一种茯苓三萜类化合物的检测方法
一种茯苓三萜类化合物的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及药物化合物检测领域。具体设及一种药物的检测方法，尤其设及一种 食品或药品中巧等Ξ祗类化合物的检测方法。
【背景技术】
[0002] 巧等为多孔菌科真菌化ria cocos(Schw. )Wolf的干燥菌核，性平，味甘、淡，归屯、、 肺、脾、肾经，是一味常用的利水渗湿、健脾和胃、宁屯、安神的中药。常用于水肿尿少、疲饮眩 惇、脾虚食少、便漉泄泻、屯、神不安、惊惇失眠等病症的治疗。现代药理学研究表明，巧等具 有抑制肿瘤、抗炎、抗衰老、调节免疫功能、保肝等多方面的药理作用，在临床上应用广泛， 且效果显著。自70年代W来，中外学者从巧等中分离出了多种Ξ祗化合物，并对其药理作 用、生物活性等方面进行了研究。运些药理研究表明，巧等中所含的Ξ祗类化合物具有明显 的抗肿瘤、抗炎和免疫调节作用，是巧等的重要有效成分
[0003] 此外，CN105085598A公开了，巧等Ξ祗中的巧等酸(pachymic acid)及去氨巧等酸 (dehydropachymic acid)、上莫酉《（tumulosic acid)、去氨上莫酉《（dehydrotumulosic acid)、猪等酸C(polyporenic acid C)、W及3-表-去氨±莫酸（3-邱i-dehy化otumulosic acid)为巧等Ξ祗中的主要成分，也是主要活性物质，具有利尿、抗氧化、抗癌症、抗发炎、抗 高血糖、调节免疫等功效;CN103665679A公开了 一种巧等酸单体的分离纯化方法，其虽然W 巧等为原料，并通过提取、萃取、结晶得到巧等酸单体，但其仅仅得到一种巧等Ξ祗化合物， 对其它巧等Ξ祗化合物如何检测或分离，并未提及。随着巧等Ξ祗的功效被人们广泛认可， 越来越多的食品或药品中添加了巧等Ξ祗类物质，探索建立有效检测食品或药品中巧等Ξ 祗类化合物含量的新方法对于食品或者药品原料的监测具有更加重要的意义。
[0004] 巧等S祗中的巧等酸（pachymic acid)及去氨巧等酸（dehy化opachymic acid)、 上莫酉《（tumulosic acid)、去氨上莫酉《（dehydrotumulosic acid)、猪等酉《C(polyporenic acid C)、W及3-表-去氨±莫酸(3-epi-dehy化otumulosic acid)如下所示：
[0005]
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对目前无法全面、有效、准确地对食品或药品中巧等Ξ祗类主 要活性物质含量检测方法的不足，提供了一种检测方法，该方法简单，易于操作，能够全面、 有效、准确地对食品或者药品中巧等Ξ祗类主要活性物质的含量进行检测，从而为巧等Ξ 祗类化合物在食品中或者药品中的规模化使用提供了技术支持。
[0007] 本发明的目的在于提供了一种巧等Ξ祗类化合物的检测方法。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案：
[0009] -种食品或药品中巧等Ξ祗类化合物的检测方法，该方法包括W下步骤：
[0010] (1)超声提取；
[0011] (2)利用有机溶剂对步骤(1)的产物进行萃取，并用醇溶解；
[0012] (3)对步骤(2)醇溶液进行高效液相色谱检测。
[0013] 优选地，步骤(1)包括下述步骤:称取待测样品，粉碎后配制成样品醇溶液，密塞超 声提取，过滤，再将滤液蒸干;其中，所述粉碎后过的筛网为60目W上;所述超声提取次数为 2~3次，每次20~40min;所述每次使用醇提取的量为样品质量的25~35倍。
[0014] 优选地，步骤(2)包括下述步骤：用有机溶剂对步骤（1)得到的蒸干物质进行萃取 数次，合并有机层，蒸干后，再使用醇溶解;其中，所述使用有机溶剂萃取次数为3次W上，每 次有机溶剂的用量为样品质量的15~25倍;所述蒸干后溶解所需醇的量为4~6mL。
[0015] 优选地，步骤(3)包括下述步骤:取步骤(2)醇溶液进行高效液相色谱检测；其中， 高效液相色谱的检测条件为:采用C18液相色谱柱，流动相由A相和B相组成，进行梯度洗脱， 使用PDA二极管阵列检测器进行检测，其中所述A相为色谱乙腊，B相为含有体积分数0.05 % ~0.5 %的憐酸水溶液，检测波长为210nm和24化m，柱溫为20~40°C，流速为1.7mL/min，所 述梯度洗脱的条件为:〇~33min，流动相A相的体积分数保持为51%，B相的体积分数保持为 49% ; 33~45min，流动相A相的体积分数由51 %升为54%，流动相B相的体积分数由49%降 至46% ;45~51min，流动相A相的体积分数由54%继续升为100%，流动相B相的体积分数由 4 6 %降至0 % ; 51~5 5 m i η，流动相A相的体积分数保持10 0 %，流动相B相的体积分数保持 0% ; 55~55.5min，流动相A相的体积分数由100%降至51 %，流动相B相的体积分数由0%升 至54% ;55.5~60min，流动相A相的体积分数保持51%，流动相財目的体积分数保持54%。
[0016] 更优选地，所述检测方法包括下述步骤：
[0017] (1)称取待测样品，粉碎后配制成样品醇溶液，密塞超声提取，过滤，再将滤液蒸 干;其中，所述粉碎后过的筛网为60目W上;所述超声提取次数为2~3次，每次20~40min; 所述每次使用醇提取的量为样品质量的25~35倍；
[0018] (2)用有机溶剂对步骤(1)得到的蒸干物质进行萃取数次，合并有机层，蒸干后，再 使用醇溶解;其中，所述使用有机溶剂萃取次数为3次W上，每次有机溶剂的用量为样品质 量的15~25倍;所述蒸干后溶解所需醇的量为4~6n止；
[0019] (3)取步骤(2)醇溶液进行高效液相色谱检测;其中，高效液相色谱的检测条件为： 采用C18液相色谱柱，流动相由A相和財目组成，进行梯度洗脱，使用PDA二极管阵列检测器进 行检测，其中所述A相为色谱乙腊，B相为含有体积分数0.05%~0.5%的憐酸水溶液，检测 波长为210nm和24化m，柱溫为20~40°C，流速为1.7mL/min，所述梯度洗脱的条件为：0~ 33min，流动相A相的体积分数保持为51 %，B相的体积分数保持为49% ; 33~45min，流动相A 相的体积分数由51 %升为54%，流动相B相的体积分数由49%降至46% ;45~51min，流动相 A相的体积分数由54%继续升为100%，流动相B相的体积分数由46%降至0% ; 51~55min， 流动相A相的体积分数保持100%，流动相B相的体积分数保持0% ; 55~55.5min，流动相A相 的体积分数由100%降至51 %，流动相B相的体积分数由0%升至54% ; 55.5~60min，流动相 A相的体积分数保持51 %，流动相B相的体积分数保持54%。
[0020] 所述的巧等Ξ祗类化合物主要是起主要药理作用的巧等Ξ祗类物质，分别为：巧 等酸（pachymic acid，PA)及去氨巧等酸（dehy化opachymic acid，DPA)、±莫酸（tumulosic 曰。1(1，了4)、去氨±莫酸（(16117(11'〇1:加1111〇3；[0日。1(1，0了4)、猪等酸"901790'6]1；[03。1(1〔， PAC)、W及3-表-去氨±莫酸（3-epi-dehy化otumulosic acid，EDA)。
[0021 ] 所述的巧等Ξ祗类化合物的保留时间为：PA为52.17min、DPA为52.57min、TA为 25.47min、DTA为29.07min、PAC为41.98min、EDA为47.70min。
[0022] 所述的样品，其可W是食品、药品、药材、药材提取物或者它们的混合物。
[0023] 所述的醇，其可W是甲醇、乙醇、异丙醇或正下醇中的一种或几种。
[0024] 所述的有机溶剂，其可W是乙酸乙醋、乙酸下醋、氯仿或二氯甲烧中的一种或几 种。
[0025] 本发明通过两步预处理有效地去除了食品或者药品中的干扰物质，通过常规的高 效液相色谱法就可W完成食品或药品中的巧等Ξ祗类化合物各物质的含量检测，为了使本 领域技术人员更好地实施本发明，在此提供一种优选的高效液相色谱检测方法，本液相检 测方法使被检测的巧等Ξ祗均能与其他杂质分离开来，分离度均大于1.5,并且各Ξ祗的色 谱峰具有较好的对称性，对称因子均保证在0.8~1.2，具体色谱条件如下：
[0026] 高效液相色谱的检测条件为:采用C18液相色谱柱，流动相由A相和B相组成，进行 梯度洗脱，使用PDA二极管阵列检测器进行检测，其中所述A相为色谱乙腊，B相为含有体积 分数0.05 %~0.5 %的憐酸水溶液，检测波长为2 lOnm和24化m，柱溫为20~40°C，流速为 1.7mL/min，
[0027] 优选的梯度洗脱条件为:0~33min，流动相A相的体积分数保持为51%，A相的体积 分数保持为49% ;33~45min，流动相A相的体积分数由51 %升为54%，流动相B相的体积分 数由49 %降至46 % ; 45~5 Imin，流动相A相的体积分数由54 %继续升为100 %，流动相B相的 体积分数由46 %降至0 % ; 51~55min，流动相A相的体积分数保持100 %，流动相B相的体积 分数保持0 % ; 55~55.5min，流动相A相的体积分数由100 %降至51 %，流动相B相的体积分 数由0%升至54%;55.5~60min，流动相A相的体积分数保持51 %，流动相財目的体积分数保 持 54 %。
【附图说明】
[002引图1:波长210nm下化合物DTA与DPA的色谱图；
[0029] 图2:波长243nm下化合物PA、TA、PAC W及邸A的色谱图。 实施例
[0030] 下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述方法 仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方 法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。如无特别说明，实施例中用到的所有原料和 溶齐。均贝勾自 Si邑m曰 Biochemical and Organic Compounds for Research 曰nd Diagnostic Clinical Reagents公司。
[0031 ] 实施例1:
[0032] 分别准确称取2mg PA、DPA、ΤΑ、DTA、PAC及抓A对照品，用甲醇溶解并定容于1 OmL， 即浓度为20化g/mL的对照品母液，再移取适量对照品母液稀释成化g/mL、化g/mL、扣g/mL、 1 Oyg/mL、25yg/mL、50yg/mL、lOOyg/mL对照品溶液，将对照品溶液和对照品母液注入液相色 谱仪，进样量20化，W对照品 浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，求得各对照品线性回归方程， 结果如下：
[0033] PA：Y=18732X+19461 r = 0.9999
[0034] DPA：Y = 7037.7X+33795 r = 0.9999
[0035] TA：Y=18901X+3257 r = 0.9999
[0036] DTA：Y = 7023.9X-1823.3 r = 0.9999
[0037] PAC：Y=15067X+3523.5 r = 0.9999
[0038] EDA：Y=19992X+3200.3 r = 0.9999
[0039] 高效液相色谱的检测条件为：仪器为Waters册LC 1525series，色谱柱为￥1(：-Pack Pro C18(4.6*250mm，5皿），柱溫为35°C，流速为 1.7mL/min，PDA设定波长为210nm& 243nm，流动相A为乙腊，流动相B为体积分数0.1%憐酸水溶液，梯度洗脱条件为:0~33min， 流动相A相的体积分数保持为51%，A相的体积分数保持为49% ;33~45min，流动相A相的体 积分数由51 %升为54%，流动相B相的体积分数由49 %降至46 % ; 45~5Imin，流动相A相的 体积分数由54%继续升为100%，流动相B相的体积分数由46%降至0% ;51~55min，流动相 A相的体积分数保持100%，流动相B相的体积分数保持0% ; 55~55.5min，流动相A相的体积 分数由100%降至51 %，流动相B相的体积分数由0%升至54% ; 55.5~60min，流动相A相的 体积分数保持51 %，流动相B相的体积分数保持54%。
[0040] 实施例2:
[0041] 将普通商购巧等药材粉碎后过60目筛，准确称取约Ig药粉，置于lOOmLS角瓶中， 使用甲醇超声提取，提取2次，每次加入甲醇的量为30mL，每次超声30min，冷却后过滤，滤液 合并，蒸干，用乙酸乙醋萃取3次，每次20mL，合并有机层，减压蒸干，所得固体再用甲醇稀释 至5mL，摇匀，过0.22皿滤膜后，按实施例1所示色谱条件，进行HPLC分析。该巧等药材中的 DPA为0.047wt% (保留时间为52.57min)，DTA为0.015wt% (保留时间为29.07min)，PA为 O.OOSwt% (保留时间为52. 17min)，TA为0.012wt% (保留时间为25.47min)，PAC为 0.013wt% (保留时间为41.98min)，EDA为O.OOSwt% (保留时间为47.70min)。
[0042] 实施例3:
[0043] 准确称取含有巧等Ξ祗成分的蛋白粉(纳補瑞多植优高蛋白配方，杏辉药品工业 股份有限公司）lg，置于lOOmLS角瓶中，使用甲醇超声提取，提取2次，每次加入甲醇的量为 30血，每次超声30min，冷却后过滤，滤液合并，蒸干，用乙酸乙醋萃取3次，每次20mL，合并有 机层，减压蒸干，所得固体再用甲醇稀释至5mL，摇匀，过0.22μπι滤膜后，按实施例1所示色谱 条件，进行HPLC分析。该巧等药材中的DPA为O.OOlwt% (保留时间为52.57min)，DTA为 0.002wt% (保留时间为29.07min)，PA为0.004wt% (保留时间为52.17min)，TA为0.004wt% (保留时间为25.47min)，PAC为0.002wt% (保留时间为41.98min)，EDA为0.005wt%(保留时 间为47.70min)。
[0044] 实施例4:
[0045] 将含有巧等Ξ祗成分的胶囊(美乐家宝巧等胶囊，杏辉天力(杭州)药业有限公司） 剥除胶囊壳，准确称取约Ig药粉，置于lOOmLS角瓶中，使用甲醇超声提取，提取2次，每次加 入甲醇的量为30mL，每次超声30min，冷却后过滤，滤液合并，蒸干，用乙酸乙醋萃取3次，每 次20mL，合并有机层，减压蒸干，所得固体再用甲醇稀释至5mL，摇匀，过0.22μπι滤膜后，按实 施例1所示色谱条件，进行Η Ρ L C分析。该巧等药材中的D Ρ A为0.0 2 3 W t % (保留时间为 52.57min)，DTA为0.163wt% (保留时间为29.07min)，PA为0.031wt% (保留时间为 52. 17min)，TA为O.OSlwt% (保留时间为25.47min)，PAC为0.051wt% (保留时间为 41.98min)，EDA为0.044wt% (保留时间为47.70min)。
[0046] 实施例5:
[0047] 选用普通商购巧等药材进行精密度试验，按本发明方法处理后，按实施例1所示色 谱条件，进行HPLC分析，进样6次，测定精密度，结果见表1。
[0048] 表1精密度试验结果
[0049]
[0050]
[0051] 从测定结果可W看出，巧等Ξ祗中的6种祗类化合物的分析值得RSD%均小于2,说 明精密度良好，方法可行。
[0052] 实施例6:
[0053] 取一种未添加巧等Ξ祗的颗粒冲剂（氯化钟颗粒，杏辉天力（杭州）药业有限公 司），分别向其中添加巧等Ξ祗原料，制成巧等Ξ祗中DPA、DTA、PA、TA、PAC W及EDA的含量均 为20mg/100g的颗粒产品，按本发明方法处理样品，结果如表2。
[0054] 表2回收率试验结果
[0055]
[0056] 由表2可知，本申请对于测定运六种巧等Ξ祗类化合物的回收率均在90% W上，说 明此方法准确度高;方法的RSD%均小于2,体现了方法良好的重现性和精密度。
【主权项】
1. 一种茯苓三萜类化合物的检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤： (1) 超声提取； (2) 利用有机溶剂对步骤(1)的产物进行萃取，并用醇溶解； (3) 对步骤(2)醇溶液进行高效液相色谱检测。2. 根据权利要求1的检测方法，其特征在于所述方法的步骤（1)包括下述步骤:称取待 测样品，粉碎后配制成样品醇溶液，密塞超声提取，过滤，再将滤液蒸干;其中，所述粉碎后 过的筛网为60目以上;所述超声提取次数为2~3次，每次20~40min;所述每次使用醇提取 的量为样品质量的25~35倍。3. 根据权利要求1的检测方法，其特征在于所述方法的步骤(2)包括下述步骤：用有机 溶剂对步骤（1)得到的蒸干物质进行萃取数次，合并有机层，蒸干后，再使用醇溶解;其中， 所述使用有机溶剂萃取次数为3次以上，每次有机溶剂的用量为样品质量的15~25倍;所述 蒸干后溶解所需醇的量为4~6mL。4. 根据权利要求1的检测方法，其特征在于所述方法的步骤(3)包括下述步骤:取步骤 (2)醇溶液进行高效液相色谱检测；其中，高效液相色谱的检测条件为:采用C18液相色谱 柱，流动相由A相和B相组成，进行梯度洗脱，使用PDA二极管阵列检测器进行检测，其中所述 A相为色谱乙腈，B相为含有体积分数0.05 %~0.5 %的磷酸水溶液，检测波长为210nm和 243nm，柱温为20~40°C，流速为1.7mL/min，所述梯度洗脱的条件为:0~33min，流动相A相 的体积分数保持为51 %，B相的体积分数保持为49% ; 33~45min，流动相A相的体积分数由 51 %升为54%，流动相B相的体积分数由49%降至46% ;45~51min，流动相A相的体积分数 由54%继续升为100%，流动相B相的体积分数由46%降至0% ; 51~55min，流动相A相的体 积分数保持100 %，流动相B相的体积分数保持0 % ; 55~55.5min，流动相A相的体积分数由 100%降至51 %，流动相B相的体积分数由0%升至54% ; 55.5~60min，流动相A相的体积分 数保持51 %，流动相B相的体积分数保持54%。5. 根据权利要求1的检测方法，其特征在于所述方法包括下述步骤： (1) 称取待测样品，粉碎后配制成样品醇溶液，密塞超声提取，过滤，再将滤液蒸干;其 中，所述粉碎后过的筛网为60目以上;所述超声提取次数为2~3次，每次20~40min;所述每 次使用醇提取的量为样品质量的25~35倍； (2) 用有机溶剂对步骤（1)得到的蒸干物质进行萃取数次，合并有机层，蒸干后，再使用 醇溶解;其中，所述使用有机溶剂萃取次数为3次以上，每次有机溶剂的用量为样品质量的 15~25倍;所述蒸干后溶解所需醇的量为4~6mL。 (3) 取步骤(2)醇溶液进行高效液相色谱检测;其中，高效液相色谱的检测条件为:采用 C18液相色谱柱，流动相由A相和B相组成，进行梯度洗脱，使用PDA二极管阵列检测器进行检 测，其中所述A相为色谱乙腈，B相为含有体积分数0.05%~0.5%的磷酸水溶液，检测波长 为210nm和243nm，柱温为20~40°C，流速为1.7mL/min，所述梯度洗脱的条件为：0~33min， 流动相A相的体积分数保持为51%，B相的体积分数保持为49% ;33~45min，流动相A相的体 积分数由51 %升为54%，流动相B相的体积分数由49 %降至46 % ; 45~5lmin，流动相A相的 体积分数由54 %继续升为100 %，流动相B相的体积分数由46 %降至0 %;51~55miη，流动相 Α相的体积分数保持100%，流动相Β相的体积分数保持0%;55~55.5min，流动相Α相的体积 分数由100%降至51 %，流动相B相的体积分数由0%升至54% ; 55.5~60min，流动相A相的 体积分数保持51 %，流动相B相的体积分数保持54%。6. 根据权利要求1-5任一所述的检测方法，其特征在于所述茯苓三萜类化合物为茯苓 酸、去氢茯苓酸、土莫酸、去氢土莫酸、猪苓酸C以及3-表-去氢土莫酸。7. 根据权利要求1-5任一所述的检测方法，其特征在于所述样品是食品、药品、药材、药 材提取物或者它们的混合物。8. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于所述醇选自甲醇、乙醇、异丙醇或正丁 醇中的一种或几种。9. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于所述有机溶剂选自乙酸乙酯、乙酸丁 酯、氯仿或二氯甲烷中的一种或几种。
【专利摘要】本发明涉及一种茯苓三萜类化合物的检测方法，该方法包括以下步骤：(1)超声提取；(2)用有机溶剂对步骤(1)得到的蒸干物质进行萃取数次，合并有机层，蒸干后，再用醇溶解，使用0.22μm有机膜滤过，取续滤液注入高效液相色谱仪进行检测。本发明所述方法具有较高的灵敏度、精密度和准确性。
【IPC分类】G01N30/08, G01N30/74
【公开号】CN105486786
【申请号】CN201610059814
【发明人】王昭日, 杨胜杰, 刘明川, 张小琴, 刘敏, 凌赟, 林汉钦
【申请人】杏辉天力（杭州）药业有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年1月28日
【技术领域】
[0001] 本发明设及药物化合物检测领域。具体设及一种药物的检测方法，尤其设及一种 食品或药品中巧等Ξ祗类化合物的检测方法。
【背景技术】
[0002] 巧等为多孔菌科真菌化ria cocos(Schw. )Wolf的干燥菌核，性平，味甘、淡，归屯、、 肺、脾、肾经，是一味常用的利水渗湿、健脾和胃、宁屯、安神的中药。常用于水肿尿少、疲饮眩 惇、脾虚食少、便漉泄泻、屯、神不安、惊惇失眠等病症的治疗。现代药理学研究表明，巧等具 有抑制肿瘤、抗炎、抗衰老、调节免疫功能、保肝等多方面的药理作用，在临床上应用广泛， 且效果显著。自70年代W来，中外学者从巧等中分离出了多种Ξ祗化合物，并对其药理作 用、生物活性等方面进行了研究。运些药理研究表明，巧等中所含的Ξ祗类化合物具有明显 的抗肿瘤、抗炎和免疫调节作用，是巧等的重要有效成分
[0003] 此外，CN105085598A公开了，巧等Ξ祗中的巧等酸(pachymic acid)及去氨巧等酸 (dehydropachymic acid)、上莫酉《（tumulosic acid)、去氨上莫酉《（dehydrotumulosic acid)、猪等酸C(polyporenic acid C)、W及3-表-去氨±莫酸（3-邱i-dehy化otumulosic acid)为巧等Ξ祗中的主要成分，也是主要活性物质，具有利尿、抗氧化、抗癌症、抗发炎、抗 高血糖、调节免疫等功效;CN103665679A公开了 一种巧等酸单体的分离纯化方法，其虽然W 巧等为原料，并通过提取、萃取、结晶得到巧等酸单体，但其仅仅得到一种巧等Ξ祗化合物， 对其它巧等Ξ祗化合物如何检测或分离，并未提及。随着巧等Ξ祗的功效被人们广泛认可， 越来越多的食品或药品中添加了巧等Ξ祗类物质，探索建立有效检测食品或药品中巧等Ξ 祗类化合物含量的新方法对于食品或者药品原料的监测具有更加重要的意义。
[0004] 巧等S祗中的巧等酸（pachymic acid)及去氨巧等酸（dehy化opachymic acid)、 上莫酉《（tumulosic acid)、去氨上莫酉《（dehydrotumulosic acid)、猪等酉《C(polyporenic acid C)、W及3-表-去氨±莫酸(3-epi-dehy化otumulosic acid)如下所示：
[0005]
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对目前无法全面、有效、准确地对食品或药品中巧等Ξ祗类主 要活性物质含量检测方法的不足，提供了一种检测方法，该方法简单，易于操作，能够全面、 有效、准确地对食品或者药品中巧等Ξ祗类主要活性物质的含量进行检测，从而为巧等Ξ 祗类化合物在食品中或者药品中的规模化使用提供了技术支持。
[0007] 本发明的目的在于提供了一种巧等Ξ祗类化合物的检测方法。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案：
[0009] -种食品或药品中巧等Ξ祗类化合物的检测方法，该方法包括W下步骤：
[0010] (1)超声提取；
[0011] (2)利用有机溶剂对步骤(1)的产物进行萃取，并用醇溶解；
[0012] (3)对步骤(2)醇溶液进行高效液相色谱检测。
[0013] 优选地，步骤(1)包括下述步骤:称取待测样品，粉碎后配制成样品醇溶液，密塞超 声提取，过滤，再将滤液蒸干;其中，所述粉碎后过的筛网为60目W上;所述超声提取次数为 2~3次，每次20~40min;所述每次使用醇提取的量为样品质量的25~35倍。
[0014] 优选地，步骤(2)包括下述步骤：用有机溶剂对步骤（1)得到的蒸干物质进行萃取 数次，合并有机层，蒸干后，再使用醇溶解;其中，所述使用有机溶剂萃取次数为3次W上，每 次有机溶剂的用量为样品质量的15~25倍;所述蒸干后溶解所需醇的量为4~6mL。
[0015] 优选地，步骤(3)包括下述步骤:取步骤(2)醇溶液进行高效液相色谱检测；其中， 高效液相色谱的检测条件为:采用C18液相色谱柱，流动相由A相和B相组成，进行梯度洗脱， 使用PDA二极管阵列检测器进行检测，其中所述A相为色谱乙腊，B相为含有体积分数0.05 % ~0.5 %的憐酸水溶液，检测波长为210nm和24化m，柱溫为20~40°C，流速为1.7mL/min，所 述梯度洗脱的条件为:〇~33min，流动相A相的体积分数保持为51%，B相的体积分数保持为 49% ; 33~45min，流动相A相的体积分数由51 %升为54%，流动相B相的体积分数由49%降 至46% ;45~51min，流动相A相的体积分数由54%继续升为100%，流动相B相的体积分数由 4 6 %降至0 % ; 51~5 5 m i η，流动相A相的体积分数保持10 0 %，流动相B相的体积分数保持 0% ; 55~55.5min，流动相A相的体积分数由100%降至51 %，流动相B相的体积分数由0%升 至54% ;55.5~60min，流动相A相的体积分数保持51%，流动相財目的体积分数保持54%。
[0016] 更优选地，所述检测方法包括下述步骤：
[0017] (1)称取待测样品，粉碎后配制成样品醇溶液，密塞超声提取，过滤，再将滤液蒸 干;其中，所述粉碎后过的筛网为60目W上;所述超声提取次数为2~3次，每次20~40min; 所述每次使用醇提取的量为样品质量的25~35倍；
[0018] (2)用有机溶剂对步骤(1)得到的蒸干物质进行萃取数次，合并有机层，蒸干后，再 使用醇溶解;其中，所述使用有机溶剂萃取次数为3次W上，每次有机溶剂的用量为样品质 量的15~25倍;所述蒸干后溶解所需醇的量为4~6n止；
[0019] (3)取步骤(2)醇溶液进行高效液相色谱检测;其中，高效液相色谱的检测条件为： 采用C18液相色谱柱，流动相由A相和財目组成，进行梯度洗脱，使用PDA二极管阵列检测器进 行检测，其中所述A相为色谱乙腊，B相为含有体积分数0.05%~0.5%的憐酸水溶液，检测 波长为210nm和24化m，柱溫为20~40°C，流速为1.7mL/min，所述梯度洗脱的条件为：0~ 33min，流动相A相的体积分数保持为51 %，B相的体积分数保持为49% ; 33~45min，流动相A 相的体积分数由51 %升为54%，流动相B相的体积分数由49%降至46% ;45~51min，流动相 A相的体积分数由54%继续升为100%，流动相B相的体积分数由46%降至0% ; 51~55min， 流动相A相的体积分数保持100%，流动相B相的体积分数保持0% ; 55~55.5min，流动相A相 的体积分数由100%降至51 %，流动相B相的体积分数由0%升至54% ; 55.5~60min，流动相 A相的体积分数保持51 %，流动相B相的体积分数保持54%。
[0020] 所述的巧等Ξ祗类化合物主要是起主要药理作用的巧等Ξ祗类物质，分别为：巧 等酸（pachymic acid，PA)及去氨巧等酸（dehy化opachymic acid，DPA)、±莫酸（tumulosic 曰。1(1，了4)、去氨±莫酸（(16117(11'〇1:加1111〇3；[0日。1(1，0了4)、猪等酸"901790'6]1；[03。1(1〔， PAC)、W及3-表-去氨±莫酸（3-epi-dehy化otumulosic acid，EDA)。
[0021 ] 所述的巧等Ξ祗类化合物的保留时间为：PA为52.17min、DPA为52.57min、TA为 25.47min、DTA为29.07min、PAC为41.98min、EDA为47.70min。
[0022] 所述的样品，其可W是食品、药品、药材、药材提取物或者它们的混合物。
[0023] 所述的醇，其可W是甲醇、乙醇、异丙醇或正下醇中的一种或几种。
[0024] 所述的有机溶剂，其可W是乙酸乙醋、乙酸下醋、氯仿或二氯甲烧中的一种或几 种。
[0025] 本发明通过两步预处理有效地去除了食品或者药品中的干扰物质，通过常规的高 效液相色谱法就可W完成食品或药品中的巧等Ξ祗类化合物各物质的含量检测，为了使本 领域技术人员更好地实施本发明，在此提供一种优选的高效液相色谱检测方法，本液相检 测方法使被检测的巧等Ξ祗均能与其他杂质分离开来，分离度均大于1.5,并且各Ξ祗的色 谱峰具有较好的对称性，对称因子均保证在0.8~1.2，具体色谱条件如下：
[0026] 高效液相色谱的检测条件为:采用C18液相色谱柱，流动相由A相和B相组成，进行 梯度洗脱，使用PDA二极管阵列检测器进行检测，其中所述A相为色谱乙腊，B相为含有体积 分数0.05 %~0.5 %的憐酸水溶液，检测波长为2 lOnm和24化m，柱溫为20~40°C，流速为 1.7mL/min，
[0027] 优选的梯度洗脱条件为:0~33min，流动相A相的体积分数保持为51%，A相的体积 分数保持为49% ;33~45min，流动相A相的体积分数由51 %升为54%，流动相B相的体积分 数由49 %降至46 % ; 45~5 Imin，流动相A相的体积分数由54 %继续升为100 %，流动相B相的 体积分数由46 %降至0 % ; 51~55min，流动相A相的体积分数保持100 %，流动相B相的体积 分数保持0 % ; 55~55.5min，流动相A相的体积分数由100 %降至51 %，流动相B相的体积分 数由0%升至54%;55.5~60min，流动相A相的体积分数保持51 %，流动相財目的体积分数保 持 54 %。
【附图说明】
[002引图1:波长210nm下化合物DTA与DPA的色谱图；
[0029] 图2:波长243nm下化合物PA、TA、PAC W及邸A的色谱图。 实施例
[0030] 下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述方法 仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方 法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。如无特别说明，实施例中用到的所有原料和 溶齐。均贝勾自 Si邑m曰 Biochemical and Organic Compounds for Research 曰nd Diagnostic Clinical Reagents公司。
[0031 ] 实施例1:
[0032] 分别准确称取2mg PA、DPA、ΤΑ、DTA、PAC及抓A对照品，用甲醇溶解并定容于1 OmL， 即浓度为20化g/mL的对照品母液，再移取适量对照品母液稀释成化g/mL、化g/mL、扣g/mL、 1 Oyg/mL、25yg/mL、50yg/mL、lOOyg/mL对照品溶液，将对照品溶液和对照品母液注入液相色 谱仪，进样量20化，W对照品 浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，求得各对照品线性回归方程， 结果如下：
[0033] PA：Y=18732X+19461 r = 0.9999
[0034] DPA：Y = 7037.7X+33795 r = 0.9999
[0035] TA：Y=18901X+3257 r = 0.9999
[0036] DTA：Y = 7023.9X-1823.3 r = 0.9999
[0037] PAC：Y=15067X+3523.5 r = 0.9999
[0038] EDA：Y=19992X+3200.3 r = 0.9999
[0039] 高效液相色谱的检测条件为：仪器为Waters册LC 1525series，色谱柱为￥1(：-Pack Pro C18(4.6*250mm，5皿），柱溫为35°C，流速为 1.7mL/min，PDA设定波长为210nm& 243nm，流动相A为乙腊，流动相B为体积分数0.1%憐酸水溶液，梯度洗脱条件为:0~33min， 流动相A相的体积分数保持为51%，A相的体积分数保持为49% ;33~45min，流动相A相的体 积分数由51 %升为54%，流动相B相的体积分数由49 %降至46 % ; 45~5Imin，流动相A相的 体积分数由54%继续升为100%，流动相B相的体积分数由46%降至0% ;51~55min，流动相 A相的体积分数保持100%，流动相B相的体积分数保持0% ; 55~55.5min，流动相A相的体积 分数由100%降至51 %，流动相B相的体积分数由0%升至54% ; 55.5~60min，流动相A相的 体积分数保持51 %，流动相B相的体积分数保持54%。
[0040] 实施例2:
[0041] 将普通商购巧等药材粉碎后过60目筛，准确称取约Ig药粉，置于lOOmLS角瓶中， 使用甲醇超声提取，提取2次，每次加入甲醇的量为30mL，每次超声30min，冷却后过滤，滤液 合并，蒸干，用乙酸乙醋萃取3次，每次20mL，合并有机层，减压蒸干，所得固体再用甲醇稀释 至5mL，摇匀，过0.22皿滤膜后，按实施例1所示色谱条件，进行HPLC分析。该巧等药材中的 DPA为0.047wt% (保留时间为52.57min)，DTA为0.015wt% (保留时间为29.07min)，PA为 O.OOSwt% (保留时间为52. 17min)，TA为0.012wt% (保留时间为25.47min)，PAC为 0.013wt% (保留时间为41.98min)，EDA为O.OOSwt% (保留时间为47.70min)。
[0042] 实施例3:
[0043] 准确称取含有巧等Ξ祗成分的蛋白粉(纳補瑞多植优高蛋白配方，杏辉药品工业 股份有限公司）lg，置于lOOmLS角瓶中，使用甲醇超声提取，提取2次，每次加入甲醇的量为 30血，每次超声30min，冷却后过滤，滤液合并，蒸干，用乙酸乙醋萃取3次，每次20mL，合并有 机层，减压蒸干，所得固体再用甲醇稀释至5mL，摇匀，过0.22μπι滤膜后，按实施例1所示色谱 条件，进行HPLC分析。该巧等药材中的DPA为O.OOlwt% (保留时间为52.57min)，DTA为 0.002wt% (保留时间为29.07min)，PA为0.004wt% (保留时间为52.17min)，TA为0.004wt% (保留时间为25.47min)，PAC为0.002wt% (保留时间为41.98min)，EDA为0.005wt%(保留时 间为47.70min)。
[0044] 实施例4:
[0045] 将含有巧等Ξ祗成分的胶囊(美乐家宝巧等胶囊，杏辉天力(杭州)药业有限公司） 剥除胶囊壳，准确称取约Ig药粉，置于lOOmLS角瓶中，使用甲醇超声提取，提取2次，每次加 入甲醇的量为30mL，每次超声30min，冷却后过滤，滤液合并，蒸干，用乙酸乙醋萃取3次，每 次20mL，合并有机层，减压蒸干，所得固体再用甲醇稀释至5mL，摇匀，过0.22μπι滤膜后，按实 施例1所示色谱条件，进行Η Ρ L C分析。该巧等药材中的D Ρ A为0.0 2 3 W t % (保留时间为 52.57min)，DTA为0.163wt% (保留时间为29.07min)，PA为0.031wt% (保留时间为 52. 17min)，TA为O.OSlwt% (保留时间为25.47min)，PAC为0.051wt% (保留时间为 41.98min)，EDA为0.044wt% (保留时间为47.70min)。
[0046] 实施例5:
[0047] 选用普通商购巧等药材进行精密度试验，按本发明方法处理后，按实施例1所示色 谱条件，进行HPLC分析，进样6次，测定精密度，结果见表1。
[0048] 表1精密度试验结果
[0049]
[0050]
[0051] 从测定结果可W看出，巧等Ξ祗中的6种祗类化合物的分析值得RSD%均小于2,说 明精密度良好，方法可行。
[0052] 实施例6:
[0053] 取一种未添加巧等Ξ祗的颗粒冲剂（氯化钟颗粒，杏辉天力（杭州）药业有限公 司），分别向其中添加巧等Ξ祗原料，制成巧等Ξ祗中DPA、DTA、PA、TA、PAC W及EDA的含量均 为20mg/100g的颗粒产品，按本发明方法处理样品，结果如表2。
[0054] 表2回收率试验结果
[0055]
[0056] 由表2可知，本申请对于测定运六种巧等Ξ祗类化合物的回收率均在90% W上，说 明此方法准确度高;方法的RSD%均小于2,体现了方法良好的重现性和精密度。
【主权项】
1. 一种茯苓三萜类化合物的检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤： (1) 超声提取； (2) 利用有机溶剂对步骤(1)的产物进行萃取，并用醇溶解； (3) 对步骤(2)醇溶液进行高效液相色谱检测。2. 根据权利要求1的检测方法，其特征在于所述方法的步骤（1)包括下述步骤:称取待 测样品，粉碎后配制成样品醇溶液，密塞超声提取，过滤，再将滤液蒸干;其中，所述粉碎后 过的筛网为60目以上;所述超声提取次数为2~3次，每次20~40min;所述每次使用醇提取 的量为样品质量的25~35倍。3. 根据权利要求1的检测方法，其特征在于所述方法的步骤(2)包括下述步骤：用有机 溶剂对步骤（1)得到的蒸干物质进行萃取数次，合并有机层，蒸干后，再使用醇溶解;其中， 所述使用有机溶剂萃取次数为3次以上，每次有机溶剂的用量为样品质量的15~25倍;所述 蒸干后溶解所需醇的量为4~6mL。4. 根据权利要求1的检测方法，其特征在于所述方法的步骤(3)包括下述步骤:取步骤 (2)醇溶液进行高效液相色谱检测；其中，高效液相色谱的检测条件为:采用C18液相色谱 柱，流动相由A相和B相组成，进行梯度洗脱，使用PDA二极管阵列检测器进行检测，其中所述 A相为色谱乙腈，B相为含有体积分数0.05 %~0.5 %的磷酸水溶液，检测波长为210nm和 243nm，柱温为20~40°C，流速为1.7mL/min，所述梯度洗脱的条件为:0~33min，流动相A相 的体积分数保持为51 %，B相的体积分数保持为49% ; 33~45min，流动相A相的体积分数由 51 %升为54%，流动相B相的体积分数由49%降至46% ;45~51min，流动相A相的体积分数 由54%继续升为100%，流动相B相的体积分数由46%降至0% ; 51~55min，流动相A相的体 积分数保持100 %，流动相B相的体积分数保持0 % ; 55~55.5min，流动相A相的体积分数由 100%降至51 %，流动相B相的体积分数由0%升至54% ; 55.5~60min，流动相A相的体积分 数保持51 %，流动相B相的体积分数保持54%。5. 根据权利要求1的检测方法，其特征在于所述方法包括下述步骤： (1) 称取待测样品，粉碎后配制成样品醇溶液，密塞超声提取，过滤，再将滤液蒸干;其 中，所述粉碎后过的筛网为60目以上;所述超声提取次数为2~3次，每次20~40min;所述每 次使用醇提取的量为样品质量的25~35倍； (2) 用有机溶剂对步骤（1)得到的蒸干物质进行萃取数次，合并有机层，蒸干后，再使用 醇溶解;其中，所述使用有机溶剂萃取次数为3次以上，每次有机溶剂的用量为样品质量的 15~25倍;所述蒸干后溶解所需醇的量为4~6mL。 (3) 取步骤(2)醇溶液进行高效液相色谱检测;其中，高效液相色谱的检测条件为:采用 C18液相色谱柱，流动相由A相和B相组成，进行梯度洗脱，使用PDA二极管阵列检测器进行检 测，其中所述A相为色谱乙腈，B相为含有体积分数0.05%~0.5%的磷酸水溶液，检测波长 为210nm和243nm，柱温为20~40°C，流速为1.7mL/min，所述梯度洗脱的条件为：0~33min， 流动相A相的体积分数保持为51%，B相的体积分数保持为49% ;33~45min，流动相A相的体 积分数由51 %升为54%，流动相B相的体积分数由49 %降至46 % ; 45~5lmin，流动相A相的 体积分数由54 %继续升为100 %，流动相B相的体积分数由46 %降至0 %;51~55miη，流动相 Α相的体积分数保持100%，流动相Β相的体积分数保持0%;55~55.5min，流动相Α相的体积 分数由100%降至51 %，流动相B相的体积分数由0%升至54% ; 55.5~60min，流动相A相的 体积分数保持51 %，流动相B相的体积分数保持54%。6. 根据权利要求1-5任一所述的检测方法，其特征在于所述茯苓三萜类化合物为茯苓 酸、去氢茯苓酸、土莫酸、去氢土莫酸、猪苓酸C以及3-表-去氢土莫酸。7. 根据权利要求1-5任一所述的检测方法，其特征在于所述样品是食品、药品、药材、药 材提取物或者它们的混合物。8. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于所述醇选自甲醇、乙醇、异丙醇或正丁 醇中的一种或几种。9. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于所述有机溶剂选自乙酸乙酯、乙酸丁 酯、氯仿或二氯甲烷中的一种或几种。
【专利摘要】本发明涉及一种茯苓三萜类化合物的检测方法，该方法包括以下步骤：(1)超声提取；(2)用有机溶剂对步骤(1)得到的蒸干物质进行萃取数次，合并有机层，蒸干后，再用醇溶解，使用0.22μm有机膜滤过，取续滤液注入高效液相色谱仪进行检测。本发明所述方法具有较高的灵敏度、精密度和准确性。
【IPC分类】G01N30/08, G01N30/74
【公开号】CN105486786
【申请号】CN201610059814
【发明人】王昭日, 杨胜杰, 刘明川, 张小琴, 刘敏, 凌赟, 林汉钦
【申请人】杏辉天力（杭州）药业有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年1月28日
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