶液摇匀，取适量Wl20(K)r/min的转速进行离 屯、操作4min，取上清液，即得供试品溶液。本实施例中，选取来自广州白云山光华制药股份 有限公司的5个批次的小柴胡颗粒复方制剂制成5个批次的供试品溶液。
[0054] 其中，高效液相色谱仪的型号为:Waters HPLC;检测器为紫外检测器Photodiode Array Detector 996;柱溫箱：捷岛科技JD-1000;累及自动进样器：Separations Module 2695;软件:Empower Pro2，检测波长210皿;流速：1.0ml/min;色谱柱:十八烷基键合硅胶为 填料;柱溫35°C。色谱洗脱程序中W乙腊为流动相A，W甲醇为流动相B，W0.2 %憐酸溶液为 流动相C，进行梯度洗脱，随着时间的变化Ξ种组分的百分比随梯度洗脱程序发生变化，如 表2所示。
[00巧]表2
[0056]
[0057]
[0058] 进一步地，进行色谱系统的适应性调试。色谱条件与色谱洗脱步骤相同。
[0059] 第一步，取同一供试品溶液，连续多次进样，每次进样lOul，考察色谱峰的保留时 间、峰面积的一致性。较佳地，在指纹图谱中共有峰面积比值的各色谱峰，其峰面积比值的 相对标准偏差RSD不得大于2 %。
[0060] 第二步，取同一供试品溶液，分别在多个不同时间检测，每次进样lOul，考察色谱 峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。较佳地，在检测时间内样品稳定即峰面积相对标 准偏差不得大于2 %。
[0061] 第Ξ步，再取同一批号的供试品多次，每次进样lOul，考察色谱峰的相对保留时 间、峰面积比值的一致性。较佳地，在指纹图谱中共有峰面积比值的各色谱峰，其峰面积比 值的相对标准偏差不得大于3%。理论塔板数按黄琴素峰计应不低于5000。
[0062] 完成色谱系统的适应性调试后，获取对照色谱图：即吸取对照品混合溶液lOul注 入高效液相色谱仪，记录对照色谱图。
[0063] 本实施例是利用高效液相色谱仪进行检测，检测器为紫外检测器，检测波长 210皿;流速：1.0ml/min;色谱柱:十八烷基键合硅胶为填料，柱溫35°C。对照色谱图具有9个 特征峰从左往右依次对应党参烘巧，黄琴巧，黄琴素，柴胡皂巧C，汉黄琴素，6-姜辣素，甘草 酸锭，柴胡皂巧A，柴胡皂巧B2运9种成分。
[0064] 接着，再获取供试品色谱图：即分别吸取5个批次的供试品溶液lOul，依次注入高 效液相色谱仪，记录供试品色谱图。
[0065] 然后，判定指纹图谱：即比较供试品色谱图与对照色谱图。将对照色谱图与供试品 色谱图组合到一个图中进行比较。
[0066] 参考附图1，图1中反应了对照混合溶液与5个批次的供试品溶液的色谱图的组合 比较，图1中从上往下分别为依次为5个批次的 供试品溶液、对照品混合溶液的色谱图，图中 1~12为12个特征峰，峰1为党参烘巧，峰2为黄琴巧，峰6为黄琴素，峰7为柴胡皂巧C，峰8为 汉黄琴素，峰9为6-姜辣素，峰10为甘草酸锭，峰11为柴胡皂巧A，峰12为柴胡皂巧B2,从图中 的对照图谱中，可W明显看出对照混合溶液含有9个特征峰从左往右依次对应党参烘巧，黄 琴巧，黄琴素，柴胡皂巧C，汉黄琴素，6-姜辣素，甘草酸锭，柴胡皂巧A，柴胡皂巧B2运9种成 分，5个批次的供试品色谱图中含有12个特征峰，其中9个特征峰与上述九种成分对应，通过 从组合的色谱图中对比对照混合溶液的色谱图，单独将某一批次的供试品溶液的供试品色 谱图与对照色谱图比较，可W看出5个批次的供试品色谱图中与对照色谱图中特征峰对应 的位置均有相应的特征峰，因此，可得出运5个批次的供试品溶液中含有与对照混合溶液相 同的成分，即运5个批次的小柴胡颗粒复方制剂具有对应的五种配方组分(包括柴胡、黄琴、 党参、生姜和甘草）。
[0067] 但为了保证测试结果的稳定性与科学性W及测试结果的可靠性，还需要进一步比 较多组供试品色谱图的相似度是否满足要求。
[0068] 进一步地，W黄琴素峰为参照峰，计算各供试品色谱图中12个特征峰的相对保留 时间及相对峰面积和可变范围；输入指纹图谱分析软件，对各批次样品指纹图谱进行相似 度比较，W平均谱图为共有模式，计算相似度，建立小柴胡颗粒复方制剂中柴胡、黄琴、党 参、生姜和甘草的指纹图谱。得到的指纹图谱应同时符合W下要求:检测的小柴胡颗粒复方 制剂的指纹相似度应为0.8~1.0;非共有峰面积不得超过总峰面积的10%;除参照峰外的 其他共有峰与参照峰的相对保留时间之间的相对标准偏差不得超过20%;供试品图谱中各 共有峰面积的比值与指纹图谱各共有峰面积的比值比较，单峰面积占总峰面积大于20%的 峰，其差值不得大于20%。单峰面积占总峰面积大于等于10%而小于20%的峰，其差值不得 大于25%。单峰面积占总峰面积小于10%的峰，其峰面积不做要求。
[0069] 只有测试生成的供试品色谱图同时满足上述的要求，上述的色谱图才能作为有效 的色谱图，从而对小该柴胡颗粒制剂是否含有柴胡、黄琴、党参、生姜和甘草的成分进行判 断。
[0070] 分别对5个批次的12个特征峰的相对保留时间及相对峰面积进行计算，结果如表 3、表4。
[0071 ]表3共有峰相对保留时间
[0072]
[0076] 通过上述的表格中的数据可W看出，5个批次的供试溶液的供试品色谱图中的12 个特征峰的相对保留时间均符合指纹图谱的要求即对应的特征峰之间的可变范围小于等 于20%。且其中共有峰相对峰面积峰的可变范围也均符合上述指纹图谱的要求。其中最大 差值为峰2:7.92-11.52，峰5:1.76-2.55。
[0077] 将对照色谱图与供试品色谱图输入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行相似 度比较。
[0078] 表5指纹图谱相似度软件比对数据
[0079]
[0080] 小柴胡颗粒复方制剂通过对5个批次的试品溶液的供试品色谱图之间的相似度进 行比较，其相似度处于0.8~1.0之间，则可W判断5个批次的测量结果比较稳定，在运种色 谱条件下测得的数值是比较可靠有效地，能够非常有效地反应供试品之间的相似性，从而 对小柴胡颗粒复方制剂指纹图谱检测方法的可行性有了较准确的判定
[0081] 综上所述，选用党参烘巧、黄琴巧、汉黄琴素、柴胡皂巧C，6-姜辣素、甘草酸锭、柴 胡皂巧A和柴胡皂巧B2作为小柴胡颗粒复方制剂中的柴胡、黄琴、党参、生姜和甘草五种组 分的指标成分，配置对照品溶液和供试品溶液采用高效液相色谱法测试得到对应的对照色 谱图和供试品色谱图，通过比较对照色谱图和供试品色谱图判定供试品是否含有上述五种 活性成分，从而对小柴胡颗粒复方制剂中的五种组分做出定性判断，测试过程简单方便，相 对于现有的小柴胡颗粒复方制剂的质量控制鉴别，运种检测方法对小柴胡颗粒复方制剂活 性成分的检测更为全面、准确，能够更为有效地控制小柴胡颗粒复方制剂的质量。
[0082] W上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实 施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施 例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的 所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
【主权项】
1. 一种小柴胡颗粒复方制剂的指纹图谱检测方法，所述复方制剂配方组分包括柴胡、 黄芩、党参、生姜、甘草，其特征在于，所述指纹图谱检测方法包括： 取黄芩素、黄芩苷、党参炔苷、柴胡皂苷C、汉黄芩素、6-姜辣素、甘草酸铵、柴胡皂苷A和 柴胡皂苷出配置成对照品混合溶液； 取待测试小柴胡颗粒复方制剂提取制成供试品溶液； 吸取对照品混合溶液注入高效液相色谱仪，记录对照色谱图； 吸取所述供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录供试品色谱图；以及 比较所述供试品色谱图与所述对照色谱图。2. 根据权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述黄芩素、所述黄芩苷、所 述党参炔苷、所述柴胡皂苷C、所述汉黄芩素、所述6-姜辣素、所述甘草酸铵、所述柴胡皂苷A 和所述柴胡皂苷出通过加入甲醇进行溶解并定容配置成所述对照品混合溶液。3. 根据权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，配置所述供试品溶液包括： 将所述待测试小柴胡颗粒研成细粉，再加入甲醇，进行超声提取，再放冷后过滤，将过滤后 的滤液浓缩至干，残渣用甲醇定容溶解，摇匀后离心，取上清液作为所述供试品溶液。4. 根据权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，利用所述高效液相色谱仪记 录所述对照色谱图和所述供试品色谱图，以乙腈为流动相A，以甲醇为流动相B，以低浓度酸 水为流动相C，进行梯度洗脱。5. 根据权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，吸取所述供试品溶液，注入 高效液相色谱仪，记录所述供试品色谱图包括:取多个批次的所述供试品溶液依次进样，得 到多个供试品色谱图； 比较所述供试品色谱图与所述对照色谱图包括：以黄芩素峰为参照峰，计算所述对照 色谱图和每个所述供试品色谱图中多个特征峰的相对保留时间，相对峰面积以及峰面积比 值；以及利用所述相对保留时间，相对峰面积以及峰面积比值比较所述对照色谱图与所述 多个供试品色谱图的相似度，用以判定所述待测试小柴胡颗粒复方制剂是否含有所述活性 成分。6. 根据权利要求5所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述多个供试品色谱图之间 对应的相对保留时间的相对标准偏差小于等于20%。7. 根据权利要求5所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述指纹图谱检测方法检测 小柴胡颗粒复方制剂相似度应为〇. 8-1.0小柴胡颗粒复方制剂。8. 根据权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述指纹图谱检测方法还包 括系统适应性，所述系统适应性包括： 取同一所述供试品溶液，连续多次进样，获得多个供试品色谱图，考察所述多个供试品 色谱图的多个色谱峰的保留时间、峰面积的一致性； 取同一所述供试品溶液，分别在多个时间检测，获得多个供试品色谱图，考察所述多个 供试品色谱图的多个色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性； 再取同一批号的所述待测试小柴胡颗粒复方制剂多次配置成的多个所述供试品溶液 检测，获得多个供试品色谱图，考察所述多个供试品色谱图的多个色谱峰的相对保留时间、 峰面积比值的一致性。9. 根据权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱的色谱柱
【专利摘要】本发明提供了一种小柴胡颗粒复方制剂的指纹图谱检测方法，复方制剂中包含柴胡、黄芩、党参、生姜和甘草。首先，取黄芩素、黄芩苷、党参炔苷、柴胡皂苷C、汉黄芩素、6-姜辣素、甘草酸铵、柴胡皂苷A和柴胡皂苷B2配置成对照品混合溶液。其次，取待测试小柴胡颗粒复方制剂提取制成供试品溶液。再次，吸取对照品混合溶液注入高效液相色谱仪，记录对照色谱图。接着，吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录供试品色谱图。然后，比较供试品色谱图与对照色谱图。此检测方法建立了较完整的指纹图谱检测方法，对小柴胡颗粒复方制剂进行了较全面的检测，可以更为全面有效地控制小柴胡颗粒复方制剂的质量。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105486771
【申请号】CN201510975885
【发明人】肖斌, 赖小红, 文焕松, 白兰辉, 刘丁
【申请人】成都普思生物科技股份有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月23日
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