一种右归丸中多种成分含量的检测方法
一种右归丸中多种成分含量的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种右归丸中多种成分含量的检测方法，属于成分检测领域。
【背景技术】
[0002] 右归丸出自《景岳全书》，其组成和制备方法为"大怀熟地八两，山药(炒）四两，山 荣英(微炒)Ξ两，构杞(微炒）四两，鹿角胶(炒珠）四两，寃丝子(制）四两，杜仲(姜汤炒）四 两，当归Ξ两(便漉勿用），肉桂二两(渐可加至四两），制附子二两(渐可加至五六两）。上先 将熟地蒸烂巧膏，加炼蜜为丸，如梧桐子大"。右归丸被后世广泛应用临床治疗肾阳虚的病 证，并具有确切疗效。
[0003] 目前对右归丸化学成分报道较少，杜丽霞等(杜丽霞，何文智，刘晓阳，王智民，任 艳玲.左_右归丸及其拆方中马钱巧的变化规律.中国实验方剂学杂志，2014,20(21) :56-59)采用HPLC法测定了右归丸中马钱巧的含量，为右归丸的质量控制提供了标准;刘加宝 巧IJ加宝.HPLC法测定右归丸中桂皮醒的含量.黑龙江科学，2014，5 (8): 15-16)通过HPLC法 建立了快速测定右归丸中桂皮醒含量的方法;王丽双（王丽双.中药复方左归丸、右归丸和 济生肾气丸的鉴别和质量评价研究：[硕±学位论文]，山东大学，2011年)建立了红外指纹 图谱、HP1X指纹图谱鉴定方法，对右归丸的质量进行评价。但W上研究仅选取了右归丸中一 个活性成分测定或仅进行定性分析，覆盖范围相对局限，右归丸中其他化学成分尚不清楚， 应用于右归丸的质量评价难免相对片面。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种右归丸中多种成分含量的检测方法。
[0005] 本发明所提供的检测方法，包括如下步骤：
[0006] 1)利用甲醇超声提取右归丸，然后进行滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试 品溶液；
[0007] 2)向所述供试品溶液中加入内标溶液，作为待测样品；
[000引3)采用高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测所述待测样品，即得到右归丸中下述 任一种成分的含量：
[0009] a)新乌头原碱、b)山荣英新巧、C)地黄巧A、d)附子灵、e)宋果灵、f)金丝桃巧、g)苯 甲酯次乌头原碱、h)松果菊巧、i)苯甲酯乌头原碱、j)地黄巧D、k)苯甲酯中乌头原碱、1)尼 奥灵、m)马钱巧、η)多根乌头碱、0)猜芽菜巧和P)莫诺巧。
[0010] 上述的检测方法中，步骤1)中，过滤时得到的前几滴滤液作为初滤液，常弃去，取 0.1~0.2mL即可，后续所得滤液为续滤液，用于测定。
[0011] 上述的检测方法中，步骤1)中，所述甲醇的用量可为:0.1g所述右归丸需要添加1 ~5mL甲醇。
[0012] 上述的检测方法中，步骤1)中，所述超声提取的频率可为20~80KHZ，具体可为 45Ifflz，所述超声提取的时间可为30~60min，具体可为30min;
[001引所述滤膜可为尼龙66膜，所述滤膜的孔径可为ο. 22μπι或ο. 45皿。
[0014] 上述的检测方法中，步骤2)中，
[0015] 所述内标溶液为下螺环酬的甲醇水溶液；
[0016] 所述下螺环酬的用量为：1~5ng/mL所述待测样品。
[0017] 上述的检测方法中，步骤3)中，所述高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测方法中的 色谱条件如下：
[001引流动相A:体积分数为0.05%~0.2%的甲酸的乙腊溶液，具体可为0.1 % ;
[0019] 流动相B:体积分数为0.05%~0.2%的甲酸的水溶液，具体可为0.1 % ;
[0020] 色谱柱:AgilentEclipsePlus-C18色谱柱，柱长为100mm、柱径为2.1mm和填料粒 径为3.如m;
[0021] 柱溫:20~30°C，具体可为25°C;
[0022] 流速:〇.45mL/min;
[0023] 进样体积：10或20μ1^;
[0024] 每个样品的运行时间：12.Omin;
[002引洗脱梯度如下：
[00%] 0-1.5min:流动相A体积分数为98%，流动相B体积分数为2% ;
[0027] 1.5-4min:流动相A体积分数从98%降至55%，流动相B体积分数从2%升至45% ;
[0028] 4-8min:流动相A体积分数从55%降至15%，流动相B体积分数从45%升至85% ;
[0029] 8-9min:流动相A体积分数为15%，流动相B体积分数为85% ;
[0030] 9-9.Olmin:流动相A体积分数从15%升至98%，流动相B体积分数从85%降至2% ; [0031 ] 9-12min:流动相A体积分数为98%，流动相B体积分数为2%。
[0032] 所述高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测步骤中的质谱条件如下：
[0033] 离子源:电喷雾离子化源；
[0034] 质谱工作模式:正离子扫描的MRM检测模式；
[0035] 气帘气、雾化气和满流加热气均使用氮气，其设定值分别为20~30psi、50~60psi 和50~60psi，具体可为20psi、55psi和55psi ;
[0036] 离子源溫度为350~500°C，具体可为500°C;
[0037] 离子源喷射电压为4500~5500V，具体可为5500V。
[0038] 所述右归丸中的16种化合物按编号1-编号16依次为新乌头原碱、山荣英新巧、地 黄巧A、附子灵、宋果灵、金丝桃巧、苯甲酯次乌头原碱、松果菊巧、苯甲酯乌头原碱、地黄巧 D、苯甲酯中乌头原碱、尼奥灵、马钱巧、多根乌头碱、猜芽菜巧和莫诺巧，此16种化合物均具 有很强的正离子信号。
[0039] 其中，编号为1的新乌头原碱的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为486.2;产品离 子定量值(m/z)为436.2;产品离子定性值(m/z)为454.2448，404.2079;去簇电压为250V;碰 撞电压为44eV;碰撞室射出电压为25V。
[0040] 编号为2的山荣英新巧的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为565.1;产品离子定量 值(m/z)为163.3;产品离子定性值(m/z)为403.1011,255.0845;去簇电压为250V;碰撞电压 为39eV;碰撞室射出电压为12V。
[0041] 编号为3的地黄巧A的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为547.1;产品离子定量值 (m/z)为203.1;产品离子定性值(m/z)为385.1115,203.0532;去簇电压为151V;碰撞电压为 44eV;碰撞室射出电压为15V。
[0042] 编号为4的附子灵的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为454.1;产品离子定量值 (m/z)为436.2;产品离子定性值(m/z)为436.2707，418.2600;去簇电压为89V;碰撞电压为 41eV;碰撞室射出电压为25V。
[0043] 编号为5的宋果灵的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为358.2;产品离子定量值 (m/z)为340.2;产品离子定性值(m/z)为340.2280;去簇电压为98V;碰撞电压为35eV;碰撞 室射出电压为20V。
[0044] 编号为6的金丝桃巧的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为487.1;产品离子定量值 (m/z)为185.1;产品离子定性值(m/z)为325.0329,185.0425;去簇电压为100V;碰撞电压为 33eV;碰撞室射出电压为10V。
[0045] 编号为7的苯甲酯次乌头原碱的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为574.2;产品离 子定量值(m/z)为542.2;产品离子定性值(m/z)为542.2766，510.2499;去簇电压为150V;碰 撞电压为41 eV;碰撞室射出电压为15V。
[0046] 编号为8的松果菊巧的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为809.2;产品离子定量值 (m/z)为663.2;产品离子定性值(m/z)为663.1917,501.1384;去簇电压为50V;碰撞电压为 62eV;碰撞室射出电压为15V。
[0047] 编号为9的苯甲酯乌头原碱的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为604.3;产品离子 定量值(m/z)为572.3;产品离子定性值(m/z)为572.2868，554.2764;去簇电压为150V;碰撞 电压为49eV;碰撞室射出电压为15V。
[004引编号为10的地黄巧D的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为709.2;产品离子定量值 (m/z)为3 65.2;产品离子定性值(m/z)为501.1592,365.1068;去簇电压为90V;碰撞电压为 53eV;碰撞室射出电压为25V。
[0049] 编号为11的苯甲酯中乌头原碱的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为590.2;产品 离子定量值(m/z)为540.2;产品离子定性值(m/z)为540.2610，508.2345;去簇电压为70V; 碰撞电压为47eV;碰撞室射出电压为30V。
[0050] 编号为12的尼奥灵的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为438.2;产品离子定量值 (m/z)为420.2;产品离子定性值(m/z)为420.2761，388.2498;去簇电压为60V;碰撞电压为 40eV;碰撞室射出电压为31V。
[0051] 编号为13的马钱巧的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为413.2;产品离子定量值 (m/z)为219.0;产品离子定性值(m/z)为395.1322,251.0896;去簇电压为110V;碰撞电压为 30eV;碰撞室射出电压为12V。
[0052] 编号为14的多根乌头碱的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为378.2;产品离子定 量值(m/z)为360.2;产品离子定性值(m/z)为360.2546，328.2280;去簇电压为60V;碰撞电 压为42eV;碰撞室射出电压为25V。
[0053] 编号为15的猜芽菜巧的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为381.1;产品离子定量 值(m/z)为219.2;产品离子定性值(m/z)为255.0845,219.0633;去簇电压为130V;碰撞电压 为25eV;碰撞室射出电压为15V。
[0054] 编号为16的莫诺巧的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为429.1;产品离子定量值 (m/z)为185. ο;产品离子定性值(m/z)为273.0947，267.0842;去簇电压为160V;碰撞电压为 35eV;碰撞室射出电压为15V。
[0055] 上述检测方法中，步骤3)中，所述高效液相色谱-电喷雾串联质谱化C-ESI-MS/MS) 检测方法具体可通过API SOOOQtrap液相质谱联用系统(含2台岛津LC-20AD累，SIL-20AC恒 溫自动进样器，CT0-20A柱溫箱，CBM-20A控制器，ESI和APCI接口离子源，Analyst Software 1.5.2色谱工作站)来实施，该设备购自美国应用生物系统公司。
[0056] 本发明检测方法是通过如下实现对各种成分的定量检测的：首先配制含有各种成 分的标准品系列溶液，然后加入内标溶液作为供试品，输入至高效液相色谱-电喷雾串联质 谱中，按照所述检测条件进行检测，得到每种成分与内标的峰面积，然后W每种成分与内标 的峰面积的比值作为纵坐标，W每种成分的浓度作为横坐标，制作标准曲线。测定待测样品 时，按照上述方法得到每种成分与内标的峰面积的比值，然后根据所得到的标准曲线就能 得到每种成分的浓度，经换算即得到待测样品中每种成分的含量。
[0057] 本发明建立的LC-ESI-MS/MS化igh-pe;rfo;rmance liquid chromatography coupled with mass spectrome化y)检测方法具有灵敏度高和专属性强的特点，并对20批 不同来源的市售右归丸成药中的16种成分进行了定量测定，覆盖范围广，W期建立系统、全 面的右归丸质量评定方法。
[005引说明书附图
[0059] 图1为采用LC-ESI-MS/MS法同时测定右归丸样品中16种活性成分的代表性色谱 图，其中图1A为16种活性分色谱图全图，图1B为16种活性成分5.5-7.5min局部放大色谱图。
【具体实施方式】
[0060] 下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。
[0061 ]下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法;所述试剂和材料，如 无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0062] 下述实施例中所用的仪器设备如下:API 5000(Hrap液相质谱联用系统(含2台岛 津LC-20AD累，S比-20AC恒溫自动进样器，CT0-20A柱溫箱，CBM-20A控制器，ESI和APCI接口 离子源，Analyst Software 1.5.2色谱工作站），购自美国应用生物系统公司；Biofugel5R 低溫离屯、机，购自德国Heraeus sepatech公司；Agilent Eclipse Plus-ClS色谱柱（100X 2.1mm，3.5皿），购自美国安捷伦科技公司。
[0063] 下述实施例中所用的药物与试剂如下：
[0064] 1) 20批右归丸样品购自北京市各大药店，厂家批号信息见下表1所示：
[0065] 表1. 20批右归丸药材的相关信息
[0066]
[006引2)右归丸中16种测定成分所对应的标准品及其相应编号：
[0069] 新乌头原碱（Mesaconine，成都曼思特生物科技有限公司，四川，中国，批号： A0642，纯度99.08% )，编号为1，结构式如下：
[0070]
[007。 山荣英新巧（Cor-nuside I陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中国，批号： HY0428，纯度98.00% )，编号为2，结构式如下：
[0072]
[0073] 地黄巧A(Rhmannioside A,陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中国，批号： HY0524，纯度98.00% )，编号为3，结构式如下：
[0074]
[0075] 附子灵（Fuziline，陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中国，批号：H0051，纯度 98.00%)，编号为4,结构式如下：
[0076]
[0077] 宋果灵（Songorine，陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中国，批号:朋0125,纯度 98.00% )，编号为5,结构式如下：
[007引
[0079] 金丝桃巧化yperoside，陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中国，批号:HA0410,纯 度98.00% )，编号为6,结构式如下：
[0080]
[0081 ] 苯甲酯次乌头原碱(Benzoy化ypaconitine，陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中 国，批号:HY040，纯度98.00% )，编号为7，结构式如下：
[0082]
[0083] 松果菊巧化chinacoside，上海永恒生物科技有限公司，上海，中国，批号： 20140521，纯度99.08% )，编号为8，结构式如下：
[0084]
[00化]苯甲酯乌头原碱(Benzoylaconitine，陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中国，批 号:HY039，纯度98.00% )，编号为9，结构式如下：
[0086]
[0087] 地黄巧D(Rhmannioside D，陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中国，批号： HY0255，纯度98.00% )，编号为10，结构式如下：
[008引
[0089] 苯甲酯中乌头原碱(Benzoylmesaconitine，陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中 国，批号:HY038,纯度98.00%)，编号为11，结构式如下：
[0090]
[0091] 尼奥灵（Neoline，陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中国，批号：册055,纯度 98.00%)，编号为12,结构式如下：
[0092]
[0093] 马钱巧化oganin，陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中国，批号：肌0613,纯度 98.00%)，编号为13,结构式如下：
[0094]
[0095] 多根乌头碱化aracoline，陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中国，批号:HB050， 纯度98.00%)，编号为14,结构式如下：
[0096]
[0097] 猜芽菜巧（Sweroside，陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中国，批号:HB0657,纯 度98.00% )，编号为15,结构式如下：
[009引
[0099] 莫诺巧(Morroniside,陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中国，批号:皿0428,纯 度98.00% )，编号为16,结构式如下：
[0100]
[0101] 色谱级乙腊和甲醇均购自赛默飞世尔公司；
[0102] 色谱级甲酸购自德国默克公司。
[0103] 实施例1、测定右归丸中16种测定成分
[ 0104] 1)配制标准品溶液:精密称取16种标准品适量，分别W二甲基亚讽(DMS0)溶解，均 配制成浓度为1. OOmg/mL的单独标准储备液；
[0105] 分别精密量取上述标准储备液适量(量取体积取决于各化合物的质谱响应），置于 同一个1.5mL EP管中，加甲醇稀释，获得混合标准储备液，其中，含各化合物的浓度如下:新 乌头原碱200ng/mL、山荣英新巧500ng/mL、地黄巧A 200ng/mL、附子灵200ng/mL、宋果灵 200ng/mL、金丝桃巧50化g/mL、苯甲酯次乌头原碱20化g/mL、莫诺巧1 OOOng/mL、苯甲酯乌头 原碱200ng/mL、地黄巧D 500ng/mL、苯甲酯中乌头原碱500ng/mL、尼奥灵500ng/mL、马钱巧 lOOOng/mL、多根乌头碱lOOng/mL、猜芽菜巧200ng/mL、莫诺巧2000ng/血。再取上述混合标 准储备液，W甲醇进行系列稀释，配制成同时含有16种活性成分的混合标准系列溶液。
[0106] 内标溶液(5ng/mL下螺环酬）：精密称取盐酸下螺环酬对照品适量，W甲醇溶解并 稀释，配制成浓度为O.lmg/mL的胆备液游离型药物计）。精密量取下螺环酬内标储备液 1化L，置于一玻璃容器中，加 50 %甲醇溶液稀释至200mL，即获得含下螺环酬5ng/mL的内标 溶液。
[0107] 2)待测右归丸样品处理:分别取表1中的20批不同来源的右归丸样品，各精密称取 lOOmg，加甲醇溶液ImL，超声提取两次，每次30min，冷却至室溫，补加甲醇溶液至1血，0.4化 m微孔滤膜过滤，弃去0.山L滤液作为初滤液，取续滤液，即得供试品溶液。取15化L上述供试 品溶液，准确加入15化L内标溶液(5ng/mL下螺环酬），满旋混匀，即得到待测右归丸溶液样 品。
[0108] 3)对待测右归丸溶液样品进行检测：
[0109] (a)色谱检测条件如下:流动相A为含0.1%甲酸的乙腊溶液，流动相B为0.1%甲酸 水溶液，洗脱梯度参见表2。色谱柱为Agilent Eclipse P1US-C18色谱柱(2.1X100mm，3.5y m)，柱溫为室溫，流速为0.45mL/min;进样体积为10化。每个样品的运行时间为12. Omin。
[0110] 表2 HPLC分离所用流动相的洗脱梯度
[0111]
[0112] (b)质谱检测条件如下:经考察，16种化合物均具有很强的正离子信号。最终采用 电喷雾离子化源化SI离子化源），正离子扫描的MRM检测模式（多反应检测扫描，multi reaction monitoring)，16种待测化合物和内标的相应质谱参数如表3所示。
[0113] ESI源在正离子模式下进行扫描，气帘气(CUR)、雾化气(肥B)和满流加热气均使用 氮气，其设定值分别为20、55和55psi。离子源溫度(TEM)设定为500°C，正离子模式下的源喷 射电压设定为5500VdMRM模式下每个通道的滞留时间设定为150ms。
[0114] 表3.右归丸样品中16种活性成分W及内标下螺环酬测定的质谱工作参数
[0115]
[0117] ΝΑ:未检测到.
[0118] *:分子离子峰为[M+Nar.
[0119] IS(internal s1:andard)表示内标物.
[0120] 按照上述的色谱条件和质谱条件检测利用表1中的20批不同来源的右归丸样品所 制备的待测右归丸溶液样品。
[0121] 4)检测结果如下：
[0122] (a)选择性:取20批待测右归丸溶液样品中的第14批，按照步骤3)中的检测条件分 别进样测定，结果见图1。结果表明：基质中的共存成分均不干扰16种活性成分的测定，并且 16种活性成分彼此之间互不干扰，证明该检测方法的选择性良好。
[0123] 图1为采用LC-ESI-MS/MS法同时测定右归丸样品中16种活性成分的代表性色谱 图，其中图1A为16种活性分色谱图全图，图1B为16种活性成分5.5-7.5min局部放大色谱图， 1-地黄巧D，2-地黄巧A，3-新乌头原碱，4-多根乌头碱，5-莫诺巧，6-附子灵，7-宋果灵，8-松 果菊巧，9-尼奥灵，10-马钱巧，11-猜牙菜巧，12-金丝桃巧，13-山荣英新巧，14-苯甲酯中乌 头原碱，15-苯甲酯乌头原碱，16-苯甲酯次乌头原碱。
[0124] (b)线性范围、检测限和定量限：取步骤1)中的混合标准系列溶液，按步骤2)中的 样品处理方法处理后，按照步骤3)中的检测条件进样测定，分别W每种成分与内标峰面积 的比值对其浓度作线性回归，权重因子为1/x 2,得到相应的回归方程。16种活性成分的回归 方程和线性范围如下表4所示：
[0125] 分别量取步骤1)中的16种混合标准储备液适量，W甲醇：水（1:1，v/v)溶解并稀 释，按照步骤3)中的检测条件进样测定，记录色谱图。W峰响应值为基线噪音的10倍(信噪 比的10倍)时的进样浓度为定量限化〇Q);W峰响应值为基线噪音的3倍(信噪比的3倍)时的 进样浓度为检测限(L0D)。具体结果如下表4所示：
[0126] 表4.右归丸样品中16种化合物的回归方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限
[0127]
[01 %] y:各对照品峰面积与内标峰面积的比值.
[0129] X:对照品浓度
[0130] (C)精密度和准确度
[0131] 基于各化合物的线性范围，分别选定低、中和高3个水平的步骤1)中的混合标准系 列溶液(混标溶液），于24小时内按照步骤3)中的检测条件进样测定6次，计算各化合物的日 内精密度;取同样的步骤1)中的混合标准系列溶液(混标溶液），每天按照步骤3)中的检测 条件进样测定6次，连续测定3天，计算各化合物的日间精密度。精密度与准确度测定结果如 表5所示。由表5可知:各化合物的日内和日间精密度（WRSD值表示）均不超过15%，准确度 (WRE值表示)均不超过±15%，符合方法学验证的相关指导原则要求。
[0132] 表5.采用LC-ESI-MS/MS法测定右归丸中16种活性成分的日内和日间精密度及准 确度结果(n = 6)
[0133]
[0134]
[0135]
[0136] (d)重复性:取适当浓度的步骤1)中的混合标准系列溶液(混标溶液），按照步骤3) 中的检测条件连续进样6次，测得各化合物的峰面积，并计算相应的RSD值。结果表明：各化 合物的RSD值均不超过5%，表明此方法重复性好，符合方法学验证的相关指导原则要求，结 果见表6。
[0137] 表6采用LC-ESI-MS/MS法测定右归丸中16种活性成分的重复性实验结果(n = 6) [013 引
[0139] (e)稳定性:取适当浓度的步骤1)中的混合标准系列溶液(混标溶液），于室溫条件 下放置，分别于0、2、4、8、12、24、48、7化按照步骤3)中的检测条件取样测定，并计算相应尺50 值。结果表明：各化合物的RSD值值均不超过5%，表明16种化合物在当前检测条件下均具有 良好的稳定性，结果见表7。
[0140] 表7采用LC-ESI-MS/MS法测定右归丸中16种活性成分的稳定性实验结果
[0141]
[0142]
[0143] (f)回收率:取各化合物含量已知的实际样品(样品-09)，分别精密加入低(加入的 相应化合物的量为样品-09中相应化合物质量的80% )、中（加入的相应化合物的量为样品-09中相应化合物质量的100 % )、高(加入的相应化合物的量为样品-09中相应化合物质量的 120% )3个水平的步骤1)中相应的单独标准储备液，按步骤2)中的样品处理方法处理后按 照步骤3)中的检测条件进样测定，并求出相应回收率及RSD值。测试结果如表8所示，从表8 可得知:各化合物的回收率介于85-115%范围内，各化合物的RSD值均不超过15%，符合方 法学验证的相关指导原则要求。
[0144] 表8.采用LC-ESI-MS/MS法测定右归丸中15种活性成分的加样回收率结果(n = 6)
[0145]
[0146]
[0147] (g)表1中的20批不同来源的右归丸样品的分析：按步骤2)中的样品处理方法处 理，并按步骤3)中的色谱条件和质谱条件利用表1中的20批不同来源的右归丸样品所制备 的待测右归丸溶液样品进样测定，测定结果如表9所示：
[0148] 表9. 20批右归丸样品中16种化合物的实测浓度(mg/g)
[0149]
[0150]
【主权项】
1 . 一种右归丸中多种成分含量的检测方法，包括如下步骤： 1) 利用甲醇超声提取右归丸，然后进行滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶 液； 2) 向所述供试品溶液中加入内标溶液，作为待测样品； 3) 采用高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测所述待测样品，即得到右归丸中下述任一 种成分的含量： a)新乌头原碱、b)山茱萸新苷、c)地黄苷A、d)附子灵、e)宋果灵、f)金丝桃苷、g)苯甲酰 次乌头原碱、h)松果菊苷、i)苯甲酰乌头原碱、j)地黄苷D、k)苯甲酰中乌头原碱、1)尼奥灵、 m)马钱苷、η)多根乌头碱、〇)猜芽菜苷和p)莫诺苷。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:步骤1)中，所述甲醇的用量为:0.1g所 述右归丸需要添加1~5mL甲醇。3. 根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于:步骤1)中，所述超声提取的频率为 20~80KHz，所述超声提取的时间为30~60min; 所述滤膜为尼龙66膜，所述滤膜的孔径为0.22μπι或0.45μπι。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的检测方法，其特征在于:步骤2)中，所述内标溶液 为丁螺环酮的甲醇水溶液； 所述丁螺环酮的用量为：1~5ng/mL所述待测样品。5. 根据权利要求1-4中任一项所述的检测方法，其特征在于:步骤3)中，所述高效液相 色谱-电喷雾串联质谱检测步骤中的色谱条件如下： 流动相A:体积分数为0.05 %~0.2 %的甲酸的乙腈溶液； 流动相B:体积分数为0.05 %~0.2 %的甲酸的水溶液； 色谱柱:AgilentEclipsePlus_C18色谱柱，柱长为100mm、柱径为2.1mm和填料粒径为 3.5μπι； 柱温：20~30°C; 流速:〇 · 45mL/min; 进样体积：1〇或20yL; 每个样品的运行时间：12.Omin; 洗脱梯度如下： 0-1.5min:流动相A体积分数为98 %，流动相B体积分数为2 % ; 1.5-4min:流动相A体积分数从98 %降至55 %，流动相B体积分数从2 %升至45 % ; 4-8min:流动相A体积分数从55%降至15%，流动相B体积分数从45%升至85% ; 8- 9min:流动相A体积分数为15%，流动相B体积分数为85% ; 9- 9.Olmin:流动相A体积分数从15%升至98%，流动相B体积分数从85%降至2% ; 9-12min:流动相A体积分数为98 %，流动相B体积分数为2 %。6. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于:步骤3)中，所述高效液相色谱-电喷雾 串联质谱检测步骤中的质谱条件如下： 离子源：电喷雾离子化源； 质谱工作模式:正离子扫描的MRM检测模式； 气帘气、雾化气和涡流加热气均使用氮气，其设定值分别为20~30psi、50~60psi和50 ~60psi; 离子源温度为350~500°C; 尚子源喷射电压为4500~5500V。7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于:步骤3)中，所述高效液相色谱-电喷雾 串联质谱检测步骤中，各成分的质谱条件如下： 1) 所述新乌头原碱的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为486.2;产品离子定量值(m/z) 为436.2;产品离子定性值(m/z)为454.2448，404.2079;去簇电压为250V;碰撞电压为44eV; 碰撞室射出电压为25V; 2) 所述山茱萸新苷的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为565.1;产品离子定量值(m/z) 为163.3;产品离子定性值(m/z)为403.1011，255.0845;去簇电压为250V;碰撞电压为39eV; 碰撞室射出电压为12V; 3) 所述地黄苷A的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为547.1;产品离子定量值(m/z)为 203.1;产品离子定性值(m/z)为385.1115,203.0532;去簇电压为151￥;碰撞电压为446￥;碰 撞室射出电压为15V; 4) 所述附子灵的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为454.1;产品离子定量值(m/z)为 436.2;产品离子定性值(!11/2)为436.2707,418.2600;去簇电压为89￥ ;碰撞电压为416￥;碰 撞室射出电压为25V; 5) 所述宋果灵的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为358.2;产品离子定量值(m/z)为 340.2;产品离子定性值(m/z)为340.2280;去簇电压为98V;碰撞电压为35eV;碰撞室射出电 压为20V; 6) 所述金丝桃苷的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为487.1;产品离子定量值(m/z)为 185.1;产品离子定性值(m/z)为325.0329，185.0425;去簇电压为100V;碰撞电压为33eV;碰 撞室射出电压为10V; 7) 所述苯甲酰次乌头原碱的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为574.2;产品离子定量 值(m/z)为542.2;产品离子定性值(m/z)为542.2766,510.2499;去簇电压为150V;碰撞电压 为41eV;碰撞室射出电压为15V; 8) 所述松果菊苷的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为809.2;产品离子定量值(m/z)为 663.2;产品离子定性值(!11/2)为663.1917,501.1384;去簇电压为50￥ ;碰撞电压为626￥;碰 撞室射出电压为15V; 9) 所述苯甲酰乌头原碱的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为604.3;产品离子定量值 (m/z)为572.3;产品离子定性值(m/z)为572.2868，554.2764;去簇电压为150V;碰撞电压为 49eV;碰撞室射出电压为15V; 10) 所述地黄苷D的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为709.2;产品离子定量值(m/z)为 365.2;产品离子定性值(!11/2)为501.1592,365.1068;去簇电压为90￥ ;碰撞电压为536￥;碰 撞室射出电压为25V; 11) 所述苯甲酰中乌头原碱的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为590.2;产品离子定量 值(m/z)为540.2;产品离子定性值(m/z)为540.2610，508.2345;去簇电压为70V;碰撞电压 为47eV;碰撞室射出电压为30V; 12) 所述尼奥灵的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为438.2;产品离子定量值(m/z)为 420.2;产品离子定性值(m/z)为420.2761，388.2498;去簇电压为60V;碰撞电压为40eV;碰 撞室射出电压为31V; 13) 所述马钱苷的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为413.2;产品离子定量值(m/z)为 219.0;产品离子定性值(m/z)为395.1322,251.0896;去簇电压为110￥;碰撞电压为3(^ ;碰 撞室射出电压为12V; 14) 所述多根乌头碱的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为378.2;产品离子定量值(m/ z)为360.2 ;产品离子定性值(m/z)为360.2546，328.2280 ;去簇电压为60V;碰撞电压为 42eV;碰撞室射出电压为25V; 15) 所述獐芽菜苷的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为381.1;产品离子定量值(m/z) 为219.2;产品离子定性值(m/z)为255.0845，219.0633;去簇电压为130V;碰撞电压为25eV; 碰撞室射出电压为15V; 16) 所述16的莫诺苷的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为429.1;产品离子定量值(m/ z)为185.0;产品离子定性值(m/z)为273.0947,267.0842;去簇电压为160V;碰撞电压为 35eV;碰撞室射出电压为15V。
【专利摘要】本发明公开了一种右归丸中多种成分含量的检测方法。所述检测方法包括如下步骤：1)利用甲醇超声提取右归丸，然后进行滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液；2)向所述供试品溶液中加入内标溶液，作为待测样品；3)采用高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测所述待测样品，即得到右归丸中下述任一种成分的含量。本发明建立的LC-ESI-MS/MS(high-performance？liquid？chromatography？coupled？with？mass？spectrometry)检测方法具有灵敏度高和专属性强的特点，并对20批不同来源的市售右归丸成药中的16种成分进行了定量测定，覆盖范围广，以期建立系统、全面的右归丸质量评定方法。
【IPC分类】G01N30/02, G01N30/06
【公开号】CN105486775
【申请号】CN201610011285
【发明人】王蕾, 刘浩龙, 仇峰, 赵晖, 邹海艳, 杨鑫伟
【申请人】首都医科大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年1月8日
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种右归丸中多种成分含量的检测方法，属于成分检测领域。
【背景技术】
[0002] 右归丸出自《景岳全书》，其组成和制备方法为"大怀熟地八两，山药(炒）四两，山 荣英(微炒)Ξ两，构杞(微炒）四两，鹿角胶(炒珠）四两，寃丝子(制）四两，杜仲(姜汤炒）四 两，当归Ξ两(便漉勿用），肉桂二两(渐可加至四两），制附子二两(渐可加至五六两）。上先 将熟地蒸烂巧膏，加炼蜜为丸，如梧桐子大"。右归丸被后世广泛应用临床治疗肾阳虚的病 证，并具有确切疗效。
[0003] 目前对右归丸化学成分报道较少，杜丽霞等(杜丽霞，何文智，刘晓阳，王智民，任 艳玲.左_右归丸及其拆方中马钱巧的变化规律.中国实验方剂学杂志，2014,20(21) :56-59)采用HPLC法测定了右归丸中马钱巧的含量，为右归丸的质量控制提供了标准;刘加宝 巧IJ加宝.HPLC法测定右归丸中桂皮醒的含量.黑龙江科学，2014，5 (8): 15-16)通过HPLC法 建立了快速测定右归丸中桂皮醒含量的方法;王丽双（王丽双.中药复方左归丸、右归丸和 济生肾气丸的鉴别和质量评价研究：[硕±学位论文]，山东大学，2011年)建立了红外指纹 图谱、HP1X指纹图谱鉴定方法，对右归丸的质量进行评价。但W上研究仅选取了右归丸中一 个活性成分测定或仅进行定性分析，覆盖范围相对局限，右归丸中其他化学成分尚不清楚， 应用于右归丸的质量评价难免相对片面。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种右归丸中多种成分含量的检测方法。
[0005] 本发明所提供的检测方法，包括如下步骤：
[0006] 1)利用甲醇超声提取右归丸，然后进行滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试 品溶液；
[0007] 2)向所述供试品溶液中加入内标溶液，作为待测样品；
[000引3)采用高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测所述待测样品，即得到右归丸中下述 任一种成分的含量：
[0009] a)新乌头原碱、b)山荣英新巧、C)地黄巧A、d)附子灵、e)宋果灵、f)金丝桃巧、g)苯 甲酯次乌头原碱、h)松果菊巧、i)苯甲酯乌头原碱、j)地黄巧D、k)苯甲酯中乌头原碱、1)尼 奥灵、m)马钱巧、η)多根乌头碱、0)猜芽菜巧和P)莫诺巧。
[0010] 上述的检测方法中，步骤1)中，过滤时得到的前几滴滤液作为初滤液，常弃去，取 0.1~0.2mL即可，后续所得滤液为续滤液，用于测定。
[0011] 上述的检测方法中，步骤1)中，所述甲醇的用量可为:0.1g所述右归丸需要添加1 ~5mL甲醇。
[0012] 上述的检测方法中，步骤1)中，所述超声提取的频率可为20~80KHZ，具体可为 45Ifflz，所述超声提取的时间可为30~60min，具体可为30min;
[001引所述滤膜可为尼龙66膜，所述滤膜的孔径可为ο. 22μπι或ο. 45皿。
[0014] 上述的检测方法中，步骤2)中，
[0015] 所述内标溶液为下螺环酬的甲醇水溶液；
[0016] 所述下螺环酬的用量为：1~5ng/mL所述待测样品。
[0017] 上述的检测方法中，步骤3)中，所述高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测方法中的 色谱条件如下：
[001引流动相A:体积分数为0.05%~0.2%的甲酸的乙腊溶液，具体可为0.1 % ;
[0019] 流动相B:体积分数为0.05%~0.2%的甲酸的水溶液，具体可为0.1 % ;
[0020] 色谱柱:AgilentEclipsePlus-C18色谱柱，柱长为100mm、柱径为2.1mm和填料粒 径为3.如m;
[0021] 柱溫:20~30°C，具体可为25°C;
[0022] 流速:〇.45mL/min;
[0023] 进样体积：10或20μ1^;
[0024] 每个样品的运行时间：12.Omin;
[002引洗脱梯度如下：
[00%] 0-1.5min:流动相A体积分数为98%，流动相B体积分数为2% ;
[0027] 1.5-4min:流动相A体积分数从98%降至55%，流动相B体积分数从2%升至45% ;
[0028] 4-8min:流动相A体积分数从55%降至15%，流动相B体积分数从45%升至85% ;
[0029] 8-9min:流动相A体积分数为15%，流动相B体积分数为85% ;
[0030] 9-9.Olmin:流动相A体积分数从15%升至98%，流动相B体积分数从85%降至2% ; [0031 ] 9-12min:流动相A体积分数为98%，流动相B体积分数为2%。
[0032] 所述高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测步骤中的质谱条件如下：
[0033] 离子源:电喷雾离子化源；
[0034] 质谱工作模式:正离子扫描的MRM检测模式；
[0035] 气帘气、雾化气和满流加热气均使用氮气，其设定值分别为20~30psi、50~60psi 和50~60psi，具体可为20psi、55psi和55psi ;
[0036] 离子源溫度为350~500°C，具体可为500°C;
[0037] 离子源喷射电压为4500~5500V，具体可为5500V。
[0038] 所述右归丸中的16种化合物按编号1-编号16依次为新乌头原碱、山荣英新巧、地 黄巧A、附子灵、宋果灵、金丝桃巧、苯甲酯次乌头原碱、松果菊巧、苯甲酯乌头原碱、地黄巧 D、苯甲酯中乌头原碱、尼奥灵、马钱巧、多根乌头碱、猜芽菜巧和莫诺巧，此16种化合物均具 有很强的正离子信号。
[0039] 其中，编号为1的新乌头原碱的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为486.2;产品离 子定量值(m/z)为436.2;产品离子定性值(m/z)为454.2448，404.2079;去簇电压为250V;碰 撞电压为44eV;碰撞室射出电压为25V。
[0040] 编号为2的山荣英新巧的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为565.1;产品离子定量 值(m/z)为163.3;产品离子定性值(m/z)为403.1011,255.0845;去簇电压为250V;碰撞电压 为39eV;碰撞室射出电压为12V。
[0041] 编号为3的地黄巧A的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为547.1;产品离子定量值 (m/z)为203.1;产品离子定性值(m/z)为385.1115,203.0532;去簇电压为151V;碰撞电压为 44eV;碰撞室射出电压为15V。
[0042] 编号为4的附子灵的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为454.1;产品离子定量值 (m/z)为436.2;产品离子定性值(m/z)为436.2707，418.2600;去簇电压为89V;碰撞电压为 41eV;碰撞室射出电压为25V。
[0043] 编号为5的宋果灵的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为358.2;产品离子定量值 (m/z)为340.2;产品离子定性值(m/z)为340.2280;去簇电压为98V;碰撞电压为35eV;碰撞 室射出电压为20V。
[0044] 编号为6的金丝桃巧的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为487.1;产品离子定量值 (m/z)为185.1;产品离子定性值(m/z)为325.0329,185.0425;去簇电压为100V;碰撞电压为 33eV;碰撞室射出电压为10V。
[0045] 编号为7的苯甲酯次乌头原碱的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为574.2;产品离 子定量值(m/z)为542.2;产品离子定性值(m/z)为542.2766，510.2499;去簇电压为150V;碰 撞电压为41 eV;碰撞室射出电压为15V。
[0046] 编号为8的松果菊巧的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为809.2;产品离子定量值 (m/z)为663.2;产品离子定性值(m/z)为663.1917,501.1384;去簇电压为50V;碰撞电压为 62eV;碰撞室射出电压为15V。
[0047] 编号为9的苯甲酯乌头原碱的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为604.3;产品离子 定量值(m/z)为572.3;产品离子定性值(m/z)为572.2868，554.2764;去簇电压为150V;碰撞 电压为49eV;碰撞室射出电压为15V。
[004引编号为10的地黄巧D的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为709.2;产品离子定量值 (m/z)为3 65.2;产品离子定性值(m/z)为501.1592,365.1068;去簇电压为90V;碰撞电压为 53eV;碰撞室射出电压为25V。
[0049] 编号为11的苯甲酯中乌头原碱的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为590.2;产品 离子定量值(m/z)为540.2;产品离子定性值(m/z)为540.2610，508.2345;去簇电压为70V; 碰撞电压为47eV;碰撞室射出电压为30V。
[0050] 编号为12的尼奥灵的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为438.2;产品离子定量值 (m/z)为420.2;产品离子定性值(m/z)为420.2761，388.2498;去簇电压为60V;碰撞电压为 40eV;碰撞室射出电压为31V。
[0051] 编号为13的马钱巧的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为413.2;产品离子定量值 (m/z)为219.0;产品离子定性值(m/z)为395.1322,251.0896;去簇电压为110V;碰撞电压为 30eV;碰撞室射出电压为12V。
[0052] 编号为14的多根乌头碱的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为378.2;产品离子定 量值(m/z)为360.2;产品离子定性值(m/z)为360.2546，328.2280;去簇电压为60V;碰撞电 压为42eV;碰撞室射出电压为25V。
[0053] 编号为15的猜芽菜巧的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为381.1;产品离子定量 值(m/z)为219.2;产品离子定性值(m/z)为255.0845,219.0633;去簇电压为130V;碰撞电压 为25eV;碰撞室射出电压为15V。
[0054] 编号为16的莫诺巧的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为429.1;产品离子定量值 (m/z)为185. ο;产品离子定性值(m/z)为273.0947，267.0842;去簇电压为160V;碰撞电压为 35eV;碰撞室射出电压为15V。
[0055] 上述检测方法中，步骤3)中，所述高效液相色谱-电喷雾串联质谱化C-ESI-MS/MS) 检测方法具体可通过API SOOOQtrap液相质谱联用系统(含2台岛津LC-20AD累，SIL-20AC恒 溫自动进样器，CT0-20A柱溫箱，CBM-20A控制器，ESI和APCI接口离子源，Analyst Software 1.5.2色谱工作站)来实施，该设备购自美国应用生物系统公司。
[0056] 本发明检测方法是通过如下实现对各种成分的定量检测的：首先配制含有各种成 分的标准品系列溶液，然后加入内标溶液作为供试品，输入至高效液相色谱-电喷雾串联质 谱中，按照所述检测条件进行检测，得到每种成分与内标的峰面积，然后W每种成分与内标 的峰面积的比值作为纵坐标，W每种成分的浓度作为横坐标，制作标准曲线。测定待测样品 时，按照上述方法得到每种成分与内标的峰面积的比值，然后根据所得到的标准曲线就能 得到每种成分的浓度，经换算即得到待测样品中每种成分的含量。
[0057] 本发明建立的LC-ESI-MS/MS化igh-pe;rfo;rmance liquid chromatography coupled with mass spectrome化y)检测方法具有灵敏度高和专属性强的特点，并对20批 不同来源的市售右归丸成药中的16种成分进行了定量测定，覆盖范围广，W期建立系统、全 面的右归丸质量评定方法。
[005引说明书附图
[0059] 图1为采用LC-ESI-MS/MS法同时测定右归丸样品中16种活性成分的代表性色谱 图，其中图1A为16种活性分色谱图全图，图1B为16种活性成分5.5-7.5min局部放大色谱图。
【具体实施方式】
[0060] 下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。
[0061 ]下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法;所述试剂和材料，如 无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0062] 下述实施例中所用的仪器设备如下:API 5000(Hrap液相质谱联用系统(含2台岛 津LC-20AD累，S比-20AC恒溫自动进样器，CT0-20A柱溫箱，CBM-20A控制器，ESI和APCI接口 离子源，Analyst Software 1.5.2色谱工作站），购自美国应用生物系统公司；Biofugel5R 低溫离屯、机，购自德国Heraeus sepatech公司；Agilent Eclipse Plus-ClS色谱柱（100X 2.1mm，3.5皿），购自美国安捷伦科技公司。
[0063] 下述实施例中所用的药物与试剂如下：
[0064] 1) 20批右归丸样品购自北京市各大药店，厂家批号信息见下表1所示：
[0065] 表1. 20批右归丸药材的相关信息
[0066]
[006引2)右归丸中16种测定成分所对应的标准品及其相应编号：
[0069] 新乌头原碱（Mesaconine，成都曼思特生物科技有限公司，四川，中国，批号： A0642，纯度99.08% )，编号为1，结构式如下：
[0070]
[007。 山荣英新巧（Cor-nuside I陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中国，批号： HY0428，纯度98.00% )，编号为2，结构式如下：
[0072]
[0073] 地黄巧A(Rhmannioside A,陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中国，批号： HY0524，纯度98.00% )，编号为3，结构式如下：
[0074]
[0075] 附子灵（Fuziline，陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中国，批号：H0051，纯度 98.00%)，编号为4,结构式如下：
[0076]
[0077] 宋果灵（Songorine，陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中国，批号:朋0125,纯度 98.00% )，编号为5,结构式如下：
[007引
[0079] 金丝桃巧化yperoside，陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中国，批号:HA0410,纯 度98.00% )，编号为6,结构式如下：
[0080]
[0081 ] 苯甲酯次乌头原碱(Benzoy化ypaconitine，陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中 国，批号:HY040，纯度98.00% )，编号为7，结构式如下：
[0082]
[0083] 松果菊巧化chinacoside，上海永恒生物科技有限公司，上海，中国，批号： 20140521，纯度99.08% )，编号为8，结构式如下：
[0084]
[00化]苯甲酯乌头原碱(Benzoylaconitine，陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中国，批 号:HY039，纯度98.00% )，编号为9，结构式如下：
[0086]
[0087] 地黄巧D(Rhmannioside D，陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中国，批号： HY0255，纯度98.00% )，编号为10，结构式如下：
[008引
[0089] 苯甲酯中乌头原碱(Benzoylmesaconitine，陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中 国，批号:HY038,纯度98.00%)，编号为11，结构式如下：
[0090]
[0091] 尼奥灵（Neoline，陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中国，批号：册055,纯度 98.00%)，编号为12,结构式如下：
[0092]
[0093] 马钱巧化oganin，陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中国，批号：肌0613,纯度 98.00%)，编号为13,结构式如下：
[0094]
[0095] 多根乌头碱化aracoline，陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中国，批号:HB050， 纯度98.00%)，编号为14,结构式如下：
[0096]
[0097] 猜芽菜巧（Sweroside，陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中国，批号:HB0657,纯 度98.00% )，编号为15,结构式如下：
[009引
[0099] 莫诺巧(Morroniside,陕西华畳生物科技有限公司，陕西，中国，批号:皿0428,纯 度98.00% )，编号为16,结构式如下：
[0100]
[0101] 色谱级乙腊和甲醇均购自赛默飞世尔公司；
[0102] 色谱级甲酸购自德国默克公司。
[0103] 实施例1、测定右归丸中16种测定成分
[ 0104] 1)配制标准品溶液:精密称取16种标准品适量，分别W二甲基亚讽(DMS0)溶解，均 配制成浓度为1. OOmg/mL的单独标准储备液；
[0105] 分别精密量取上述标准储备液适量(量取体积取决于各化合物的质谱响应），置于 同一个1.5mL EP管中，加甲醇稀释，获得混合标准储备液，其中，含各化合物的浓度如下:新 乌头原碱200ng/mL、山荣英新巧500ng/mL、地黄巧A 200ng/mL、附子灵200ng/mL、宋果灵 200ng/mL、金丝桃巧50化g/mL、苯甲酯次乌头原碱20化g/mL、莫诺巧1 OOOng/mL、苯甲酯乌头 原碱200ng/mL、地黄巧D 500ng/mL、苯甲酯中乌头原碱500ng/mL、尼奥灵500ng/mL、马钱巧 lOOOng/mL、多根乌头碱lOOng/mL、猜芽菜巧200ng/mL、莫诺巧2000ng/血。再取上述混合标 准储备液，W甲醇进行系列稀释，配制成同时含有16种活性成分的混合标准系列溶液。
[0106] 内标溶液(5ng/mL下螺环酬）：精密称取盐酸下螺环酬对照品适量，W甲醇溶解并 稀释，配制成浓度为O.lmg/mL的胆备液游离型药物计）。精密量取下螺环酬内标储备液 1化L，置于一玻璃容器中，加 50 %甲醇溶液稀释至200mL，即获得含下螺环酬5ng/mL的内标 溶液。
[0107] 2)待测右归丸样品处理:分别取表1中的20批不同来源的右归丸样品，各精密称取 lOOmg，加甲醇溶液ImL，超声提取两次，每次30min，冷却至室溫，补加甲醇溶液至1血，0.4化 m微孔滤膜过滤，弃去0.山L滤液作为初滤液，取续滤液，即得供试品溶液。取15化L上述供试 品溶液，准确加入15化L内标溶液(5ng/mL下螺环酬），满旋混匀，即得到待测右归丸溶液样 品。
[0108] 3)对待测右归丸溶液样品进行检测：
[0109] (a)色谱检测条件如下:流动相A为含0.1%甲酸的乙腊溶液，流动相B为0.1%甲酸 水溶液，洗脱梯度参见表2。色谱柱为Agilent Eclipse P1US-C18色谱柱(2.1X100mm，3.5y m)，柱溫为室溫，流速为0.45mL/min;进样体积为10化。每个样品的运行时间为12. Omin。
[0110] 表2 HPLC分离所用流动相的洗脱梯度
[0111]
[0112] (b)质谱检测条件如下:经考察，16种化合物均具有很强的正离子信号。最终采用 电喷雾离子化源化SI离子化源），正离子扫描的MRM检测模式（多反应检测扫描，multi reaction monitoring)，16种待测化合物和内标的相应质谱参数如表3所示。
[0113] ESI源在正离子模式下进行扫描，气帘气(CUR)、雾化气(肥B)和满流加热气均使用 氮气，其设定值分别为20、55和55psi。离子源溫度(TEM)设定为500°C，正离子模式下的源喷 射电压设定为5500VdMRM模式下每个通道的滞留时间设定为150ms。
[0114] 表3.右归丸样品中16种活性成分W及内标下螺环酬测定的质谱工作参数
[0115]
[0117] ΝΑ:未检测到.
[0118] *:分子离子峰为[M+Nar.
[0119] IS(internal s1:andard)表示内标物.
[0120] 按照上述的色谱条件和质谱条件检测利用表1中的20批不同来源的右归丸样品所 制备的待测右归丸溶液样品。
[0121] 4)检测结果如下：
[0122] (a)选择性:取20批待测右归丸溶液样品中的第14批，按照步骤3)中的检测条件分 别进样测定，结果见图1。结果表明：基质中的共存成分均不干扰16种活性成分的测定，并且 16种活性成分彼此之间互不干扰，证明该检测方法的选择性良好。
[0123] 图1为采用LC-ESI-MS/MS法同时测定右归丸样品中16种活性成分的代表性色谱 图，其中图1A为16种活性分色谱图全图，图1B为16种活性成分5.5-7.5min局部放大色谱图， 1-地黄巧D，2-地黄巧A，3-新乌头原碱，4-多根乌头碱，5-莫诺巧，6-附子灵，7-宋果灵，8-松 果菊巧，9-尼奥灵，10-马钱巧，11-猜牙菜巧，12-金丝桃巧，13-山荣英新巧，14-苯甲酯中乌 头原碱，15-苯甲酯乌头原碱，16-苯甲酯次乌头原碱。
[0124] (b)线性范围、检测限和定量限：取步骤1)中的混合标准系列溶液，按步骤2)中的 样品处理方法处理后，按照步骤3)中的检测条件进样测定，分别W每种成分与内标峰面积 的比值对其浓度作线性回归，权重因子为1/x 2,得到相应的回归方程。16种活性成分的回归 方程和线性范围如下表4所示：
[0125] 分别量取步骤1)中的16种混合标准储备液适量，W甲醇：水（1:1，v/v)溶解并稀 释，按照步骤3)中的检测条件进样测定，记录色谱图。W峰响应值为基线噪音的10倍(信噪 比的10倍)时的进样浓度为定量限化〇Q);W峰响应值为基线噪音的3倍(信噪比的3倍)时的 进样浓度为检测限(L0D)。具体结果如下表4所示：
[0126] 表4.右归丸样品中16种化合物的回归方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限
[0127]
[01 %] y:各对照品峰面积与内标峰面积的比值.
[0129] X:对照品浓度
[0130] (C)精密度和准确度
[0131] 基于各化合物的线性范围，分别选定低、中和高3个水平的步骤1)中的混合标准系 列溶液(混标溶液），于24小时内按照步骤3)中的检测条件进样测定6次，计算各化合物的日 内精密度;取同样的步骤1)中的混合标准系列溶液(混标溶液），每天按照步骤3)中的检测 条件进样测定6次，连续测定3天，计算各化合物的日间精密度。精密度与准确度测定结果如 表5所示。由表5可知:各化合物的日内和日间精密度（WRSD值表示）均不超过15%，准确度 (WRE值表示)均不超过±15%，符合方法学验证的相关指导原则要求。
[0132] 表5.采用LC-ESI-MS/MS法测定右归丸中16种活性成分的日内和日间精密度及准 确度结果(n = 6)
[0133]
[0134]
[0135]
[0136] (d)重复性:取适当浓度的步骤1)中的混合标准系列溶液(混标溶液），按照步骤3) 中的检测条件连续进样6次，测得各化合物的峰面积，并计算相应的RSD值。结果表明：各化 合物的RSD值均不超过5%，表明此方法重复性好，符合方法学验证的相关指导原则要求，结 果见表6。
[0137] 表6采用LC-ESI-MS/MS法测定右归丸中16种活性成分的重复性实验结果(n = 6) [013 引
[0139] (e)稳定性:取适当浓度的步骤1)中的混合标准系列溶液(混标溶液），于室溫条件 下放置，分别于0、2、4、8、12、24、48、7化按照步骤3)中的检测条件取样测定，并计算相应尺50 值。结果表明：各化合物的RSD值值均不超过5%，表明16种化合物在当前检测条件下均具有 良好的稳定性，结果见表7。
[0140] 表7采用LC-ESI-MS/MS法测定右归丸中16种活性成分的稳定性实验结果
[0141]
[0142]
[0143] (f)回收率:取各化合物含量已知的实际样品(样品-09)，分别精密加入低(加入的 相应化合物的量为样品-09中相应化合物质量的80% )、中（加入的相应化合物的量为样品-09中相应化合物质量的100 % )、高(加入的相应化合物的量为样品-09中相应化合物质量的 120% )3个水平的步骤1)中相应的单独标准储备液，按步骤2)中的样品处理方法处理后按 照步骤3)中的检测条件进样测定，并求出相应回收率及RSD值。测试结果如表8所示，从表8 可得知:各化合物的回收率介于85-115%范围内，各化合物的RSD值均不超过15%，符合方 法学验证的相关指导原则要求。
[0144] 表8.采用LC-ESI-MS/MS法测定右归丸中15种活性成分的加样回收率结果(n = 6)
[0145]
[0146]
[0147] (g)表1中的20批不同来源的右归丸样品的分析：按步骤2)中的样品处理方法处 理，并按步骤3)中的色谱条件和质谱条件利用表1中的20批不同来源的右归丸样品所制备 的待测右归丸溶液样品进样测定，测定结果如表9所示：
[0148] 表9. 20批右归丸样品中16种化合物的实测浓度(mg/g)
[0149]
[0150]
【主权项】
1 . 一种右归丸中多种成分含量的检测方法，包括如下步骤： 1) 利用甲醇超声提取右归丸，然后进行滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶 液； 2) 向所述供试品溶液中加入内标溶液，作为待测样品； 3) 采用高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测所述待测样品，即得到右归丸中下述任一 种成分的含量： a)新乌头原碱、b)山茱萸新苷、c)地黄苷A、d)附子灵、e)宋果灵、f)金丝桃苷、g)苯甲酰 次乌头原碱、h)松果菊苷、i)苯甲酰乌头原碱、j)地黄苷D、k)苯甲酰中乌头原碱、1)尼奥灵、 m)马钱苷、η)多根乌头碱、〇)猜芽菜苷和p)莫诺苷。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:步骤1)中，所述甲醇的用量为:0.1g所 述右归丸需要添加1~5mL甲醇。3. 根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于:步骤1)中，所述超声提取的频率为 20~80KHz，所述超声提取的时间为30~60min; 所述滤膜为尼龙66膜，所述滤膜的孔径为0.22μπι或0.45μπι。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的检测方法，其特征在于:步骤2)中，所述内标溶液 为丁螺环酮的甲醇水溶液； 所述丁螺环酮的用量为：1~5ng/mL所述待测样品。5. 根据权利要求1-4中任一项所述的检测方法，其特征在于:步骤3)中，所述高效液相 色谱-电喷雾串联质谱检测步骤中的色谱条件如下： 流动相A:体积分数为0.05 %~0.2 %的甲酸的乙腈溶液； 流动相B:体积分数为0.05 %~0.2 %的甲酸的水溶液； 色谱柱:AgilentEclipsePlus_C18色谱柱，柱长为100mm、柱径为2.1mm和填料粒径为 3.5μπι； 柱温：20~30°C; 流速:〇 · 45mL/min; 进样体积：1〇或20yL; 每个样品的运行时间：12.Omin; 洗脱梯度如下： 0-1.5min:流动相A体积分数为98 %，流动相B体积分数为2 % ; 1.5-4min:流动相A体积分数从98 %降至55 %，流动相B体积分数从2 %升至45 % ; 4-8min:流动相A体积分数从55%降至15%，流动相B体积分数从45%升至85% ; 8- 9min:流动相A体积分数为15%，流动相B体积分数为85% ; 9- 9.Olmin:流动相A体积分数从15%升至98%，流动相B体积分数从85%降至2% ; 9-12min:流动相A体积分数为98 %，流动相B体积分数为2 %。6. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于:步骤3)中，所述高效液相色谱-电喷雾 串联质谱检测步骤中的质谱条件如下： 离子源：电喷雾离子化源； 质谱工作模式:正离子扫描的MRM检测模式； 气帘气、雾化气和涡流加热气均使用氮气，其设定值分别为20~30psi、50~60psi和50 ~60psi; 离子源温度为350~500°C; 尚子源喷射电压为4500~5500V。7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于:步骤3)中，所述高效液相色谱-电喷雾 串联质谱检测步骤中，各成分的质谱条件如下： 1) 所述新乌头原碱的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为486.2;产品离子定量值(m/z) 为436.2;产品离子定性值(m/z)为454.2448，404.2079;去簇电压为250V;碰撞电压为44eV; 碰撞室射出电压为25V; 2) 所述山茱萸新苷的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为565.1;产品离子定量值(m/z) 为163.3;产品离子定性值(m/z)为403.1011，255.0845;去簇电压为250V;碰撞电压为39eV; 碰撞室射出电压为12V; 3) 所述地黄苷A的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为547.1;产品离子定量值(m/z)为 203.1;产品离子定性值(m/z)为385.1115,203.0532;去簇电压为151￥;碰撞电压为446￥;碰 撞室射出电压为15V; 4) 所述附子灵的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为454.1;产品离子定量值(m/z)为 436.2;产品离子定性值(!11/2)为436.2707,418.2600;去簇电压为89￥ ;碰撞电压为416￥;碰 撞室射出电压为25V; 5) 所述宋果灵的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为358.2;产品离子定量值(m/z)为 340.2;产品离子定性值(m/z)为340.2280;去簇电压为98V;碰撞电压为35eV;碰撞室射出电 压为20V; 6) 所述金丝桃苷的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为487.1;产品离子定量值(m/z)为 185.1;产品离子定性值(m/z)为325.0329，185.0425;去簇电压为100V;碰撞电压为33eV;碰 撞室射出电压为10V; 7) 所述苯甲酰次乌头原碱的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为574.2;产品离子定量 值(m/z)为542.2;产品离子定性值(m/z)为542.2766,510.2499;去簇电压为150V;碰撞电压 为41eV;碰撞室射出电压为15V; 8) 所述松果菊苷的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为809.2;产品离子定量值(m/z)为 663.2;产品离子定性值(!11/2)为663.1917,501.1384;去簇电压为50￥ ;碰撞电压为626￥;碰 撞室射出电压为15V; 9) 所述苯甲酰乌头原碱的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为604.3;产品离子定量值 (m/z)为572.3;产品离子定性值(m/z)为572.2868，554.2764;去簇电压为150V;碰撞电压为 49eV;碰撞室射出电压为15V; 10) 所述地黄苷D的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为709.2;产品离子定量值(m/z)为 365.2;产品离子定性值(!11/2)为501.1592,365.1068;去簇电压为90￥ ;碰撞电压为536￥;碰 撞室射出电压为25V; 11) 所述苯甲酰中乌头原碱的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为590.2;产品离子定量 值(m/z)为540.2;产品离子定性值(m/z)为540.2610，508.2345;去簇电压为70V;碰撞电压 为47eV;碰撞室射出电压为30V; 12) 所述尼奥灵的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为438.2;产品离子定量值(m/z)为 420.2;产品离子定性值(m/z)为420.2761，388.2498;去簇电压为60V;碰撞电压为40eV;碰 撞室射出电压为31V; 13) 所述马钱苷的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为413.2;产品离子定量值(m/z)为 219.0;产品离子定性值(m/z)为395.1322,251.0896;去簇电压为110￥;碰撞电压为3(^ ;碰 撞室射出电压为12V; 14) 所述多根乌头碱的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为378.2;产品离子定量值(m/ z)为360.2 ;产品离子定性值(m/z)为360.2546，328.2280 ;去簇电压为60V;碰撞电压为 42eV;碰撞室射出电压为25V; 15) 所述獐芽菜苷的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为381.1;产品离子定量值(m/z) 为219.2;产品离子定性值(m/z)为255.0845，219.0633;去簇电压为130V;碰撞电压为25eV; 碰撞室射出电压为15V; 16) 所述16的莫诺苷的质谱工作参数如下:母离子(m/z)为429.1;产品离子定量值(m/ z)为185.0;产品离子定性值(m/z)为273.0947,267.0842;去簇电压为160V;碰撞电压为 35eV;碰撞室射出电压为15V。
【专利摘要】本发明公开了一种右归丸中多种成分含量的检测方法。所述检测方法包括如下步骤：1)利用甲醇超声提取右归丸，然后进行滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液；2)向所述供试品溶液中加入内标溶液，作为待测样品；3)采用高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测所述待测样品，即得到右归丸中下述任一种成分的含量。本发明建立的LC-ESI-MS/MS(high-performance？liquid？chromatography？coupled？with？mass？spectrometry)检测方法具有灵敏度高和专属性强的特点，并对20批不同来源的市售右归丸成药中的16种成分进行了定量测定，覆盖范围广，以期建立系统、全面的右归丸质量评定方法。
【IPC分类】G01N30/02, G01N30/06
【公开号】CN105486775
【申请号】CN201610011285
【发明人】王蕾, 刘浩龙, 仇峰, 赵晖, 邹海艳, 杨鑫伟
【申请人】首都医科大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年1月8日
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