阿普斯特中对映异构体杂质的检测方法
阿普斯特中对映异构体杂质的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及阿普斯特中对映异构体杂质的检测方法。
【背景技术】
[0002] 阿普斯特(apremilast，（S)-2-[l-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基）-2-甲横酷基乙基]-4-乙酷基氨基异日引噪嘟-1,3-二酬，分子式:〔22也4N2化S，分子量:460.5)是由美国Celgene生 物技术公司开发，2014年3月21日经美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于成人活跃型银 屑病性关节炎(PsA)的治疗，商品名为化ezla。
[0003]
[0004] 阿普斯特是一种手性药物，其有效构型为S构型。因此，在阿普斯特产品中，其財勾 型异构体杂质（I)的存在会严重影响产品的用药安全和临床效果，有必要对阿普斯特中的 杂质（I)含量进行检测，W有效监控阿普斯特的质量。
[0005] 中国专利〔化044589614(公开日2015.03.25)公开了一种阿普斯特有关物质的方 法，该方法使用AD-H色谱柱，流动相为正己烧/异丙醇/二乙胺/Ξ氣乙酸= 80/20/0.2/0.5， 流速1. OmL/min，柱溫40°C，检测波长240nm。专利CN104792913A(公开日2015.07.22)中对其 方法进行了验证，发现阿普斯特与其对映异构体体的分离度只有1.26,小于1.5,没有完全 将两者分离。可见，该方法无法准确测定阿普斯特中对映异构体的含量。
[0006] 中国专利CN104792913A(公开日 2015.07.22)、CN105136933A(公开日 2015.12.09)、CN104820028A(公开日2015.08.05) W及一篇文献(蒙发明，HPLC法测定阿普 斯特对映异构体，化工中间体，2015年03期，第37-38页)均公开了阿普斯特对映异构体的分 离检测方法，其中CN104792913A和CN105136933A采用是AD-H手性色谱柱，而CN104820028A 和前述文献采用的是AS-H手性色谱柱。
[0007] 可见，现有报道的方法中，采用的手性柱均属于纤维素型手性色谱柱，且均是由淀 粉替代纤维素制成的。然而，因为淀粉是水溶性的，流动相中必须绝对无水才能保证柱子寿 命。不可避免的，使用较长时间W后，该类色谱柱会受到损害，使用寿命较短。
[000引另外，该类色谱柱的缺点是只能用于正相，且价格昂贵，使用过程中，稍有不慎就 会造成色谱柱的柱效降低、堵塞甚至不能使用。
[0009]因此，有必要寻找到价格便宜，使用范围更广的，并且能够准确检测阿普斯特中对 映异构体杂质的其他类型手性色谱柱。
【发明内容】
[0010] 为解决上述问题，本发明提供了一种利用蛋白质型手性色谱柱的阿普斯特中对映 异构体(1)的检测方法，它包括W下步骤：
[0011]
[001^ a、制备供试品溶液：
[0013] 取待测阿普斯特样品，流动相溶解，过滤或不过滤，制备得到供试品溶液；
[0014] b、制备对映异构体(1)的对照品溶液：
[0015] 取对映异构体(1)对照品，流动相溶解，制备得到对映异构体(1)的对照品溶液；
[0016] C、分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下： [0017]色谱柱:α-酸性糖蛋白手性色谱柱，即用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色 谱柱；
[0018] 流动相：甲基叔下基酸与C1~C4醇类溶剂的混合溶剂;所述C1~C4醇类溶剂包括 甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正下醇、异下醇和叔下醇。
[0019] 检现贩长：230 ± lOnm，优选的检现贩长为230 ± 2nm;
[0020] d、根据检测结果计算得到阿普斯特样品中对映异构体（I)的含量。在本发明具体 的实施例中，采用的是外标法计算。
[0021] 所述阿普斯特样品可选自阿普斯特原料或者阿普斯特制得的片剂或者其他的剂 型。
[0022] 进一步地，步骤C中，所述色谱柱的规格为：内径4.6mm，长度150mm，填料粒径5皿。 更进一步地，步骤C中，所述色谱柱的型号为CHIRAL AGP。
[0023] 进一步地，步骤c中，所述Cl~C4醇类溶剂为乙醇、异丙醇或正下醇。
[0024] 进一步地，步骤C中，所述甲基叔下基酸与醇类溶剂的体积比为70% :30%~90% : 10%。
[0025] 更进一步地，步骤C中，所述流动相为下述体积比的混合溶剂：
[00%] 甲基叔下基酸:正下醇=70:30、甲基叔下基酸:正下醇=75:25、甲基叔下基酸:正 下醇=90:10、甲基叔下基酸：乙醇=70:30、甲基叔下基酸：乙醇=75:25、甲基叔下基酸：乙 醇=90:10、正庚烧：乙醇=90:10、甲基叔下基酸:异丙醇=70:30、甲基叔下基酸:异丙醇= 75:25或甲基叔下基酸:异丙醇=90:10;优选甲基叔下基酸:正下醇=75:25。
[0027] 进一步地，步骤a中，供试品溶液的浓度为0.1~0.3mg/mM步骤b中，对照品溶液的 浓度为0.1~l.Oyg/mL。
[0028] 进一步地，步骤C中，所述色谱条件的柱溫为30°C~40°C，优选的柱溫为30°C~35 °C;流速为ο. 8mL/min~1.2mL/min，优选的流速为ο. 8mL/min~1. OmL/min。
[0029] 进一步地，步骤c中，所述流动相为甲基叔下基酸：乙醇、异丙醇或正下醇体积比为 75:25的混合溶剂，且所述色谱条件的柱溫为30°C，流速为0.8mL/min。
[0030] 进一步地，步骤C中，所述色谱条件的进样量为20化。
[0031] 本发明阿普斯特中对映异构体的检测方法，采用的是蛋白质型手性色谱柱，使用 范围较广，价格较低，使用寿命较长。在克服了现有淀粉涂覆型手性柱的寿命较短缺点的同 时，有效将阿普斯特中对映异构体分离检测出来，检测结果准确、可靠，并且具有线性关系 优异、精密度高、稳定性好、重复性好、回收率好、操作简便、成本低等诸多优点，适合于推广 应用。
[0032] 同时，本发明方法所采用蛋白质型的手性色谱柱。
[0033] 而且，根据Irving Wainer基于手性固定相和溶剂的相互作用机制提出的手性色 谱柱的分类体系：
[0034] 第1类:通过氨键、π-π作用、偶级-偶级作用形成复合物。
[0035] 第2类:既有类型1中的相互作用，又存在包埋复合物。
[0036] 第3类:基于溶剂进入手性空穴形成包埋复合物。
[0037] 第4类:基于形成非对映体的金属络合物。
[0038] 第5类:基于疏水相互作用和极性相互作用实现手性分离。
[0039] 现有报道中的纤维素型手性色谱柱属于典型的第2类手性柱，而本发明提供的蛋 白质型手性色谱柱属于第5类。可见，本发明提供的蛋白质型手性色谱柱也为准确检测阿普 斯特中的对映异构体杂质，提供了一条全新的色谱柱选择途径。
[0040] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可W做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0041] W下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于W下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0042] 图1为实施例1本发明方法对系统适用性试验的检测结果。
[0043] 图2为对比实施例1对混合溶液的检测结果。
[0044] 图3为实施例11的标准曲线图。
[0045] 图4-6为实施例11的检测结果，图4为(a)供试品溶液;图5为(b)对照品溶液；图6为 (C)阴性样品溶液。
【具体实施方式】
[0046] 本发明【具体实施方式】中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
[0047] 高效液相色谱仪(型号:LC-20AT二元累，生产厂家：日本岛津公司）；
[004引电子天平(型号:AUW220D，生产厂家：日本岛津公司）。
[0049] 阿普斯特片(批号：140501，来源:成都百裕制药股份有限公司）
[0050] 对映异构体对照品（批号:P化-A012，来源:迈斯克医药科技有限公司）
[0化1]实施例1
[0052] 1、检测波长的确定
[0053] 取阿普斯特片，研细，精密称取适量，用流动相（甲基叔下基酸-正下醇= 75:25)配 制成浓度为20yg/mL的溶液，作为供试品溶液。
[0054] 精密称取对照品（对映异构体)适量，用流动相（甲基叔下基酸-正下醇= 75:25)配 制成浓度为20yg/mL的溶液，作为对照品溶液。
[0055] 取上述的供试品溶液、对照品溶液，在200皿~40化m波长范围内进行扫描，试验结 果见表1。
[0056] 表1、本发明的紫外扫描结果 [0化7]
[0058]试验结果表明，检测波长在220nm~240nm范围内，均适合本发明的高效液相色谱 检测。
[0化9] 2、系统适用性试验：
[0060] 取阿普斯特、对映异构体各20yg，加入ImL流动相(正己烧-乙醇= 75:25)，作为系 统适用性溶液;量取20化系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，阿普斯特与对映异 构体之间的分离度应不低于2.0，理论塔板数按阿普斯特峰计算应不小于2000。
[0061] 采用正相高效液相色谱 进行检测：
[0062] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[0063] 色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0064] 流动相：甲基叔下基酸-正下醇(体积比为75:25);
[0065] 柱溫：35°C;
[0066] 流速：1.0mL/min;
[0067] 检测波长:230nm;
[006引进样量:2化L。
[0069] 系统适用性试验的检测结果见图1，阿普斯特(保留时间为6.353min)与对映异构 体(保留时间为5.345min)之间的分离度为3.654,理论塔板数(按阿普斯特峰计算)为7349。
[0070] 可见，该色谱条件可W准确检测阿普斯特中的对映异构体。
[0071 ] 3、高效液相色谱法检测
[0072] 制备供试品溶液:称取阿普斯特片，研细，称取lOOmg，置于50mL量瓶中，加流动相 (甲基叔下基酸-正下醇= 75:25)适量，振摇20分钟，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续 滤液作为供试品溶液。
[0073] 制备对照品溶液：称取对映异构体（I)对照品2mg，置于lOOmL量瓶中，精密量取 ImL，置于lOOmL量瓶中，加流动相（甲基叔下基酸-正下醇= 75:25)稀释至刻度，摇匀，作为 对照品溶液。
[0074] 分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，采用正相高效液相色 谱进行检测，色谱条件如下：
[0075] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[0076] 色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0077] 流动相：甲基叔下基酸-正下醇(体积比为75:25);
[007 引柱溫：35°C;
[0079] 流速：1.0mL/min;
[0080] 检测波长：230nm;
[0081 ]进样量:20yL。
[0082] 根据检测结果，按照外标法计算得到阿普斯特片中对映异构体的含量为0.03%。
[0083] 对比例实施例1
[0084] 采用反相高效液相色谱进行检测：
[0085] 按照阿普斯特片自拟质量标准进行的有关物质检测方法：
[0086] 色谱柱的填充剂：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Inedsil 0DS3,50X 4.6皿，5皿或其他性能相当色谱柱）；
[0087] 流动相：W0.0 5mol/L憐酸二氨钟溶液-甲醇(50:50)为流动相；
[0088] 流速：1.0mL/min;
[0089] 检测波长:230nm;
[0090] 混合溶液:取阿普斯特、对映异构体各20yg，加入ImL流动相，作为混合溶液；
[0091] 制备供试品溶液:取阿普斯特片，研细，称取lOOmg，置于50mL量瓶中，加流动相适 量，振摇20分钟，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0092] 制备对照品溶液:称取对照品2mg，置于lOOmL量瓶中，精密量取ImL，置于lOOmL量 瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
[0093] 混合溶液的检测结果如图2所示。
[0094] 结果显示阿普斯特与对映异构体的色谱峰重叠在一起，该色谱条件不能准确检测 阿普斯特中的对映异构体。
[00巧]对比例实施例2
[0096] 采用正相高效液相色谱进行检测：
[0097] 色谱柱的填充剂：用直链淀粉-Ξ(3-氯-4甲基苯基氨基甲酸醋)键合的硅胶为填 充剂的色谱柱；
[0098] 色谱柱的型号为CHIRAL ΡΑΚ IF，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径 为如m;
[0099] 流动相：正己烧-乙醇（75:25);
[0100] 柱溫：35°C;
[0101] 流速：1.0mL/min;
[0102] 检测波长:230nm;
[0103] 进样量：20yL。
[0104] 按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿普斯特（保留时间为 7.017min)与对映异构体(供其保留时间为6.579min)之间的分离度为1.485，理论塔板数 (按阿普斯特峰计算)为4721，阿普斯特峰的拖尾因子为1.281，主峰对称性较差，本色谱系 统基线波动较大，主峰与异构体之间的分离度小于1.5,不符合药典规定的要求。
[0105] 该色谱条件不能准确检测阿普斯特中的对映异构体。
[0106] 对比实施例3
[0107] 采用正相高效液相色谱进行检测：
[0108] 色谱柱的填充剂：用直链淀粉-Ξ(3-氯-4甲基苯基氨基甲酸醋)键合的硅胶为填 充剂的色谱柱；
[0109] 色谱柱的型号为CHIRAL ΡΑΚ IF，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径 为如m;
[0110] 流动相:正己烧-乙醇(90:10);
[0111] 柱溫：35°C;
[0112] 流速：1.0mL/min;
[0113] 检测波长:230nm;
[0114] 进样量:20yL。
[0115] 按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿普斯特（保留时间为 4.012miη)与对映异构体(供其保留时间为3.87 Imiη)之间的分离度为0.721，理论塔板数 (按阿普斯特峰计算)为7713,阿普斯特峰的拖尾因子为1.052,基线波动大，主峰与异构体 之间的分离度小于1.5,不符合药典规定的要求。
[0116] 该色谱条件不能准确检测阿普斯特中的对映异构体。
[0117] 实施例2
[0118] 采用正相高效液相色谱进行检测：
[0119] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[0120] 色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0121] 流动相：甲基叔下基酸-正下醇(75:25);
[0122] 柱溫:35°C;
[0123] 流速：1.0mL/min;
[0124] 检测波长:230nm;
[0125] 进样量:20yL。
[0126] 按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿普斯特（保留时间为 6.353111111)与对映异构体(供其保留时间为5.%5111111)之间的分离度为3.654，理论塔板数 (按阿普斯特峰计算)为7349,阿普斯特峰的拖尾因子为0.975。
[0127] 可见，该色谱条件可W准确检测阿普斯特中的对映异构体。
[012引实施例3
[0129] 采用正相高效液相色谱进行检测：
[0130] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[0131] 色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0132] 流动相：甲基叔下基酸-正下醇(70:30);
[0133] 柱溫:35°C;
[0134] 流速：1.0mL/min;
[0135] 检测波长:230nm;
[0136] 进样量:20yL。
[0137] 按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿普斯特（保留时间为 10.115min)与对映异构体(供其保留时间为8.725min)之间的分离度为4.128，理论塔板数 (按阿普斯特峰计算)为8107,阿普斯特峰的拖尾因子为1.08。
[0138] 可见，该色谱条件可W准确检测阿普斯特中的对映异构体。
[0139] 实施例4
[0140] 采用正相高效液相色谱进行检测：
[0141] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[0142] 色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0143] 流动相：甲基叔下基酸-正下醇(90:10);
[0144] 柱溫:35°C;
[0145] 流速：1.0mL/min;
[0146] 检测波长：230nm;
[0147] 进样量：20yL。
[0148] 按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿普斯特（保留时间为 S.Ollmin)与对映异构体(供其保留时间为4.323min)之间的分离度为1.951，理论塔板数 (按阿普斯特峰计算)为12037,阿普斯特峰的拖尾因子为1.007。
[0149] 可见，该色谱条件可W准确检测阿普斯特中的对映异构体。
[0150] 实施例5
[0151] 采用正相高效液相色谱进行检测：
[0152] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[0153] 色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0154] 流动相：甲基叔下基酸-乙醇(70:30);
[015 引柱溫：35°C;
[0156] 流速：1 .OmL/min;
[0157] 检测波长：230nm;
[0158] 进样量：20yL。
[0159] 按照实施例1 的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿普斯特（保留时间为 9.228min)与对映异构体(供其保留时间为8.01 Imin)之间的分离度为3.055，理论塔板数 (按阿普斯特峰计算)为8877,阿普斯特峰的拖尾因子为1.035。
[0160] 可见，该色谱条件可W准确检测阿普斯特中的对映异构体。
[0161] 实施例6
[0162] 采用正相高效液相色谱进行检测：
[0163] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[0164] 色谱柱的型号为CHIRAL AGP,规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[01化]流动相：甲基叔下基酸-乙醇(90:10);
[0166] 柱溫：35。。
[0167] 流速：1.0mL/min;
[0168] 检测波长:230nm;
[0169] 进样量:20yL。
[0170] 按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿普斯特（保留时间为 5.517min)与对映异构体(供其保留时间为4.229min)之间的分离度为1.876，理论塔板数 (按阿普斯特峰计算)为11039,阿普斯特峰的拖尾因子为0.982。
[0171] 可见，该色谱条件可W准确检测阿普斯特中的对映异构体。
[0172] 实施例7
[0173] 采用正相高效液相色谱进行检测：
[0174] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[01巧]色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0176] 流动相：甲基叔下基酸-异丙醇(70:30);
[0177] 柱溫:35°C;
[017 引 流速：1.0mL/min;
[0179] 检测波长:230nm;
[0180] 进样量：20yL。
[0181] 按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿普斯特（保留时间为 17.813111111)与对映异构体(供其保留时间为16.055111111)之间的分离度为3.379，理论塔板数 (按阿普斯特峰计算)为9527,阿普斯特峰的拖尾因子为1.028。
[0182] 可见，该色谱条件可W准确检测阿普斯特中的对映异构体。
[0183] 实施例8
[0184] 采用正相高效液相色谱进行检测：
[0185] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[01化]色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0187] 流动相：甲基叔下基酸-异丙醇(90:10);
[0188] 柱溫：35。。
[0189] 流速：1.0mL/min;
[0190] 检测波长:230nm;
[0191] 进样量:20yL。
[0192] 按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿普斯特（保留时间为 10.803111111)与对映异构体(供其保留时间为8.058111111)之间的分离度为4.121，理论塔板数 (按阿普斯特峰计算)为8859,阿普斯特峰的拖尾因子为1.056。
[0193] 可见，该色谱条件可W准确检测阿普斯特中的对映异构体。
[0194] 实施例9
[01 Μ]采用正相高效液相色谱进行检测：
[0196] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[0197] 色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0198] 流动相：甲基叔下基酸-异丙醇(75:25);
[0199] 柱溫:30°C;
[0200] 流速:0.8mL/min;
[0201] 检测波长:230nm;
[0202] 进样量:20yL。
[0203] 按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿普斯特（保留时间为 8.757min)与对映异构体(供其保留时间为6.023min)之间的分离度为8.147，理论塔板数 (按阿普斯特峰计算)为7133,阿普斯特峰的拖尾因子为1.039。
[0204] 可见，该色谱条件可W准确检测阿普斯特中的对映异构体。
[0205] 实施例10
[0206] 采用正相高效液相色谱进行检测：
[0207] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[020引色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0209] 流动相：甲基叔下基酸-异丙醇(75:25);
[0210] 柱溫:40°C; 流速：1.2mL/min;
[0212]检现贩长：230nm;
[0213] 进样量：20化。
[0214] 按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿普斯特（保留时间为 5.503111111)与对映异构体(供其保留时间为4.727111111)之间的分离度为2.513，理论塔板数 (按阿普斯特峰计算)为9586,阿普斯特峰的拖尾因子为0.998,本发明正相高效液相色谱可 W用于检测阿普斯特中的对映异构体。
[0215] 实施例11本发明的色谱条件筛选
[0216] 1、流动相筛选试验
[0217] 选择不同的流动相进行筛选试验，其他色谱条件如下：
[0218] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[0219] 色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0220] 流动相:表2;
[02別]柱溫：35。。
[0222] 流速：1.0mL/min;
[0223] 检测波长:230nm;
[0224] 进样量:20yL。
[0225] 按照实施例1的方法进行系统适用性试验，检测结果见表2:
[0226] 表2、流动相筛选试验结果
[0227]
[022引'表2中，流动相"例如：甲基叔T基酸-正下醇(75:25)"具有中国药典2015年版通常' 具有的含义，其中75:25表示甲基叔下基酸与正下醇的体积比;保留时间是指阿普斯特的保 留时间；分离度是指阿普斯特与对映异构体之间的分离度;拖尾因子是指阿普斯特峰的拖 尾因子;理论塔板数是指理论塔板数(按阿普斯特峰计算）。
[0229] 试验结果表明，流动相为甲基叔下基酸-正下醇（70 :30)、甲基叔下基酸-正下醇 (75:25 )、甲基叔下基酸-正下醇(90:10 )、甲基叔下基酸-乙醇（70:30 )、甲基叔下基酸-乙醇 (75 : 25)、甲基叔下基酸-乙醇（90:10)正庚烧-乙醇（90:10)、甲基叔下基酸-异丙醇（70: 30)、甲基叔下基酸-异丙醇（75:25)、甲基叔下基酸-异丙醇(90:10)时，均适合用于检测阿 普斯特中的对映异构体。
[0230] 2、柱溫和流速筛选试验
[0231] 选择不同的柱溫和流速进行筛选试验，其他色谱条件如下：
[0232] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[0233] 色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0234] 流动相：甲基叔下基酸-正下醇(75:25);
[0235] 柱溫:表3;
[0236] 流速:表3;
[0237] 检测波长:230nm;
[023引进样量:2化L。
[0239] 按照实施例1的方法进行系统适用性试验，检测结果见表3:
[0240] 表3、柱溫和流速筛选试验结果
[0241]
[0242] 表3中，保留时间是指阿普斯特的保留时间；分离度是指阿普斯特与对映异构体之 间的分离度;拖尾因子是指阿普斯特峰的拖尾因子;理论塔板数是指理论塔板数(按阿普斯 特峰计算）。
[0243] 试验结果表明，不同的柱溫和流速下，本发明方法均能有效准确检测阿普斯特异 构体。优选的柱溫为30°C~35°C;流速为0.8mL/min~1. OmL/min。
[0244] 实施例12本发明方法的方法学验证
[0245] 方法学验证中，色谱条件均如下：
[0246] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[0247] 色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0248] 流动相：甲基叔下基酸-正下醇(75:25);
[0249] 柱溫:35°C;
[0 巧 0]流速：1.0mL/min;
[0巧1] 检测波长：230nm;
[0巧2] 进样量：2化L。
[0巧3] 1、线性关系
[0254] 按照本发明方法制备对照品溶液，用流动相稀释制成表4中一系列浓度的对照品 溶液。按照上述色谱条件，分别进行检测，检测结果见表4。
[0255] 表4、线性关系试验的检测结果 「Π 95Α1
[0257]~~W异构体浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为:Υ = 10179X+1593，r2 = 0.999。
[Ο巧引试验 结果表明，异构体的浓度在0.0993yg/mL~0.7947yg/mL范围内，其峰面积与 测定浓度呈良好的线性关系。
[0259] 2、专属性
[0260] 按照本发明方法制备供试品溶液、对照品溶液。
[0261] 取水乳糖lOg、交联簇甲基纤维钢Ig、微晶纤维素2.1g、硬脂酸儀0.5g，W上四种辅 料，混匀;按照类似方法制备阴性样品溶液。
[0%2]进样量:20yL。
[0263] 精密量取上述各溶液20化注入液相色谱仪，记录色谱图，见图4-6,分别为：（a)供 试品溶液;（b)对照品溶液;（C)阴性样品溶液。
[0264] 试验结果表明，阴性样品溶液不会对本发明正相高效液相色谱检测阿普斯特中对 映异构体的方法造成干扰。
[02化]3、精密度
[0266] 取对照品对映异构体适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1 m L中含 0.2yg的溶液，作为对照品溶液；
[0267] 精密量取SOliL对照品溶液，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图。
[0268] 检测结果见表5。
[0269] 表5、精密度试验的检测结果
[0270]
[0271 ]试验结果表明，本发明方法精密度良好。
[0272] 4、稳定性
[0273] 取阿普斯特片，按照本发明方法将其配制成供试品溶液和对映对照品溶液，取供 试品溶液分别于化、2}1、地、6}1、化进样检测;精密量取20化对照品溶液，注入液相色谱仪，按 外标法W峰面积计算供试品中对映异构体的含量，结果见表6。
[0274] 表6、稳定性试验的检测结果
[0275]
[0276] 试验结果表明，本发明方法配制的供试品溶液稳定性良好。
[0277] 5、重复性
[0278] 取阿普斯特片，按照本发明方法将其配制成供试品溶液，分别平行制备6份供试品 溶液，并制备对映对照品溶液;精密量取SOliL对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱 仪，按外标法W峰面积计算供试品中对映异构体的含量，结果见表7。
[0279] 表7、重复性试验的检测结果
[0280]
[0281 ]试验结果表明，本发明方法的重复性好。
[0282] 6、色谱条件与系统适用性
[0283] 取阿普斯特及对映异构体适量，加流动相制成每ImL中各含20yg的溶液，作为系统 适用性溶液;量取SOiiL系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，阿普斯特与对映异构 体之间的分离度应不低于2.0，理论塔板数按阿普斯特峰计算应不小于2000。
[0284] 制备供试品溶液:取阿普斯特片，研细，称取lOOmg，置于50mL量瓶中，加流动相（甲 基叔下基酸-正下醇= 75:25)适量，振摇20分钟，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤 液作为供试品溶液。
[0285] 制备对照品溶液:称取对照品（对映异构体)2mg，置于lOOmL量瓶中，精密量取ImL， 置于lOOmL量瓶中，加流动相（甲基叔下基酸-正下醇= 75:25)稀释至刻度，摇匀，作为对照 品溶液。
[0286] 取对照品溶液20化，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使对映异构体色谱峰的峰 高约为记录仪满量程的20%，再精密量取供试品溶液与对照品溶液各20化，分别注入液相 色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如果显示对映异构体峰，按外标法W峰面积计 算对映异构体的含量不得过0.1 %。按照上述的方法，分别对两种不同规格（规格：l〇mg、 30mg)的阿普斯特片进行检测3次。
[0287] 试验结果表明，供试品中对映异构体的检测结果均未超过0.1%，阿普斯特与对映 异构体达到良好的基线分离。
[028引 7、定量限和检测限
[0289] 称取对映异构体5.07mg，置于25mL量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，作 为对照品溶液，精密量取1. OmL，置于lOOmL量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，再精 密量取ImL，置20mL量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，再精密量取ImL，置20mL量瓶 中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，作为定量限试验的检测溶液（S/N a 10);精密量取 3mL，置lOmL量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，作为检测限试验的检测溶液(S/N -3);
[0290] 测得对映异构体定量限为4.965ng/mL。
[0291] 测得对映异构体检测限为1.4Wng/mL。
[0292] 8、回收率
[0293] 浓度1:取一水乳糖lOg、交联簇甲基纤维钢Ig、微晶纤维素2.1g、硬脂酸儀0.5g上 述四种辅料混匀，称取约o.lg，置于50mL量瓶中，加入阿普斯特对映异构体对照品胆备液 (浓度:4.004化g/mL)2mL，加溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，同法配制Ξ份； 浓度2:取按处方比例制备的空白辅料，称取约0.1 g，置于50mL量瓶中，加入阿普斯特对映异 构体对照品胆备液(浓度:4.004化g/mL)2.5mL，加溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液， 即得，同法配制立份;浓度3:取按处方比例制备的空白辅料，称取约O.lg，置于50mL量瓶中， 加入阿普斯特对映异构体对照品胆备液(浓度:4.004化g/mL)3mL，加溶剂稀释至刻度，摇 匀，滤过，取续滤液，即得，同法配制Ξ份。另外，按照上述拟定的方法制备异构体对照品溶 液，精密吸取供试品溶液及异构体对照品溶液20化进样测定，记录色谱图，并计算上述成分 的测得量及回收率，其结果见表8。
[0294] 表8对映异构体回收率试验结果表
[0295]
[0296] W上试验结果表明，该法测定异构体的含量，回收率较好，测定的回收率的相对标 准偏差较小，准确度较高。
[0297] 综上所述，本发明阿普斯特中对映异构体的检测方法，将阿普斯特中对映异构体 分离检测出来，检测结果准确、可靠，并且具有线性关系优异、精密度高、稳定性好、重复性 好、回收率好、操作简便、成本低等诸多优点，适合于推广应用。
【主权项】
1. 阿普斯特中对映异构体(1)的检测方法，其特征在于:它包括以下步骤：a、 制备供试品溶液： 取待测阿普斯特样品，流动相溶解，过滤或不过滤，制备得到供试品溶液； b、 制备对映异构体(1)的对照品溶液： 取对映异构体(1)对照品，流动相溶解，制备得到对映异构体(1)的对照品溶液； c、 分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下： 色谱柱:α-酸性糖蛋白手性色谱柱； 流动相：甲基叔丁基醚与Cl~C4醇类溶剂的混合溶剂； 检测波长:230 ± IOnm，优选的检测波长为230 ± 2nm; d、 根据检测结果计算得到阿普斯特样品中对映异构体(1)的含量。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:步骤c中，所述色谱柱的规格为：内径 4.6mm，长度150mm，填料粒径5μηι。3. 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于:步骤c中，所述色谱柱的型号为CHIRAL AGP。4. 根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于:步骤c中，所述Cl~C4醇类溶 剂为乙醇、异丙醇或正丁醇。5. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于:步骤c中，所述甲基叔丁基醚与醇类溶 剂的体积比为70% :30%~90%: 10%。6. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于:步骤c中，所述流动相为下述体积比的 混合溶剂： 甲基叔丁基醚:正丁醇=70:30、甲基叔丁基醚:正丁醇=75:25、甲基叔丁基醚:正丁醇 =90:10、甲基叔丁基醚：乙醇=70:30、甲基叔丁基醚：乙醇=75:25、甲基叔丁基醚：乙醇= 90:10、正庚烷：乙醇=90:10、甲基叔丁基醚:异丙醇=70:30、甲基叔丁基醚:异丙醇=75: 25或甲基叔丁基醚:异丙醇=90:10;优选甲基叔丁基醚:正丁醇=75:25。7. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤a中，供试品溶液的浓度为0.1~ 0.3mg/mL;步骤b中，对照品溶液的浓度为0· 1~I .Oyg/mL。8. 根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于:步骤c中，所述色谱条件的柱温为 30°C~40°C，优选的柱温为30°C~35°C;流速为0.8mL/min~1.2mL/min，优选的流速为 0·8mL/min~1·0mL/min 〇9. 根据权利要求4-8任一项所述的检测方法，其特征在于:步骤c中，所述流动相为甲基 叔丁基醚：乙醇、异丙醇或正丁醇体积比为75:25的混合溶剂，且所述色谱条件的柱温为30 °C，流速为 0.8mL/min。10. 根据权利要求1-9任一项所述的检测方法，其特征在于：步骤C中，所述色谱条件的 进样量为20yL。11. 根据权利要求1-10任一项所述的检测方法，其特征在于:所述阿普斯特样品是阿普 斯特片剂。
【专利摘要】本发明公开了一种阿普斯特中对映异构体(Ⅰ)的检测方法。该方法采用的是蛋白质型手性色谱柱，在克服了现有淀粉涂覆型手性柱的寿命较短缺点的同时，有效将阿普斯特中对映异构体分离检测出来，检测结果准确、可靠，并且具有线性关系优异、精密度高、稳定性好、重复性好、回收率好、操作简便、成本低等诸多优点，适合于推广应用。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/74, G01N30/60
【公开号】CN105486785
【申请号】CN201510982153
【发明人】宋务雄, 孙毅
【申请人】成都百裕金阁莱药业有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月23日
【技术领域】
[0001] 本发明设及阿普斯特中对映异构体杂质的检测方法。
【背景技术】
[0002] 阿普斯特(apremilast，（S)-2-[l-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基）-2-甲横酷基乙基]-4-乙酷基氨基异日引噪嘟-1,3-二酬，分子式:〔22也4N2化S，分子量:460.5)是由美国Celgene生 物技术公司开发，2014年3月21日经美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于成人活跃型银 屑病性关节炎(PsA)的治疗，商品名为化ezla。
[0003]
[0004] 阿普斯特是一种手性药物，其有效构型为S构型。因此，在阿普斯特产品中，其財勾 型异构体杂质（I)的存在会严重影响产品的用药安全和临床效果，有必要对阿普斯特中的 杂质（I)含量进行检测，W有效监控阿普斯特的质量。
[0005] 中国专利〔化044589614(公开日2015.03.25)公开了一种阿普斯特有关物质的方 法，该方法使用AD-H色谱柱，流动相为正己烧/异丙醇/二乙胺/Ξ氣乙酸= 80/20/0.2/0.5， 流速1. OmL/min，柱溫40°C，检测波长240nm。专利CN104792913A(公开日2015.07.22)中对其 方法进行了验证，发现阿普斯特与其对映异构体体的分离度只有1.26,小于1.5,没有完全 将两者分离。可见，该方法无法准确测定阿普斯特中对映异构体的含量。
[0006] 中国专利CN104792913A(公开日 2015.07.22)、CN105136933A(公开日 2015.12.09)、CN104820028A(公开日2015.08.05) W及一篇文献(蒙发明，HPLC法测定阿普 斯特对映异构体，化工中间体，2015年03期，第37-38页)均公开了阿普斯特对映异构体的分 离检测方法，其中CN104792913A和CN105136933A采用是AD-H手性色谱柱，而CN104820028A 和前述文献采用的是AS-H手性色谱柱。
[0007] 可见，现有报道的方法中，采用的手性柱均属于纤维素型手性色谱柱，且均是由淀 粉替代纤维素制成的。然而，因为淀粉是水溶性的，流动相中必须绝对无水才能保证柱子寿 命。不可避免的，使用较长时间W后，该类色谱柱会受到损害，使用寿命较短。
[000引另外，该类色谱柱的缺点是只能用于正相，且价格昂贵，使用过程中，稍有不慎就 会造成色谱柱的柱效降低、堵塞甚至不能使用。
[0009]因此，有必要寻找到价格便宜，使用范围更广的，并且能够准确检测阿普斯特中对 映异构体杂质的其他类型手性色谱柱。
【发明内容】
[0010] 为解决上述问题，本发明提供了一种利用蛋白质型手性色谱柱的阿普斯特中对映 异构体(1)的检测方法，它包括W下步骤：
[0011]
[001^ a、制备供试品溶液：
[0013] 取待测阿普斯特样品，流动相溶解，过滤或不过滤，制备得到供试品溶液；
[0014] b、制备对映异构体(1)的对照品溶液：
[0015] 取对映异构体(1)对照品，流动相溶解，制备得到对映异构体(1)的对照品溶液；
[0016] C、分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下： [0017]色谱柱:α-酸性糖蛋白手性色谱柱，即用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色 谱柱；
[0018] 流动相：甲基叔下基酸与C1~C4醇类溶剂的混合溶剂;所述C1~C4醇类溶剂包括 甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正下醇、异下醇和叔下醇。
[0019] 检现贩长：230 ± lOnm，优选的检现贩长为230 ± 2nm;
[0020] d、根据检测结果计算得到阿普斯特样品中对映异构体（I)的含量。在本发明具体 的实施例中，采用的是外标法计算。
[0021] 所述阿普斯特样品可选自阿普斯特原料或者阿普斯特制得的片剂或者其他的剂 型。
[0022] 进一步地，步骤C中，所述色谱柱的规格为：内径4.6mm，长度150mm，填料粒径5皿。 更进一步地，步骤C中，所述色谱柱的型号为CHIRAL AGP。
[0023] 进一步地，步骤c中，所述Cl~C4醇类溶剂为乙醇、异丙醇或正下醇。
[0024] 进一步地，步骤C中，所述甲基叔下基酸与醇类溶剂的体积比为70% :30%~90% : 10%。
[0025] 更进一步地，步骤C中，所述流动相为下述体积比的混合溶剂：
[00%] 甲基叔下基酸:正下醇=70:30、甲基叔下基酸:正下醇=75:25、甲基叔下基酸:正 下醇=90:10、甲基叔下基酸：乙醇=70:30、甲基叔下基酸：乙醇=75:25、甲基叔下基酸：乙 醇=90:10、正庚烧：乙醇=90:10、甲基叔下基酸:异丙醇=70:30、甲基叔下基酸:异丙醇= 75:25或甲基叔下基酸:异丙醇=90:10;优选甲基叔下基酸:正下醇=75:25。
[0027] 进一步地，步骤a中，供试品溶液的浓度为0.1~0.3mg/mM步骤b中，对照品溶液的 浓度为0.1~l.Oyg/mL。
[0028] 进一步地，步骤C中，所述色谱条件的柱溫为30°C~40°C，优选的柱溫为30°C~35 °C;流速为ο. 8mL/min~1.2mL/min，优选的流速为ο. 8mL/min~1. OmL/min。
[0029] 进一步地，步骤c中，所述流动相为甲基叔下基酸：乙醇、异丙醇或正下醇体积比为 75:25的混合溶剂，且所述色谱条件的柱溫为30°C，流速为0.8mL/min。
[0030] 进一步地，步骤C中，所述色谱条件的进样量为20化。
[0031] 本发明阿普斯特中对映异构体的检测方法，采用的是蛋白质型手性色谱柱，使用 范围较广，价格较低，使用寿命较长。在克服了现有淀粉涂覆型手性柱的寿命较短缺点的同 时，有效将阿普斯特中对映异构体分离检测出来，检测结果准确、可靠，并且具有线性关系 优异、精密度高、稳定性好、重复性好、回收率好、操作简便、成本低等诸多优点，适合于推广 应用。
[0032] 同时，本发明方法所采用蛋白质型的手性色谱柱。
[0033] 而且，根据Irving Wainer基于手性固定相和溶剂的相互作用机制提出的手性色 谱柱的分类体系：
[0034] 第1类:通过氨键、π-π作用、偶级-偶级作用形成复合物。
[0035] 第2类:既有类型1中的相互作用，又存在包埋复合物。
[0036] 第3类:基于溶剂进入手性空穴形成包埋复合物。
[0037] 第4类:基于形成非对映体的金属络合物。
[0038] 第5类:基于疏水相互作用和极性相互作用实现手性分离。
[0039] 现有报道中的纤维素型手性色谱柱属于典型的第2类手性柱，而本发明提供的蛋 白质型手性色谱柱属于第5类。可见，本发明提供的蛋白质型手性色谱柱也为准确检测阿普 斯特中的对映异构体杂质，提供了一条全新的色谱柱选择途径。
[0040] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可W做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0041] W下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于W下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0042] 图1为实施例1本发明方法对系统适用性试验的检测结果。
[0043] 图2为对比实施例1对混合溶液的检测结果。
[0044] 图3为实施例11的标准曲线图。
[0045] 图4-6为实施例11的检测结果，图4为(a)供试品溶液;图5为(b)对照品溶液；图6为 (C)阴性样品溶液。
【具体实施方式】
[0046] 本发明【具体实施方式】中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
[0047] 高效液相色谱仪(型号:LC-20AT二元累，生产厂家：日本岛津公司）；
[004引电子天平(型号:AUW220D，生产厂家：日本岛津公司）。
[0049] 阿普斯特片(批号：140501，来源:成都百裕制药股份有限公司）
[0050] 对映异构体对照品（批号:P化-A012，来源:迈斯克医药科技有限公司）
[0化1]实施例1
[0052] 1、检测波长的确定
[0053] 取阿普斯特片，研细，精密称取适量，用流动相（甲基叔下基酸-正下醇= 75:25)配 制成浓度为20yg/mL的溶液，作为供试品溶液。
[0054] 精密称取对照品（对映异构体)适量，用流动相（甲基叔下基酸-正下醇= 75:25)配 制成浓度为20yg/mL的溶液，作为对照品溶液。
[0055] 取上述的供试品溶液、对照品溶液，在200皿~40化m波长范围内进行扫描，试验结 果见表1。
[0056] 表1、本发明的紫外扫描结果 [0化7]
[0058]试验结果表明，检测波长在220nm~240nm范围内，均适合本发明的高效液相色谱 检测。
[0化9] 2、系统适用性试验：
[0060] 取阿普斯特、对映异构体各20yg，加入ImL流动相(正己烧-乙醇= 75:25)，作为系 统适用性溶液;量取20化系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，阿普斯特与对映异 构体之间的分离度应不低于2.0，理论塔板数按阿普斯特峰计算应不小于2000。
[0061] 采用正相高效液相色谱 进行检测：
[0062] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[0063] 色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0064] 流动相：甲基叔下基酸-正下醇(体积比为75:25);
[0065] 柱溫：35°C;
[0066] 流速：1.0mL/min;
[0067] 检测波长:230nm;
[006引进样量:2化L。
[0069] 系统适用性试验的检测结果见图1，阿普斯特(保留时间为6.353min)与对映异构 体(保留时间为5.345min)之间的分离度为3.654,理论塔板数(按阿普斯特峰计算)为7349。
[0070] 可见，该色谱条件可W准确检测阿普斯特中的对映异构体。
[0071 ] 3、高效液相色谱法检测
[0072] 制备供试品溶液:称取阿普斯特片，研细，称取lOOmg，置于50mL量瓶中，加流动相 (甲基叔下基酸-正下醇= 75:25)适量，振摇20分钟，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续 滤液作为供试品溶液。
[0073] 制备对照品溶液：称取对映异构体（I)对照品2mg，置于lOOmL量瓶中，精密量取 ImL，置于lOOmL量瓶中，加流动相（甲基叔下基酸-正下醇= 75:25)稀释至刻度，摇匀，作为 对照品溶液。
[0074] 分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，采用正相高效液相色 谱进行检测，色谱条件如下：
[0075] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[0076] 色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0077] 流动相：甲基叔下基酸-正下醇(体积比为75:25);
[007 引柱溫：35°C;
[0079] 流速：1.0mL/min;
[0080] 检测波长：230nm;
[0081 ]进样量:20yL。
[0082] 根据检测结果，按照外标法计算得到阿普斯特片中对映异构体的含量为0.03%。
[0083] 对比例实施例1
[0084] 采用反相高效液相色谱进行检测：
[0085] 按照阿普斯特片自拟质量标准进行的有关物质检测方法：
[0086] 色谱柱的填充剂：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Inedsil 0DS3,50X 4.6皿，5皿或其他性能相当色谱柱）；
[0087] 流动相：W0.0 5mol/L憐酸二氨钟溶液-甲醇(50:50)为流动相；
[0088] 流速：1.0mL/min;
[0089] 检测波长:230nm;
[0090] 混合溶液:取阿普斯特、对映异构体各20yg，加入ImL流动相，作为混合溶液；
[0091] 制备供试品溶液:取阿普斯特片，研细，称取lOOmg，置于50mL量瓶中，加流动相适 量，振摇20分钟，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0092] 制备对照品溶液:称取对照品2mg，置于lOOmL量瓶中，精密量取ImL，置于lOOmL量 瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
[0093] 混合溶液的检测结果如图2所示。
[0094] 结果显示阿普斯特与对映异构体的色谱峰重叠在一起，该色谱条件不能准确检测 阿普斯特中的对映异构体。
[00巧]对比例实施例2
[0096] 采用正相高效液相色谱进行检测：
[0097] 色谱柱的填充剂：用直链淀粉-Ξ(3-氯-4甲基苯基氨基甲酸醋)键合的硅胶为填 充剂的色谱柱；
[0098] 色谱柱的型号为CHIRAL ΡΑΚ IF，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径 为如m;
[0099] 流动相：正己烧-乙醇（75:25);
[0100] 柱溫：35°C;
[0101] 流速：1.0mL/min;
[0102] 检测波长:230nm;
[0103] 进样量：20yL。
[0104] 按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿普斯特（保留时间为 7.017min)与对映异构体(供其保留时间为6.579min)之间的分离度为1.485，理论塔板数 (按阿普斯特峰计算)为4721，阿普斯特峰的拖尾因子为1.281，主峰对称性较差，本色谱系 统基线波动较大，主峰与异构体之间的分离度小于1.5,不符合药典规定的要求。
[0105] 该色谱条件不能准确检测阿普斯特中的对映异构体。
[0106] 对比实施例3
[0107] 采用正相高效液相色谱进行检测：
[0108] 色谱柱的填充剂：用直链淀粉-Ξ(3-氯-4甲基苯基氨基甲酸醋)键合的硅胶为填 充剂的色谱柱；
[0109] 色谱柱的型号为CHIRAL ΡΑΚ IF，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径 为如m;
[0110] 流动相:正己烧-乙醇(90:10);
[0111] 柱溫：35°C;
[0112] 流速：1.0mL/min;
[0113] 检测波长:230nm;
[0114] 进样量:20yL。
[0115] 按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿普斯特（保留时间为 4.012miη)与对映异构体(供其保留时间为3.87 Imiη)之间的分离度为0.721，理论塔板数 (按阿普斯特峰计算)为7713,阿普斯特峰的拖尾因子为1.052,基线波动大，主峰与异构体 之间的分离度小于1.5,不符合药典规定的要求。
[0116] 该色谱条件不能准确检测阿普斯特中的对映异构体。
[0117] 实施例2
[0118] 采用正相高效液相色谱进行检测：
[0119] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[0120] 色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0121] 流动相：甲基叔下基酸-正下醇(75:25);
[0122] 柱溫:35°C;
[0123] 流速：1.0mL/min;
[0124] 检测波长:230nm;
[0125] 进样量:20yL。
[0126] 按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿普斯特（保留时间为 6.353111111)与对映异构体(供其保留时间为5.%5111111)之间的分离度为3.654，理论塔板数 (按阿普斯特峰计算)为7349,阿普斯特峰的拖尾因子为0.975。
[0127] 可见，该色谱条件可W准确检测阿普斯特中的对映异构体。
[012引实施例3
[0129] 采用正相高效液相色谱进行检测：
[0130] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[0131] 色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0132] 流动相：甲基叔下基酸-正下醇(70:30);
[0133] 柱溫:35°C;
[0134] 流速：1.0mL/min;
[0135] 检测波长:230nm;
[0136] 进样量:20yL。
[0137] 按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿普斯特（保留时间为 10.115min)与对映异构体(供其保留时间为8.725min)之间的分离度为4.128，理论塔板数 (按阿普斯特峰计算)为8107,阿普斯特峰的拖尾因子为1.08。
[0138] 可见，该色谱条件可W准确检测阿普斯特中的对映异构体。
[0139] 实施例4
[0140] 采用正相高效液相色谱进行检测：
[0141] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[0142] 色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0143] 流动相：甲基叔下基酸-正下醇(90:10);
[0144] 柱溫:35°C;
[0145] 流速：1.0mL/min;
[0146] 检测波长：230nm;
[0147] 进样量：20yL。
[0148] 按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿普斯特（保留时间为 S.Ollmin)与对映异构体(供其保留时间为4.323min)之间的分离度为1.951，理论塔板数 (按阿普斯特峰计算)为12037,阿普斯特峰的拖尾因子为1.007。
[0149] 可见，该色谱条件可W准确检测阿普斯特中的对映异构体。
[0150] 实施例5
[0151] 采用正相高效液相色谱进行检测：
[0152] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[0153] 色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0154] 流动相：甲基叔下基酸-乙醇(70:30);
[015 引柱溫：35°C;
[0156] 流速：1 .OmL/min;
[0157] 检测波长：230nm;
[0158] 进样量：20yL。
[0159] 按照实施例1 的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿普斯特（保留时间为 9.228min)与对映异构体(供其保留时间为8.01 Imin)之间的分离度为3.055，理论塔板数 (按阿普斯特峰计算)为8877,阿普斯特峰的拖尾因子为1.035。
[0160] 可见，该色谱条件可W准确检测阿普斯特中的对映异构体。
[0161] 实施例6
[0162] 采用正相高效液相色谱进行检测：
[0163] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[0164] 色谱柱的型号为CHIRAL AGP,规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[01化]流动相：甲基叔下基酸-乙醇(90:10);
[0166] 柱溫：35。。
[0167] 流速：1.0mL/min;
[0168] 检测波长:230nm;
[0169] 进样量:20yL。
[0170] 按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿普斯特（保留时间为 5.517min)与对映异构体(供其保留时间为4.229min)之间的分离度为1.876，理论塔板数 (按阿普斯特峰计算)为11039,阿普斯特峰的拖尾因子为0.982。
[0171] 可见，该色谱条件可W准确检测阿普斯特中的对映异构体。
[0172] 实施例7
[0173] 采用正相高效液相色谱进行检测：
[0174] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[01巧]色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0176] 流动相：甲基叔下基酸-异丙醇(70:30);
[0177] 柱溫:35°C;
[017 引 流速：1.0mL/min;
[0179] 检测波长:230nm;
[0180] 进样量：20yL。
[0181] 按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿普斯特（保留时间为 17.813111111)与对映异构体(供其保留时间为16.055111111)之间的分离度为3.379，理论塔板数 (按阿普斯特峰计算)为9527,阿普斯特峰的拖尾因子为1.028。
[0182] 可见，该色谱条件可W准确检测阿普斯特中的对映异构体。
[0183] 实施例8
[0184] 采用正相高效液相色谱进行检测：
[0185] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[01化]色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0187] 流动相：甲基叔下基酸-异丙醇(90:10);
[0188] 柱溫：35。。
[0189] 流速：1.0mL/min;
[0190] 检测波长:230nm;
[0191] 进样量:20yL。
[0192] 按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿普斯特（保留时间为 10.803111111)与对映异构体(供其保留时间为8.058111111)之间的分离度为4.121，理论塔板数 (按阿普斯特峰计算)为8859,阿普斯特峰的拖尾因子为1.056。
[0193] 可见，该色谱条件可W准确检测阿普斯特中的对映异构体。
[0194] 实施例9
[01 Μ]采用正相高效液相色谱进行检测：
[0196] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[0197] 色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0198] 流动相：甲基叔下基酸-异丙醇(75:25);
[0199] 柱溫:30°C;
[0200] 流速:0.8mL/min;
[0201] 检测波长:230nm;
[0202] 进样量:20yL。
[0203] 按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿普斯特（保留时间为 8.757min)与对映异构体(供其保留时间为6.023min)之间的分离度为8.147，理论塔板数 (按阿普斯特峰计算)为7133,阿普斯特峰的拖尾因子为1.039。
[0204] 可见，该色谱条件可W准确检测阿普斯特中的对映异构体。
[0205] 实施例10
[0206] 采用正相高效液相色谱进行检测：
[0207] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[020引色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0209] 流动相：甲基叔下基酸-异丙醇(75:25);
[0210] 柱溫:40°C; 流速：1.2mL/min;
[0212]检现贩长：230nm;
[0213] 进样量：20化。
[0214] 按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：阿普斯特（保留时间为 5.503111111)与对映异构体(供其保留时间为4.727111111)之间的分离度为2.513，理论塔板数 (按阿普斯特峰计算)为9586,阿普斯特峰的拖尾因子为0.998,本发明正相高效液相色谱可 W用于检测阿普斯特中的对映异构体。
[0215] 实施例11本发明的色谱条件筛选
[0216] 1、流动相筛选试验
[0217] 选择不同的流动相进行筛选试验，其他色谱条件如下：
[0218] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[0219] 色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0220] 流动相:表2;
[02別]柱溫：35。。
[0222] 流速：1.0mL/min;
[0223] 检测波长:230nm;
[0224] 进样量:20yL。
[0225] 按照实施例1的方法进行系统适用性试验，检测结果见表2:
[0226] 表2、流动相筛选试验结果
[0227]
[022引'表2中，流动相"例如：甲基叔T基酸-正下醇(75:25)"具有中国药典2015年版通常' 具有的含义，其中75:25表示甲基叔下基酸与正下醇的体积比;保留时间是指阿普斯特的保 留时间；分离度是指阿普斯特与对映异构体之间的分离度;拖尾因子是指阿普斯特峰的拖 尾因子;理论塔板数是指理论塔板数(按阿普斯特峰计算）。
[0229] 试验结果表明，流动相为甲基叔下基酸-正下醇（70 :30)、甲基叔下基酸-正下醇 (75:25 )、甲基叔下基酸-正下醇(90:10 )、甲基叔下基酸-乙醇（70:30 )、甲基叔下基酸-乙醇 (75 : 25)、甲基叔下基酸-乙醇（90:10)正庚烧-乙醇（90:10)、甲基叔下基酸-异丙醇（70: 30)、甲基叔下基酸-异丙醇（75:25)、甲基叔下基酸-异丙醇(90:10)时，均适合用于检测阿 普斯特中的对映异构体。
[0230] 2、柱溫和流速筛选试验
[0231] 选择不同的柱溫和流速进行筛选试验，其他色谱条件如下：
[0232] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[0233] 色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0234] 流动相：甲基叔下基酸-正下醇(75:25);
[0235] 柱溫:表3;
[0236] 流速:表3;
[0237] 检测波长:230nm;
[023引进样量:2化L。
[0239] 按照实施例1的方法进行系统适用性试验，检测结果见表3:
[0240] 表3、柱溫和流速筛选试验结果
[0241]
[0242] 表3中，保留时间是指阿普斯特的保留时间；分离度是指阿普斯特与对映异构体之 间的分离度;拖尾因子是指阿普斯特峰的拖尾因子;理论塔板数是指理论塔板数(按阿普斯 特峰计算）。
[0243] 试验结果表明，不同的柱溫和流速下，本发明方法均能有效准确检测阿普斯特异 构体。优选的柱溫为30°C~35°C;流速为0.8mL/min~1. OmL/min。
[0244] 实施例12本发明方法的方法学验证
[0245] 方法学验证中，色谱条件均如下：
[0246] 色谱柱:用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色谱柱；
[0247] 色谱柱的型号为CHIRAL AGP，规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填充剂粒径为5 μL?;
[0248] 流动相：甲基叔下基酸-正下醇(75:25);
[0249] 柱溫:35°C;
[0 巧 0]流速：1.0mL/min;
[0巧1] 检测波长：230nm;
[0巧2] 进样量：2化L。
[0巧3] 1、线性关系
[0254] 按照本发明方法制备对照品溶液，用流动相稀释制成表4中一系列浓度的对照品 溶液。按照上述色谱条件，分别进行检测，检测结果见表4。
[0255] 表4、线性关系试验的检测结果 「Π 95Α1
[0257]~~W异构体浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为:Υ = 10179X+1593，r2 = 0.999。
[Ο巧引试验 结果表明，异构体的浓度在0.0993yg/mL~0.7947yg/mL范围内，其峰面积与 测定浓度呈良好的线性关系。
[0259] 2、专属性
[0260] 按照本发明方法制备供试品溶液、对照品溶液。
[0261] 取水乳糖lOg、交联簇甲基纤维钢Ig、微晶纤维素2.1g、硬脂酸儀0.5g，W上四种辅 料，混匀;按照类似方法制备阴性样品溶液。
[0%2]进样量:20yL。
[0263] 精密量取上述各溶液20化注入液相色谱仪，记录色谱图，见图4-6,分别为：（a)供 试品溶液;（b)对照品溶液;（C)阴性样品溶液。
[0264] 试验结果表明，阴性样品溶液不会对本发明正相高效液相色谱检测阿普斯特中对 映异构体的方法造成干扰。
[02化]3、精密度
[0266] 取对照品对映异构体适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1 m L中含 0.2yg的溶液，作为对照品溶液；
[0267] 精密量取SOliL对照品溶液，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图。
[0268] 检测结果见表5。
[0269] 表5、精密度试验的检测结果
[0270]
[0271 ]试验结果表明，本发明方法精密度良好。
[0272] 4、稳定性
[0273] 取阿普斯特片，按照本发明方法将其配制成供试品溶液和对映对照品溶液，取供 试品溶液分别于化、2}1、地、6}1、化进样检测;精密量取20化对照品溶液，注入液相色谱仪，按 外标法W峰面积计算供试品中对映异构体的含量，结果见表6。
[0274] 表6、稳定性试验的检测结果
[0275]
[0276] 试验结果表明，本发明方法配制的供试品溶液稳定性良好。
[0277] 5、重复性
[0278] 取阿普斯特片，按照本发明方法将其配制成供试品溶液，分别平行制备6份供试品 溶液，并制备对映对照品溶液;精密量取SOliL对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱 仪，按外标法W峰面积计算供试品中对映异构体的含量，结果见表7。
[0279] 表7、重复性试验的检测结果
[0280]
[0281 ]试验结果表明，本发明方法的重复性好。
[0282] 6、色谱条件与系统适用性
[0283] 取阿普斯特及对映异构体适量，加流动相制成每ImL中各含20yg的溶液，作为系统 适用性溶液;量取SOiiL系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，阿普斯特与对映异构 体之间的分离度应不低于2.0，理论塔板数按阿普斯特峰计算应不小于2000。
[0284] 制备供试品溶液:取阿普斯特片，研细，称取lOOmg，置于50mL量瓶中，加流动相（甲 基叔下基酸-正下醇= 75:25)适量，振摇20分钟，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤 液作为供试品溶液。
[0285] 制备对照品溶液:称取对照品（对映异构体)2mg，置于lOOmL量瓶中，精密量取ImL， 置于lOOmL量瓶中，加流动相（甲基叔下基酸-正下醇= 75:25)稀释至刻度，摇匀，作为对照 品溶液。
[0286] 取对照品溶液20化，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使对映异构体色谱峰的峰 高约为记录仪满量程的20%，再精密量取供试品溶液与对照品溶液各20化，分别注入液相 色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如果显示对映异构体峰，按外标法W峰面积计 算对映异构体的含量不得过0.1 %。按照上述的方法，分别对两种不同规格（规格：l〇mg、 30mg)的阿普斯特片进行检测3次。
[0287] 试验结果表明，供试品中对映异构体的检测结果均未超过0.1%，阿普斯特与对映 异构体达到良好的基线分离。
[028引 7、定量限和检测限
[0289] 称取对映异构体5.07mg，置于25mL量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，作 为对照品溶液，精密量取1. OmL，置于lOOmL量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，再精 密量取ImL，置20mL量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，再精密量取ImL，置20mL量瓶 中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，作为定量限试验的检测溶液（S/N a 10);精密量取 3mL，置lOmL量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，作为检测限试验的检测溶液(S/N -3);
[0290] 测得对映异构体定量限为4.965ng/mL。
[0291] 测得对映异构体检测限为1.4Wng/mL。
[0292] 8、回收率
[0293] 浓度1:取一水乳糖lOg、交联簇甲基纤维钢Ig、微晶纤维素2.1g、硬脂酸儀0.5g上 述四种辅料混匀，称取约o.lg，置于50mL量瓶中，加入阿普斯特对映异构体对照品胆备液 (浓度:4.004化g/mL)2mL，加溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，同法配制Ξ份； 浓度2:取按处方比例制备的空白辅料，称取约0.1 g，置于50mL量瓶中，加入阿普斯特对映异 构体对照品胆备液(浓度:4.004化g/mL)2.5mL，加溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液， 即得，同法配制立份;浓度3:取按处方比例制备的空白辅料，称取约O.lg，置于50mL量瓶中， 加入阿普斯特对映异构体对照品胆备液(浓度:4.004化g/mL)3mL，加溶剂稀释至刻度，摇 匀，滤过，取续滤液，即得，同法配制Ξ份。另外，按照上述拟定的方法制备异构体对照品溶 液，精密吸取供试品溶液及异构体对照品溶液20化进样测定，记录色谱图，并计算上述成分 的测得量及回收率，其结果见表8。
[0294] 表8对映异构体回收率试验结果表
[0295]
[0296] W上试验结果表明，该法测定异构体的含量，回收率较好，测定的回收率的相对标 准偏差较小，准确度较高。
[0297] 综上所述，本发明阿普斯特中对映异构体的检测方法，将阿普斯特中对映异构体 分离检测出来，检测结果准确、可靠，并且具有线性关系优异、精密度高、稳定性好、重复性 好、回收率好、操作简便、成本低等诸多优点，适合于推广应用。
【主权项】
1. 阿普斯特中对映异构体(1)的检测方法，其特征在于:它包括以下步骤：a、 制备供试品溶液： 取待测阿普斯特样品，流动相溶解，过滤或不过滤，制备得到供试品溶液； b、 制备对映异构体(1)的对照品溶液： 取对映异构体(1)对照品，流动相溶解，制备得到对映异构体(1)的对照品溶液； c、 分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下： 色谱柱:α-酸性糖蛋白手性色谱柱； 流动相：甲基叔丁基醚与Cl~C4醇类溶剂的混合溶剂； 检测波长:230 ± IOnm，优选的检测波长为230 ± 2nm; d、 根据检测结果计算得到阿普斯特样品中对映异构体(1)的含量。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:步骤c中，所述色谱柱的规格为：内径 4.6mm，长度150mm，填料粒径5μηι。3. 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于:步骤c中，所述色谱柱的型号为CHIRAL AGP。4. 根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于:步骤c中，所述Cl~C4醇类溶 剂为乙醇、异丙醇或正丁醇。5. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于:步骤c中，所述甲基叔丁基醚与醇类溶 剂的体积比为70% :30%~90%: 10%。6. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于:步骤c中，所述流动相为下述体积比的 混合溶剂： 甲基叔丁基醚:正丁醇=70:30、甲基叔丁基醚:正丁醇=75:25、甲基叔丁基醚:正丁醇 =90:10、甲基叔丁基醚：乙醇=70:30、甲基叔丁基醚：乙醇=75:25、甲基叔丁基醚：乙醇= 90:10、正庚烷：乙醇=90:10、甲基叔丁基醚:异丙醇=70:30、甲基叔丁基醚:异丙醇=75: 25或甲基叔丁基醚:异丙醇=90:10;优选甲基叔丁基醚:正丁醇=75:25。7. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤a中，供试品溶液的浓度为0.1~ 0.3mg/mL;步骤b中，对照品溶液的浓度为0· 1~I .Oyg/mL。8. 根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于:步骤c中，所述色谱条件的柱温为 30°C~40°C，优选的柱温为30°C~35°C;流速为0.8mL/min~1.2mL/min，优选的流速为 0·8mL/min~1·0mL/min 〇9. 根据权利要求4-8任一项所述的检测方法，其特征在于:步骤c中，所述流动相为甲基 叔丁基醚：乙醇、异丙醇或正丁醇体积比为75:25的混合溶剂，且所述色谱条件的柱温为30 °C，流速为 0.8mL/min。10. 根据权利要求1-9任一项所述的检测方法，其特征在于：步骤C中，所述色谱条件的 进样量为20yL。11. 根据权利要求1-10任一项所述的检测方法，其特征在于:所述阿普斯特样品是阿普 斯特片剂。
【专利摘要】本发明公开了一种阿普斯特中对映异构体(Ⅰ)的检测方法。该方法采用的是蛋白质型手性色谱柱，在克服了现有淀粉涂覆型手性柱的寿命较短缺点的同时，有效将阿普斯特中对映异构体分离检测出来，检测结果准确、可靠，并且具有线性关系优异、精密度高、稳定性好、重复性好、回收率好、操作简便、成本低等诸多优点，适合于推广应用。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/74, G01N30/60
【公开号】CN105486785
【申请号】CN201510982153
【发明人】宋务雄, 孙毅
【申请人】成都百裕金阁莱药业有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月23日
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