一种银杏二萜内酯葡胺注射液及其制备原料中大分子化合物的检测方法
一种银杏二萜内酯葡胺注射液及其制备原料中大分子化合物的检测方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于医药技术领域，具体设及一种银杏二祗内醋葡胺注射液及原料中大分 子化合物的检测方法。
【背景技术】
[0002] 银杏二祗内醋葡胺注射液是W银杏叶为原料，经提取纯化后得到其有效部位银杏 二祗内醋(银杏内醋A、B、K等），并W银杏二祗内醋和葡甲胺为制备原料制成注射液。该药具 有活血通络之功效，临床用于脑梗死（中风病中经络疲疲阻络证)的治疗，症见半身不遂、口 舌歪斜、言语馨涩、肢体麻木等。
[0003] 银杏二祗内醋葡胺注射液W及制备原料多为提纯物，成分较为复杂，一些大分子 化合物W胶体的形式存在于药液中，当通过静脉注射或肌肉注射与其他药物配伍时，由于 pH值变化及其他因素，极易聚合成更大的分子或多分子团粒，进入人体后，很容易导致不良 反应的发生。因此，为了保证临床用药的安全，更好的控制药品的质量，需要对银杏二祗内 醋葡胺注射液及原料中大分子化合物制定合理的检测方法。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种银杏二祗内醋葡胺注射液及原 料中大分子化合物的检测方法，本发明提供的检测方法操作简便，灵敏度高、重复性好，可 用于银杏二祗内醋葡胺注射液及原料中大分子化合物的检测。
[0005] 本发明提供了一种银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子化合物的检测方法，包括W 下步骤：
[0006] A)W银杏二祗内醋葡胺注射液作为待测溶液，W分子量为4600的右旋糖酢溶液作 为对照品溶液;将待测溶液W及对照品溶液分别进行体积排阻色谱检测，得到待测溶液色 谱图W及对照品溶液色谱图；所述体积排阻色谱的流动相为硫酸钢溶液或憐酸盐溶液，流 速为 0.5 ~0.8ml/min;
[0007] B)将待测溶液色谱图W及对照品溶液色谱图进行比对，采用面积归一化法得到所 述大分子化合物的含量。
[000引本发明还提供了一种银杏二祗内醋葡胺注射液制备原料中大分子化合物的检测 方法，包括W下步骤：
[0009] A)W银杏二祗内醋葡胺注射液制备原料溶液作为待测溶液，所述制备原料溶液为 银杏二祗内醋W及葡甲胺的混合溶液；W分子量为4600的右旋糖酢溶液作为对照品溶液； 将待测溶液W及对照品溶液分别进行体积排阻色谱检测，得到待测溶液色谱图W及对照品 溶液色谱图；所述体积排阻色谱的流动相为硫酸钢溶液或憐酸盐溶液，流速为0.5~0.8ml/ min；
[0010] B)将待测溶液色谱图W及对照品溶液色谱图进行比对，采用面积归一化法得到所 述大分子化合物的含量。
[0011] 优选的，所述流动相为硫酸钢溶液，所述硫酸钢溶液的浓度为0.01~0.1mol/L。
[0012] 优选的，所述对照品还包括分子量分别为2500、7100、10000、21400 W及84400的右 旋糖酢中的一种或多种。
[0013] 优选的，所述银杏二祗内醋W及葡甲胺的混合溶液中银杏二祗内醋的浓度为2~ 20mg/ml，葡甲胺的浓度为2~20mg/ml。
[0014] 优选的，所述对照品溶液的浓度为0.5~5mg/ml。
[0015] 优选的，所述分子量分别为2500、7100、10000、21400^及84400的右旋糖酢的溶液 浓度均为0.5~5mg/ml。
[0016] 优选的，所述体积排阻色谱的检测器为示差检测器。
[0017] 优选的，所述体积排阻色谱的色谱柱为化enomenex Biosep-SEC-S2000色谱柱。
[0018] 优选的，所述体积排阻色谱检测的柱溫为25~35°C。
[0019] 与现有技术相比，本发明提供了一种银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子化合物的 检测方法，包括W下步骤:A)W银杏二祗内醋葡胺注射液作为待测溶液，W分子量为4600的 右旋糖酢溶液作为对照品溶液;将待测溶液W及对照品溶液分别进行体积排阻色谱检测， 得到待测溶液色谱图W及对照品溶液色谱图；所述体积排阻色谱的流动相为硫酸钢溶液或 憐酸盐溶液，流速为0.5~0.8ml/min;B)将待测溶液色谱图W及对照品溶液色谱图进行比 对，采用面积归一化法得到所述大分子化合物的含量。
[0020] 同时，本发明还提供了一种银杏二祗内醋葡胺注射液制备原料中大分子化合物的 检测方法，包括W下步骤:A)W银杏二祗内醋葡胺注射液制备原料溶液作为待测溶液，所述 制备原料溶液为银杏二祗内醋W及葡甲胺的混合溶液；W分子量为4600的右旋糖酢溶液作 为对照品溶液;将待测溶液W及对照品溶液分别进行体积排阻色谱检测，得到待测溶液色 谱图W及对照品溶液色谱图；所述体积排阻色谱的流动相为硫酸钢溶液或憐酸盐溶液，流 速为0.5~0.8ml/min;B)将待测溶液色谱图W及对照品溶液色谱图进行比对，采用面积归 一化法得到所述大分子化合物的含量。
[0021] 本发明采用体积排阻色谱法对银杏二祗内醋葡胺注射液及其制备原料中大分子 化合物进行检测，检测方法操作简便，灵敏度高、重复性好，各个峰之间有较好的分离度，有 利于计算色谱峰的峰面积。本发明提供的检测方法实现了对银杏二祗内醋葡胺注射液及其 制备原料中大分子化合物的检测。
[0022] 结果表明，本发明提供的银杏二祗内醋葡胺注射液及其制备原料中大分子化合物 的检测方法具有良好的重复性、稳定性和精密度。
【附图说明】
[0023] 图1为银杏二祗内醋葡胺注射液的制备原料在憐酸盐为流动相的条件下的色谱 图；
[0024] 图2为银杏二祗内醋葡胺注射液在憐酸盐为流动相的条件下的色谱图；
[0025] 图3为银杏二祗内醋葡胺注射液的制备原料在硫酸钢为流动相的条件下的色谱 图；
[0026] 图4为银杏二祗内醋葡胺注射液在硫酸钢为流动相的条件下的色谱图；
[0027] 图5为六种右旋糖酢对照品的色谱图；
[0028] 图6为六种右旋糖酢对照品的分子量对数-保留时间曲线；
[0029] 图7为右旋糖酢分子量D2检测线考察色谱图；
[0030] 图8为批号为130301银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色谱 图；
[0031] 图9为批号为130901银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色谱 图；
[0032] 图10为批号为130903银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0033] 图11为批号为140603银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0034] 图12为批号为140604银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0035] 图13为批号为140605银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0036] 图14为批号为140606银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0037] 图15为批号为140607银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0038] 图16为批号为140608银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0039] 图17为批号为140609银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0040] 图18为批号为110101银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0041] 图19为批号为110102银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0042] 图20为批号为110103银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0043] 图21为批号为110601银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0044] 图22为批号为110801银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0045] 图23为批号为110302银杏二祗内醋中大分子物质和聚合物检测的色谱图；
[0046] 图24为批号为110401银杏二祗内醋中大分子物质和聚合物检测的色谱图；
[0047] 图25为批号为121101银杏二祗内醋中大分子物质和聚合物检测的色谱图；
[0048] 图26为批号为121102银杏二祗内醋中大分子物质和聚合物检测的色谱图；
[0049] 图27为批号为121104银杏二祗内醋中大分子物质和聚合物检测的色谱图。
【具体实施方式】
[0050] 本发明提供了一种银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子化合物的检测方法，包括W 下步骤：
[0051] A)W银杏二祗内醋葡胺注射液作为待测溶液，W分子量为4600的右旋糖酢溶液作 为对照品溶液;将待测溶液W及 对照品溶液分别进行体积排阻色谱检测，得到待测溶液色 谱图W及对照品溶液色谱图；所述体积排阻色谱的流动相为硫酸钢溶液或憐酸盐溶液，流 速为 0.5 ~0.8ml/min;
[0052] B)将待测溶液色谱图W及对照品溶液色谱图进行比对，采用面积归一化法得到所 述大分子化合物的含量。
[0053] 本发明采用体积排阻色谱进行银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子化合物的检测。 在检测之前进行待测溶液W及对照品溶液的配制。
[0054] 在本发明中，W银杏二祗内醋葡胺注射液作为待测溶液。本发明在检测银杏二祗 内醋葡胺注射液中的大分子化合物时，W银杏二祗内醋葡胺注射液的原液为待测溶液。
[0055] 在本发明中，选用分子量为4600的右旋糖酢(右旋糖酢分子量D2)溶液作为对照品 溶液。本发明对所述对照品溶液的配制方法并没有特殊限制，本领域技术人员公知的溶液 配制方法即可。在本发明中，优选按照如下方法进行配置：
[0056] 取右旋糖酢分子量化对照品适量，精密称定，称量精度为0.0 Olg，用流动相溶解并 稀释制成每1ml中约含0.5~5mg的溶液，即得。
[0057] 本发明提供的对照品还包括分子量分别为2500、7100、10000、21400W及84400的 右旋糖酢中的一种或多种，即分别对应右旋糖酢分子量D1、右旋糖酢分子量D3、右旋糖酢分 子量D4、右旋糖酢分子量D5W及右旋糖酢分子量D7。本发明对所述右旋糖酢的来源并没有 特殊限制，一般市售即可。
[0058] 本发明对上述对照品溶液的配制方法并没有特殊限制，本领域技术人员公知的溶 液配制方法即可。在本发明中，优选按照如下方法进行配制：
[0059] 分别称取右旋糖酢分子量D1、右旋糖酢分子量D3、右旋糖酢分子量D4、右旋糖酢分 子量D5 W及右旋糖酢分子量D7对照品适量，精密称定，称量精度为0.0 Olg，用流动相溶解并 稀释制成每1ml中约含0.5~5mg的溶液，即得。
[0060] 在本发明中，W右旋糖酢分子量D2作为对照品，在进行体积排阻色谱检测时，将先 于右旋糖酢分子量D2(分子量4600)出峰时间的峰视为大分子物质或聚合物，按面积归一化 法即可计算其量。
[0061] W右旋糖酢分子量D1、右旋糖酢分子量D3、右旋糖酢分子量D4、右旋糖酢分子量D5 W及右旋糖酢分子量D7中的一种或多种作为对照品进行线性关系考察。
[0062] 将待测溶液和对照品溶液配制好后，将待测溶液W及对照品溶液分别进行体积排 阻色谱检测，得到待测溶液色谱图W及对照品溶液色谱图。
[0063] 本发明W体积排阻色谱进行银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子化合物的检测，根 据体积排阻色谱理论，溶质分子的保留是由于小分子化合物进入填满溶剂的填料孔，而较 大的分子根据它们体积的大小而被排阻，大分子优先于小分子被洗脱出来。被测样品中成 分将按照分子量由大到小的顺序被洗脱下来，将先于右旋糖酢分子量D2出峰时间的峰视为 大分子物质或聚合物，按面积归一化法计算其量。本发明w右旋糖酢为对照，并进行检测方 法学考察。
[0064] 在本发明中，在进行体积排阻色谱检测时，对所述检测仪器并没有特殊限制，优选 采用高效液相色谱仪，更优选采用型号为岛津LC-20AB高效液相色谱仪。检测器优选采用示 差检测器。示差检测器为通用型检测器，对多数物质均有响应，可W较好的检测大分子物质 或聚合物。所述体积排阻色谱的色谱柱优选为化enomenex Bios巧-SEC-S2000色谱柱。
[0065] 本发明所述体积排阻色谱的流动相为硫酸钢溶液或憐酸盐溶液，优选为硫酸钢溶 液。其中，所述憐酸盐溶液中包括憐酸氨二钢和二水合憐酸二氨钢，所述憐酸氨二钢的浓度 优选为0.01~O.lmol/L，所述二水合憐酸二氨钢的浓度优选为0.01~O.lmol/L。其中，本发 明对所述憐酸盐溶液的配制方法并没有特殊限制，本领域技术人员公知的溶液配制方法即 可。在本发明中，优选按照如下方式进行憐酸盐溶液的配制:分别称取憐酸氨二钢和二水合 憐酸二氨钢，溶于水中，即得。
[0066] 在本发明中，所述体积排阻色谱的流动相优选为硫酸钢溶液，其中，所述硫酸钢溶 液的浓度优选为0.01~0.1 mo 1/L，在本发明的一些【具体实施方式】中，所述硫酸钢溶液的浓 度为O.Olmol/L，在本发明的另一些【具体实施方式】中，所述硫酸钢溶液的浓度为0.05mol/L， 在本发明的另一些【具体实施方式】中，所述硫酸钢溶液的浓度为O.lmol/L。
[0067] 本发明所述的体积排阻色谱流动相的流速优选为0.5~0.8ml/min;在本发明的一 些【具体实施方式】中，所述流速为〇.5ml/min;在本发明的另一些【具体实施方式】中，所述流速 为0.7ml/min;在本发明的另一些【具体实施方式】中，所述流速为0.8ml/min。
[0068] 在进行检测时，所述体积排阻色谱检测的柱溫为25~35°C，在本发明的一些具体 实施方式中，所述体积排阻色谱检测的柱溫为30°C。
[0069] 将待测溶液与对照品溶液分别注入高效液相色谱仪，通过高液相色谱的检测，得 到待测溶液色谱图W及对照品溶液色谱图，将待测溶液色谱图W及对照品溶液色谱图进行 比对，所述待测溶液色谱图中先于所述分子量为4600的右旋糖酢出峰时间的峰为大分子化 合物，采用面积归一化法得到所述大分子化合物的含量。
[0070] 本发明对所述采用体积排阻色谱进行银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子化合物 检测的具体方法并没有特殊限制，优选按照如下方法进行检测：
[0071] 在配制完成待测溶液后，设定高效液相色谱的流速W及柱溫，量取一定量的待测 溶液注入高效液相色谱仪进行体积排阻色谱检测，得到待测溶液的指纹图谱。即，得到银杏 二祗内醋葡胺注射液的指纹图谱。待测溶液注入高效液相色谱仪的量根据所选用的高效液 相色谱仪及其色谱柱所决定，在本发明中，优选注入lOyL。
[0072] 在配置完成对照品溶液后，设定高效液相色谱的流速W及柱溫，量取一定量的对 照品溶液注入高效液相色谱仪进行体积排阻色谱检测，得到对照品溶液的指纹图谱。对照 品溶液注入高效液相色谱仪的量根据所选用的高效液相色谱仪及其色谱柱所决定，在本发 明中，优选注入lOyL。
[0073] 本发明对上述待测溶液的体积排阻色谱检测W及对照品的体积排阻色谱检测的 顺序并没有限制。
[0074] 接着，将待测溶液色谱图W及对照品溶液色谱图进行比对，所述待测溶液色谱图 中先于所述分子量为4600的右旋糖酢出峰时间的峰为大分子化合物，采用面积归一化法得 到所述待测溶液中大分子化合物的含量。
[0075] 本发明还可W确定银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子化合物的分子量大小，具体 方法如下：
[0076] 选取右旋糖酢分子量D1、右旋糖酢分子量D2、右旋糖酢分子量D3、右旋糖酢分子量 D4、右旋糖酢分子量D5W及右旋糖酢分子量D7作为对照品，分别将上述六种对照品溶解，并 配制成一定浓度的对照品溶液，精密量取各对照品溶液一定体积，注入高效液相色谱仪，记 录色谱图。通过色谱图上的保留时间W及分子量的对数作图，得到右旋糖酢分子量对数-保 留时间曲线图，通过曲线图，可W计算出回归方程。采用本发明提供的测试方法，分子量在 2500~84400范围内，保留时间和分子量的对数关系呈现良好的线性关系。
[0077] 因此，可W通过上述曲线图，并结合银杏二祗内醋葡胺注射液的色谱图中大分子 化合物的出峰时间，可W确定银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子化合物的分子量大小。
[0078] 本发明还提供了一种银杏二祗内醋葡胺注射液制备原料中大分子化合物的检测 方法，包括W下步骤：
[0079] A)W银杏二祗内醋葡胺注射液制备原料溶液作为待测溶液，所述制备原料溶液为 银杏二祗内醋W及葡甲胺的混合溶液；W分子量为4600的右旋糖酢溶液作为对照品溶液； 将待测溶液W及对照品溶液分别进行体积排阻色谱检测，得到待测溶液色谱图W及对照品 溶液色谱图；所述体积排阻色谱的流动相为硫酸钢溶液或憐酸盐溶液，流速为0.5~0.8ml/ min;
[0080] B)将待测溶液色谱图W及对照品溶液色谱图进行比对，采用面积归一化法得到所 述大分子化合物的含量。
[0081] 本发明在进行银杏二祗内醋葡胺注射液制备原料中大分子化合物的检测时，与上 述银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子化合物的检测方法相同，仅是待测溶液不同，所述银 杏二祗内醋葡胺注射液制备原料中大分子化合物的检测中，W银杏二祗内醋葡胺注射液制 备原料溶液作为待测溶液，所述制备原料溶液为银杏二祗内醋W及葡甲胺的混合溶液。
[0082] 本发明对所述银杏二祗内醋W及葡甲胺的混合溶液的制备方法并没有特殊限制， 本领域技术人员公知的混合溶液配制方法即可。在本发明中，所述银杏二祗内醋W及葡甲 胺的混合溶液中银杏二祗内醋的浓度优选 为2~20mg/ml，在本发明的一些具体实施例中， 所述银杏二祗内醋的浓度为5mg/ml;所述葡甲胺的浓度优选为2~20mg/ml，在本发明的一 些具体实施例中，所述葡甲胺的浓度为5mg/ml。
[0083] 所述银杏二祗内醋W及葡甲胺的混合溶液优选按照如下方法进行配制：
[0084] 取银杏二祗内醋和葡甲胺，精密称定，称量精度为O.OOlg，将所述银杏二祗内醋和 葡甲胺置于同一量瓶内，加水适量，于热水浴内振摇溶解后加水稀释至刻度，摇匀，即得。
[0085] 得到待测溶液后，按照上述银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子化合物的检测方法 进行银杏二祗内醋葡胺注射液制备原料中大分子化合物的检测，在此不做寶述。
[0086] 本发明还可W确定银杏二祗内醋葡胺注射液制备原料中大分子化合物的分子量 大小，该方法与所述银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子化合物的分子量大小的测定方法相 同，通过上述方法得到的右旋糖酢分子量对数-保留时间曲线图，并结合银杏二祗内醋葡胺 注射液制备原料的色谱图中大分子化合物的出峰时间，可W确定银杏二祗内醋葡胺注射液 制备原料中大分子化合物的分子量大小。
[0087] 本发明还对银杏二祗内醋葡胺注射液及其制备原料中大分子化合物的检测方法 进行了方法学的考察，主要包括:对照品保留时间及分子量对数的线性关系考察、待测溶液 和对照品溶液的稳定性考察、进样精密度考察、、检测方法的重复性考察、分离度和加样回 收率考察W及检测限考察。本发明对所述稳定性、精密度、重复性的考察方法W及加样回收 率和定量限与检测限的检测方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的考察稳定 性、精密度、重复性的技术方案W及检测加样回收率和定量限与检测限的方法即可。
[0088] 本发明待测溶液的稳定性考察结果说明，本发明提供的方法制备的待测溶液在24 小时内具有良好的稳定性;本发明对照品溶液的稳定性考察结果说明，本发明提供的方法 制备的对照品溶液在24小时内具有良好的稳定性;本发明对照品溶液的精密度考察结果说 明，本发明提供的方法制备的对照品溶液具有良好的精密度;本发明检测方法的重复性考 察结果说明，本发明提供的银杏二祗内醋葡胺注射液及其制备原料中大分子化合物的检测 方法具有良好的重复性;本发明对照品的加样回收率检测结果说明，本发明提供的检测方 法能准确测定银杏二祗内醋葡胺注射液及其制备原料中大分子化合物的含量;本发明对照 品的定量限与检测限检测结果为右旋糖酢分子量D2的定量限为2.01化g、检测限为0.604祉 g。运说明，本发明提供的方法对银杏二祗内醋葡胺注射液及其制备原料中大分子化合物的 测定具有较高的灵敏度。
[0089] 本发明采用体积排阻色谱法对银杏二祗内醋葡胺注射液及其制备原料中大分子 化合物进行检测，检测方法操作简便，灵敏度高、重复性好，各个峰之间有较好的分离度，有 利于计算色谱峰的峰面积。本发明提供的检测方法实现了对银杏二祗内醋葡胺注射液及其 制备原料中大分子化合物的检测。
[0090] 结果表明，本发明提供的银杏二祗内醋葡胺注射液及其制备原料中大分子化合物 的检测方法具有良好的重复性、稳定性和精密度。
[0091] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的银杏二祗内醋葡胺注射 液及其制备原料中大分子化合物的检测方法进行说明，本发明的保护范围不受W下实施例 的限制。
[0092] W下各实施例中，体积排阻色谱的检测仪器采用岛津LC-20AB高效液相色谱仪(配 示差检测器），凝胶柱型号为:Phenomenex Biosep-沈C-S2000，300mmX 7.8mmX 5皿。
[0093] 银杏二祗内醋葡胺注射液选用江苏康缘药业股份有限公司生产的，规格为5ml/ 支，批号分别为 110101、110102、110103、110601、110801、130301、130901、130903、140603、 140604、140605、140606、140607、140608和140609;
[0094] 银杏二祗内醋选用江苏康缘药业股份有限公司生产的批号分别为121101、 121102、121104、110302 和 110401 的银杏二祗内醋；
[00M]葡甲胺选用西安力邦制药有限公司生产的批号为100608B的葡甲胺；
[0096] 对照品：右旋糖酢分子量D1 (分子量2500)、右旋糖酢分子量D2(分子量4600)、右旋 糖酢分子量D3 (分子量7100)、右旋糖酢分子量D4(分子量10000)、右旋糖酢分子量D5 (分子 量21400)?及右旋糖酢分子量D7(分子量84400)均购自中国食品药品检定研究院，批号为 140644-201002。
[0097] 实施例1W0.05mol/L的憐酸盐为流动相
[0098] 1、待测溶液配制：
[0099] (1)取银杏二祗内醋葡胺注射液原液，即得。
[0100] (2)取银杏二祗内醋50mg、葡甲胺50mg，精密称定，置于同一 10ml量瓶内，加水适 量，于热水浴内振摇溶解后加水稀释至刻度，摇匀，即得。
[0101] 2、对照品溶液配制：
[0102] 分别取右旋糖酢分子量Dl(分子量2500)、右旋糖酢分子量D2(分子量4600)、右旋 糖酢分子量D3 (分子量7100)、右旋糖酢分子量D4(分子量10000)、右旋糖酢分子量D5 (分子 量21400)适量，分别加水溶解并制成Img/ml的溶液，作为对照品溶液。
[0103] 3、流动相的配置：
[0104] 将憐酸氨二钢4.2?和二水合憐酸二氨钢4.3始溶于1000ml水中，即得
[0105] 4、试验条件：
[0106] 仪器:岛津LC-20AB高效液相色谱仪(示差检测器）。
[0107] 凝胶柱：Phenomenex Biosep-SEC-S2000，300mm X 7.8mm X 5皿，适用分子量范围 1000Da-300000Da。
[010 引柱溫：30°C。
[0109] 流速:每分钟0.7ml。
[0110] 5、试验方法：
[0111] 精密量取步骤1得到的银杏二祗内醋葡胺注射液及其制备原料溶液各10化，分别 注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1和图2,图1为银杏二祗内醋葡胺注射液的制备原 料在憐酸盐为流动相的条件下的色谱图；图2为银杏二祗内醋葡胺注射液在憐酸盐为流动 相的条件下的色谱图。
[0112] 精密量取5种对照品溶液各10化，分别注入液相色谱仪，考察对照品溶液在憐酸盐 为流动相的条件下的保留时间及回归关系，结果见表1，表1为对照品溶液在憐酸盐为流动 相的条件下的保留时间及回归关系。
[0113] 表1对照品溶液在憐酸盐为流动相的条件下的保留时间及回归关系
[0114]
[0115] 实施例2 W0.05mol/L硫酸钢为流动相
[0116] 1、待测溶液配制：
[0117] (1)取银杏二祗内醋葡胺注射液原液，即得。
[0118] (2)取银杏二祗内醋50mg、葡甲胺50mg，精密称定，置于同一 10ml量瓶内，加水适 量，于热水浴内振摇溶解后加水稀释至刻度，摇匀，即得。
[0119] 2、对照品溶液配制：
[0120] 分别取右旋糖酢分子量Dl(分子量2500)、右旋糖酢分子量D2(分子量4600)、右旋 糖酢分子量D3 (分子量7100)、右旋糖酢分子量D4(分子量10000)、右旋糖酢分子量D5 (分子 量21400)适量，分别加水溶解并制成Img/ml的溶液，作为对照品溶液。
[0121] 3、流动相的配置：
[0122] 将7. Ig硫酸钢溶于1000ml水中，即得
[0123] 4、试验条件：
[0124] 仪器:岛津LC-20AB高效液相色谱仪(示差检测器）。
[01 巧]凝胶柱：Phenomenex Biosep-SEC-S2000，300mm X 7.8mm X 5皿，适用分子量范围 1000Da-300000Da。
[0126] 柱溫:30°C。
[0127] 流速:每分钟0.7ml。
[012引5、试验方法：
[0129] 精密量取步骤1得到的银杏二祗内醋葡胺注射液及其制备原料溶液各10化，分别 注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图3和图4,图3为银杏二祗内醋葡胺注射液的制备原 料在硫酸钢为流动相的条件下的色谱图；图4为银杏二祗内醋葡胺注射液在硫酸钢为流动 相的条件下的色谱图。
[0130] 精密量取5种对照品溶液各10化，分别注入液相色谱仪，考察对照品溶液在硫酸钢 为流动相的条件下的保留时间及回归关系，结果见表2,表2为对照品溶液在硫酸钢为流动 相的条件下的保留时间及回归关系。
[0131] 表1对照品溶液在硫酸钢为 流动相的条件下的保留时间及回归关系
[0132]
[0133]
[0134] 实施例3W对照品的保留时间及分子量对数的线性关系考察
[0135] 称取右旋糖酢分子量Dl(分子量2500)、右旋糖酢分子量D2(分子量4600)、右旋糖 酢分子量D3 (分子量7100)、右旋糖酢分子量D4 (分子量10000)、右旋糖酢分子量D5 (分子量 21400)?及右旋糖酢分子量D7(分子量84400)六种右旋糖酢对照品适量，分别加0.05mol/L 的硫酸钢溶解并制成一定浓度的对照品溶液，即右旋糖酢分子量D10.94mg/ml、右旋糖酢分 子量D21.008mg/ml、右旋糖酢分子量D31.42mg/ml、右旋糖酢分子量D40.92mg/ml、右旋糖酢 分子量D51.21mg/ml、右旋糖酢分子量D71.15mg/ml，精密量取各对照品溶液10μ1，注入高效 液相色谱仪，流动相的配置W及实验条件如实施例2,记录色谱图。具体结果见图5,图5为六 种右旋糖酢对照品的色谱图，图5中，1为右旋糖酢分子量D1的色谱图，2为右旋糖酢分子量 D2的色谱图，3为右旋糖酢分子量D3的色谱图，4为右旋糖酢分子量D4的色谱图，5为右旋糖 酢分子量D5的色谱图，6为右旋糖酢分子量D7的色谱图。对所述试验数据见表3,表3为6种右 旋糖酢分子量对数和保留时间结果。
[0136] 表3右旋糖酢分子量对数和保留时间结果
[0137]
[0138] 通过表3进行右旋糖酢分子量对数-保留时间曲线。W保留时间X(min)为横坐标， 分子量对数Y为纵坐标，绘制分子量对数-保留时间曲线，结果见图6，图6为六种右旋糖酢对 照品的分子量对数-保留时间曲线。得回归方程：Υ = -〇. 2988X^.4493，相关系数R2 = 0 · 9932 〇
[0139] 结果表明：在此色谱条件下，分子量在2500~84400范围，保留时间和分子量的对 数呈现良好的线性关系。
[0140] 实施例4不同流速的考察
[0141] W实施例3提供的试验过程为准，其他条件与实施例3相同，仅改变流动相流速，即 分别 W 流速 〇.51111/111111、0.61111/111111、0.81111/111111，考察右旋糖酢分子量01(分子量2500)、右旋 糖酢分子量D2(分子量4600)、右旋糖酢分子量D3(分子量7100)、右旋糖酢分子量D4(分子量 10000)、右旋糖酢分子量D5(分子量21400)?及右旋糖酢分子量D7(分子量84400)六种右旋 糖酢对照品的线性关系，结果见下表4,表4为在不同的流动相流速条件下右旋糖酢分子量 对数和保留时间结果。
[0142] 表4在不同的流动相流速条件下右旋糖酢分子量对数和保留时间结果
[0143]
[0144] 由表4可 W看出，分别在0.5ml/min、0.6ml/min、0.8ml/min的流速下，Κ〇ι、〇2、〇3、 D4、Ds、D7对照品的保留时间-分子量对数建立的线性方程，线性关系均良好，相关系数r均大 于0.99。
[0145] 实施例5
[0146] W实施例3提供的试验过程为准，其他条件与实施例3相同，仅改变流动相的浓度， 即分别W0.01M硫酸钢和0.1M硫酸钢为流动相，右旋糖酢分子量D1 (分子量2500)、右旋糖酢 分子量D2(分子量4600)、右旋糖酢分子量D3(分子量7100)、右旋糖酢分子量D4(分子量 10000)、右旋糖酢分子量D5(分子量21400)?及右旋糖酢分子量D7(分子量84400)六种右旋 糖酢对照品的线性关系，结果见下表5,表5为在不同的流动相浓度条件下右旋糖酢分子量 对数和保留时间结果。
[0147] 表5在不同的流动相浓度条件下右旋糖酢分子量对数和保留时间结果 [014 引
[0150] 由结果可W看出，在流动相分别为O.OIM硫酸钢和O.IM硫酸钢下，W化、〇2、化、〇4、 〇5、化对照品的保留时间-分子量对数建立的线性方程，线性关系均良好，相关系数r均大于 0 · 99 〇
[0151] 实施例6进样精密度试验
[0152] 选取实施例3中所用的右旋糖酢分子量D2对照品溶液，精密量取10μ1注入液相色 谱仪，连续进样6次，实验条件同实施例3,记录色谱图，考察化保留时间，结果见表6,表6为 右旋糖酢分子量D2的进样精密度考察结果。
[0153] 表6右旋糖酢分子量D2的进样精密度考察结果
[0154]
[0Κ5]结果表明:连续进样6次，RSD小于2.0%，表明在此条件下进样精密度良好。
[0156] 实施例7溶液稳定性试验
[0157] 1成品供试品溶液稳定性考察
[0158] 取110101批银杏二祗内醋葡胺注射液原液作为成品供试品溶液，于化、9h、13.5h、 1她、24h，精密量取成品供试品溶液10μ1，注入液相色谱仪，实验条件同实施例3,记录色谱 图，考察主峰保留时间和峰面积，结果见表7,表7为成品供试品溶液稳定性结果。
[0159] 表7成品供试品溶液稳定性结果
[0160]
[0161] 结果表明：成品供试品溶液色谱峰保留时间和峰面积的RSD均小于2%，故在24小 时内溶液稳定良好。
[0162] 2原料供试品溶液稳定性考察
[0163] 取银杏二祗内醋50mg、葡甲胺50mg，精密称定，置于同一10ml量瓶内，加水适量，于 热水浴内振摇溶解后加水稀释至刻度，摇匀，作为原料供试品溶液，于化、2h、化、她、12h、 16h，精密量取原料供试品溶液10μ1，注入液相色谱仪，实验条件同实施例3,记录色谱图，考 察保留时间，结果见表8,表8为原料供试品溶液稳定性结果。
[0164] 表8原料供试品溶液稳定性结果
[01 化]
[0166] 结果表明：原料供试品溶液色谱峰保留时间和峰面积的RSD均小于2%，故在16小 时内溶液稳定性良好。
[0167] 3对照品溶液稳定性考察
[0168] 取实施例3中所用的右旋糖酢分子量D2溶液为对照品溶液。分别于化、化、化、地、 化、她，精密量取供试品溶液、对照溶液各10μ1，分别注入液相色谱仪，实验条件同实施例3， 记录色谱图，考察保留时间，结果见表9。
[0169] 表9右旋糖酢分子量D2对照品溶液稳定性结果 [01701
[0171] 结果表明：对照品溶液的保留时间在化内无明显变化，但峰面积在化后明显增加， 故最好在化内完成进样测定。
[0172] 实施例8重复性考察
[0173] 1成品重复性考察
[0174] 取银杏二祗内醋葡胺注射液原液作为供试品溶液，平行制备供试品6份。精密量取 供试品溶液?〇μ1注入液相色谱仪，实验条件同实施例3,记录色谱图，计算大分子物质和聚 合物含量，考察主峰保留时间，结果见表10。
[01巧]表10成品重复性考察结果
[0176]
[0177] 结果表明：本品平行测定6份，均未检出分子量大于4600的大分子物质和聚合物， 供试品溶液主峰的保留时间的RSD均小于2%，本测定方法重复性良好。
[0178] 2原料重复性考察
[0179] 取银杏二祗内醋50mg、葡甲胺50mg，精密称定，置于同一10ml量瓶内，加水适量，于 热水浴内振摇溶解后加水稀释至刻度，摇匀，作为原料供试品溶液，平行制备供试品6份。精 密量取供试品溶液?〇μ1注入液相色谱仪，实验条件同实施例3,记录色谱图，计算大分子物 质和聚合物含量，考察主峰保留时间，结果见表11。
[0180] 表11原料重复性考察结果
[0181]
[0182] 结果表明：本品平行测定6份，均未检出分子量大于4600的大分子物质和聚合物， 供试品溶液色谱峰保留时间的RSD均小于2%，本测定方法重复性良好。
[0183] 实施例9分离度和加样回收率考察
[0184] 1成品分离度和加样回收率考察
[0185] 精密量取右旋糖酢分子量化对照品适量，用银杏二祗内醋葡胺注射液溶解并制成 每毫升含〇.2mg右旋糖酢分子量化的溶液作为供试品溶液，平行制备供试品6份，分别记为 样1~样6。精密量取供试品溶液10μ1注入液相色谱仪，实验条件同实施例3,记录色谱图，考 察右旋糖酢分子量化与邻近峰的分离度及加样回收率。结果见表12。
[0186] 表12成品分离度和加样回收率考察结果
[0187]
[0188] 结果表明：本品平行测定6份，右旋糖酢化与邻近峰的分离度均大于1.5,平均回收 率为97.2%，RSD小于2%，回收率良好，该色谱条件可W满足测定要求。
[0189] 2原料分离度和加样回收率考察
[0190] 取银杏二祗内醋50mg、葡甲胺50mg、右旋糖酢分子量化约 2mg，精密称定，置于同一 10ml量瓶内，加水适量，于热水浴内振摇溶解后加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，平 行制备供试品6份，分别记为样1~样6。精密量取供试品溶液10μ1注入液相色谱仪，实验条 件同实施例3,记录色谱图，考察化与邻近峰的分离度及加样回收率。结果见表13。
[0191] 表13原料分离度和加样回收率考察结果
[0192]
[0194] 结果表明：本品平行测定6份，右旋糖酢分子量化与邻近峰的分离度均不低于1.5， 平均回收率为96.8%，RSD小于2%，回收率良好，该色谱条件可W满足测定要求。
[01M]实施例10检测限考察
[0196] 精密量实施例3提供的右旋糖酢分子量化对照品溶液1ml，加0.05mol/L的硫酸钢 流动相稀释至10ml，摇匀，精密量取此溶液扣1、化1、化1、祉1、10μ1，依次注入液相色谱仪， 记录色谱图。结果见表14和图7,表14为检出限考察结果，图7为右旋糖酢分子量D2检测线考 察色谱图。
[0197] 表14检出限考察结果 [019 引
[0199] 结果表明：当进样量为0.604祉g时，信噪比约为3，故检测限为0.06048mg/ml，进样 10μ1(0.604祉邑）。
[0200] 实施例11银杏二祗内醋葡胺注射液及其制备原料中大分子化合物的检测
[0201] 1银杏二祗内醋葡胺注射液大分子、聚合物测定方法--W右旋糖酢D2为对照
[0202] 色谱条件与系统适用性试验：
[0203] 色谱柱：Phenomenex Bios邱-沈C-S2000(300mmX7.8mm);
[0204] W〇.〇5mol/L硫酸钢为流动相；
[02化]流速为每分钟0.7ml;
[0206]柱溫30°C;示差检测器。
[0207] 理论板数按右旋糖酢D2计算应不低于3000。
[0208] 供试品溶液制备取银杏二祗内醋葡胺注射液原液，即得。
[0209] 对照品溶液制备取右旋糖酢分子量D2对照品适量，精密称定，加0.05mol/L的硫酸 钢流动相溶解并稀释制成每1ml中约含Img的溶液，即得。
[0210] 测定仿法：
[0211] 精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μ1注入液相色谱仪，记录色谱图，将先于 右旋糖酢分子量D2(分子量4600)出峰时间的峰视为大分子物质或聚合物，按面积归一化法 计算其量。
[0212] 按上述大分子物质和聚合物测定方法对批号为110101、110102、110103、110601、 110801、130301、130901、130903、140603、140604、140605、140606、140607、140608、140609 十五批银杏二祗内醋葡胺注射液进行大分子物质和聚合物测定，结果：WD2为对照测定，十 四批银杏二祗内醋葡胺注射液均未检出分子量大于4600的大分子物质或聚合物。具体结果 见图8~图22。
[0213] 2银杏二祗内醋原料大分子、聚合物测定方法--W右旋糖酢D2为对照品
[0214] 色谱条件与系统适用性试验：
[0215] 色谱柱：Phenomenex Bios邱-沈C-S2000(300mmX7.8mm)示差检测器；
[0216] W〇.〇5mol/L硫酸钢为流动相；
[0217] 流速为每分钟0.7ml; 脚8] 柱溫30。。
[0219] 理论板数按右旋糖酢D2计算应不低于3000。
[0220] 供试品溶液制备：取银杏二祗内醋50mg、葡甲胺50mg，精密称定，置于同一 10ml量 瓶内，加水适量，于热水浴内振摇溶解后加水稀释至刻度，摇匀，即得。
[0221] 对照品溶液制备：取右旋糖酢分子量D2对照品适量，精密称定，加0.05mol/L的硫 酸钢流动相溶解并稀释制成每1ml中约含Img的溶液，即得。
[0222] 测定方法：
[0223] 精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μ1注入液相色谱仪，记录色谱图，将先于 右旋糖酢分子量D2(分子量4600)出峰时间的峰视为大分子物质或聚合物，按面积归一化法 计算其量。
[0224] 按上述大分子物质和聚合物测定方法对批号为121101、121102、121104、110302、 110401五批银杏二祗内醋进行大分子物质和聚合物测定，结果：WD2为对照测定，五批银杏 二祗内醋均未检出分子量大于4600的大分子物质或聚合物。结果见图23~图27。
[0225] 本研究选用6种右旋糖酢分别作为参照物进行研究，建立了银杏二祗内醋葡胺注 射液成品和原料的大分子物质和聚合物测定方法，示差检测器为通用型检测器，对多数物 质均有响应，可W较好的检测大分子物质或聚合物。本实验采用峰面积归一化法计算大分 子物质和聚合物含量，对14批成品、5批原料进行检测，结果均未检出大分子物质或聚合物。
[0226] 本研究建立了银杏二祗内醋葡胺注射液大分子物质和聚合物检测方法，通过重复 性、分离度、加样回收、检出限、精密度、分子量对数-保留时间曲线、溶液稳定性考察，证明 本方法操作简便、灵敏度高、重复性好，可用于中药注射液工艺过程质量控制。
[0227] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可w做出若干改进和润饰，运些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种银杏二萜内酯葡胺注射液中大分子化合物的检测方法，其特征在于，包括以下 步骤： A) 以银杏二萜内酯葡胺注射液作为待测溶液，以分子量为4600的右旋糖酐溶液作为对 照品溶液;将待测溶液以及对照品溶液分别进行体积排阻色谱检测，得到待测溶液色谱图 以及对照品溶液色谱图；所述体积排阻色谱的流动相为硫酸钠溶液或磷酸盐溶液，流速为 0.5~0.8ml/min; B) 将待测溶液色谱图以及对照品溶液色谱图进行比对，采用面积归一化法得到所述大 分子化合物的含量。2. -种银杏二萜内酯葡胺注射液制备原料中大分子化合物的检测方法，其特征在于， 包括以下步骤： A) 以银杏二萜内酯葡胺注射液制备原料溶液作为待测溶液，所述制备原料溶液为银杏 二萜内酯以及葡甲胺的混合溶液；以分子量为4600的右旋糖酐溶液作为对照品溶液;将待 测溶液以及对照品溶液分别进行体积排阻色谱检测，得到待测溶液色谱图以及对照品溶液 色谱图；所述体积排阻色谱的流动相为硫酸钠溶液或磷酸盐溶液，流速为〇. 5~0.8ml/min; B) 将待测溶液色谱图以及对照品溶液色谱图进行比对，采用面积归一化法得到所述大 分子化合物的含量。3. 根据权利要求1或权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述流动相为硫酸钠溶 液，所述硫酸钠溶液的浓度为〇. 01~〇.lmol/L。4. 根据权利要求1或权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述对照品还包括分子 量分别为2500、7100、10000、21400以及84400的右旋糖酐中的一种或多种。5. 根据权利要求1或权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述银杏二萜内酯以及 葡甲胺的混合溶液中银杏二萜内酯的浓度为2-20mg/ml，葡甲胺的浓度为2-20mg/ml。6. 根据权利要求1或权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述对照品溶液的浓度 为0·5_5mg/ml〇7. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述分子量分别为2500、7100、10000、 21400以及84400的右旋糖酐的溶液浓度均为0.5-5mg/ml。8. 根据权利要求1或权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述体积排阻色谱的检 测器为示差检测器。9. 根据权利要求1或权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述体积排阻色谱的色 谱柱为PhenomenexBiosep-SEC_S2000色谱柱。10. 根据权利要求1或权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述体积排阻色谱检测 的柱温为25~35°C。
【专利摘要】本发明采用体积排阻色谱法对银杏二萜内酯葡胺注射液及其制备原料中大分子化合物进行检测，检测方法操作简便，灵敏度高、重复性好，各个峰之间有较好的分离度，有利于计算色谱峰的峰面积。本发明提供的检测方法实现了对银杏二萜内酯葡胺注射液及其制备原料中大分子化合物的检测。结果表明，本发明提供的银杏二萜内酯葡胺注射液及其制备原料中大分子化合物的检测方法具有良好的重复性、稳定性和精密度。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/88
【公开号】CN105486792
【申请号】CN201510822358
【发明人】萧伟, 王雪, 张伟, 李家春, 黄文哲, 王振中
【申请人】江苏康缘药业股份有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年11月23日
【技术领域】
[0001 ]本发明属于医药技术领域，具体设及一种银杏二祗内醋葡胺注射液及原料中大分 子化合物的检测方法。
【背景技术】
[0002] 银杏二祗内醋葡胺注射液是W银杏叶为原料，经提取纯化后得到其有效部位银杏 二祗内醋(银杏内醋A、B、K等），并W银杏二祗内醋和葡甲胺为制备原料制成注射液。该药具 有活血通络之功效，临床用于脑梗死（中风病中经络疲疲阻络证)的治疗，症见半身不遂、口 舌歪斜、言语馨涩、肢体麻木等。
[0003] 银杏二祗内醋葡胺注射液W及制备原料多为提纯物，成分较为复杂，一些大分子 化合物W胶体的形式存在于药液中，当通过静脉注射或肌肉注射与其他药物配伍时，由于 pH值变化及其他因素，极易聚合成更大的分子或多分子团粒，进入人体后，很容易导致不良 反应的发生。因此，为了保证临床用药的安全，更好的控制药品的质量，需要对银杏二祗内 醋葡胺注射液及原料中大分子化合物制定合理的检测方法。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种银杏二祗内醋葡胺注射液及原 料中大分子化合物的检测方法，本发明提供的检测方法操作简便，灵敏度高、重复性好，可 用于银杏二祗内醋葡胺注射液及原料中大分子化合物的检测。
[0005] 本发明提供了一种银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子化合物的检测方法，包括W 下步骤：
[0006] A)W银杏二祗内醋葡胺注射液作为待测溶液，W分子量为4600的右旋糖酢溶液作 为对照品溶液;将待测溶液W及对照品溶液分别进行体积排阻色谱检测，得到待测溶液色 谱图W及对照品溶液色谱图；所述体积排阻色谱的流动相为硫酸钢溶液或憐酸盐溶液，流 速为 0.5 ~0.8ml/min;
[0007] B)将待测溶液色谱图W及对照品溶液色谱图进行比对，采用面积归一化法得到所 述大分子化合物的含量。
[000引本发明还提供了一种银杏二祗内醋葡胺注射液制备原料中大分子化合物的检测 方法，包括W下步骤：
[0009] A)W银杏二祗内醋葡胺注射液制备原料溶液作为待测溶液，所述制备原料溶液为 银杏二祗内醋W及葡甲胺的混合溶液；W分子量为4600的右旋糖酢溶液作为对照品溶液； 将待测溶液W及对照品溶液分别进行体积排阻色谱检测，得到待测溶液色谱图W及对照品 溶液色谱图；所述体积排阻色谱的流动相为硫酸钢溶液或憐酸盐溶液，流速为0.5~0.8ml/ min；
[0010] B)将待测溶液色谱图W及对照品溶液色谱图进行比对，采用面积归一化法得到所 述大分子化合物的含量。
[0011] 优选的，所述流动相为硫酸钢溶液，所述硫酸钢溶液的浓度为0.01~0.1mol/L。
[0012] 优选的，所述对照品还包括分子量分别为2500、7100、10000、21400 W及84400的右 旋糖酢中的一种或多种。
[0013] 优选的，所述银杏二祗内醋W及葡甲胺的混合溶液中银杏二祗内醋的浓度为2~ 20mg/ml，葡甲胺的浓度为2~20mg/ml。
[0014] 优选的，所述对照品溶液的浓度为0.5~5mg/ml。
[0015] 优选的，所述分子量分别为2500、7100、10000、21400^及84400的右旋糖酢的溶液 浓度均为0.5~5mg/ml。
[0016] 优选的，所述体积排阻色谱的检测器为示差检测器。
[0017] 优选的，所述体积排阻色谱的色谱柱为化enomenex Biosep-SEC-S2000色谱柱。
[0018] 优选的，所述体积排阻色谱检测的柱溫为25~35°C。
[0019] 与现有技术相比，本发明提供了一种银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子化合物的 检测方法，包括W下步骤:A)W银杏二祗内醋葡胺注射液作为待测溶液，W分子量为4600的 右旋糖酢溶液作为对照品溶液;将待测溶液W及对照品溶液分别进行体积排阻色谱检测， 得到待测溶液色谱图W及对照品溶液色谱图；所述体积排阻色谱的流动相为硫酸钢溶液或 憐酸盐溶液，流速为0.5~0.8ml/min;B)将待测溶液色谱图W及对照品溶液色谱图进行比 对，采用面积归一化法得到所述大分子化合物的含量。
[0020] 同时，本发明还提供了一种银杏二祗内醋葡胺注射液制备原料中大分子化合物的 检测方法，包括W下步骤:A)W银杏二祗内醋葡胺注射液制备原料溶液作为待测溶液，所述 制备原料溶液为银杏二祗内醋W及葡甲胺的混合溶液；W分子量为4600的右旋糖酢溶液作 为对照品溶液;将待测溶液W及对照品溶液分别进行体积排阻色谱检测，得到待测溶液色 谱图W及对照品溶液色谱图；所述体积排阻色谱的流动相为硫酸钢溶液或憐酸盐溶液，流 速为0.5~0.8ml/min;B)将待测溶液色谱图W及对照品溶液色谱图进行比对，采用面积归 一化法得到所述大分子化合物的含量。
[0021] 本发明采用体积排阻色谱法对银杏二祗内醋葡胺注射液及其制备原料中大分子 化合物进行检测，检测方法操作简便，灵敏度高、重复性好，各个峰之间有较好的分离度，有 利于计算色谱峰的峰面积。本发明提供的检测方法实现了对银杏二祗内醋葡胺注射液及其 制备原料中大分子化合物的检测。
[0022] 结果表明，本发明提供的银杏二祗内醋葡胺注射液及其制备原料中大分子化合物 的检测方法具有良好的重复性、稳定性和精密度。
【附图说明】
[0023] 图1为银杏二祗内醋葡胺注射液的制备原料在憐酸盐为流动相的条件下的色谱 图；
[0024] 图2为银杏二祗内醋葡胺注射液在憐酸盐为流动相的条件下的色谱图；
[0025] 图3为银杏二祗内醋葡胺注射液的制备原料在硫酸钢为流动相的条件下的色谱 图；
[0026] 图4为银杏二祗内醋葡胺注射液在硫酸钢为流动相的条件下的色谱图；
[0027] 图5为六种右旋糖酢对照品的色谱图；
[0028] 图6为六种右旋糖酢对照品的分子量对数-保留时间曲线；
[0029] 图7为右旋糖酢分子量D2检测线考察色谱图；
[0030] 图8为批号为130301银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色谱 图；
[0031] 图9为批号为130901银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色谱 图；
[0032] 图10为批号为130903银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0033] 图11为批号为140603银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0034] 图12为批号为140604银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0035] 图13为批号为140605银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0036] 图14为批号为140606银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0037] 图15为批号为140607银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0038] 图16为批号为140608银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0039] 图17为批号为140609银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0040] 图18为批号为110101银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0041] 图19为批号为110102银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0042] 图20为批号为110103银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0043] 图21为批号为110601银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0044] 图22为批号为110801银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子物质和聚合物检测的色 谱图；
[0045] 图23为批号为110302银杏二祗内醋中大分子物质和聚合物检测的色谱图；
[0046] 图24为批号为110401银杏二祗内醋中大分子物质和聚合物检测的色谱图；
[0047] 图25为批号为121101银杏二祗内醋中大分子物质和聚合物检测的色谱图；
[0048] 图26为批号为121102银杏二祗内醋中大分子物质和聚合物检测的色谱图；
[0049] 图27为批号为121104银杏二祗内醋中大分子物质和聚合物检测的色谱图。
【具体实施方式】
[0050] 本发明提供了一种银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子化合物的检测方法，包括W 下步骤：
[0051] A)W银杏二祗内醋葡胺注射液作为待测溶液，W分子量为4600的右旋糖酢溶液作 为对照品溶液;将待测溶液W及 对照品溶液分别进行体积排阻色谱检测，得到待测溶液色 谱图W及对照品溶液色谱图；所述体积排阻色谱的流动相为硫酸钢溶液或憐酸盐溶液，流 速为 0.5 ~0.8ml/min;
[0052] B)将待测溶液色谱图W及对照品溶液色谱图进行比对，采用面积归一化法得到所 述大分子化合物的含量。
[0053] 本发明采用体积排阻色谱进行银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子化合物的检测。 在检测之前进行待测溶液W及对照品溶液的配制。
[0054] 在本发明中，W银杏二祗内醋葡胺注射液作为待测溶液。本发明在检测银杏二祗 内醋葡胺注射液中的大分子化合物时，W银杏二祗内醋葡胺注射液的原液为待测溶液。
[0055] 在本发明中，选用分子量为4600的右旋糖酢(右旋糖酢分子量D2)溶液作为对照品 溶液。本发明对所述对照品溶液的配制方法并没有特殊限制，本领域技术人员公知的溶液 配制方法即可。在本发明中，优选按照如下方法进行配置：
[0056] 取右旋糖酢分子量化对照品适量，精密称定，称量精度为0.0 Olg，用流动相溶解并 稀释制成每1ml中约含0.5~5mg的溶液，即得。
[0057] 本发明提供的对照品还包括分子量分别为2500、7100、10000、21400W及84400的 右旋糖酢中的一种或多种，即分别对应右旋糖酢分子量D1、右旋糖酢分子量D3、右旋糖酢分 子量D4、右旋糖酢分子量D5W及右旋糖酢分子量D7。本发明对所述右旋糖酢的来源并没有 特殊限制，一般市售即可。
[0058] 本发明对上述对照品溶液的配制方法并没有特殊限制，本领域技术人员公知的溶 液配制方法即可。在本发明中，优选按照如下方法进行配制：
[0059] 分别称取右旋糖酢分子量D1、右旋糖酢分子量D3、右旋糖酢分子量D4、右旋糖酢分 子量D5 W及右旋糖酢分子量D7对照品适量，精密称定，称量精度为0.0 Olg，用流动相溶解并 稀释制成每1ml中约含0.5~5mg的溶液，即得。
[0060] 在本发明中，W右旋糖酢分子量D2作为对照品，在进行体积排阻色谱检测时，将先 于右旋糖酢分子量D2(分子量4600)出峰时间的峰视为大分子物质或聚合物，按面积归一化 法即可计算其量。
[0061] W右旋糖酢分子量D1、右旋糖酢分子量D3、右旋糖酢分子量D4、右旋糖酢分子量D5 W及右旋糖酢分子量D7中的一种或多种作为对照品进行线性关系考察。
[0062] 将待测溶液和对照品溶液配制好后，将待测溶液W及对照品溶液分别进行体积排 阻色谱检测，得到待测溶液色谱图W及对照品溶液色谱图。
[0063] 本发明W体积排阻色谱进行银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子化合物的检测，根 据体积排阻色谱理论，溶质分子的保留是由于小分子化合物进入填满溶剂的填料孔，而较 大的分子根据它们体积的大小而被排阻，大分子优先于小分子被洗脱出来。被测样品中成 分将按照分子量由大到小的顺序被洗脱下来，将先于右旋糖酢分子量D2出峰时间的峰视为 大分子物质或聚合物，按面积归一化法计算其量。本发明w右旋糖酢为对照，并进行检测方 法学考察。
[0064] 在本发明中，在进行体积排阻色谱检测时，对所述检测仪器并没有特殊限制，优选 采用高效液相色谱仪，更优选采用型号为岛津LC-20AB高效液相色谱仪。检测器优选采用示 差检测器。示差检测器为通用型检测器，对多数物质均有响应，可W较好的检测大分子物质 或聚合物。所述体积排阻色谱的色谱柱优选为化enomenex Bios巧-SEC-S2000色谱柱。
[0065] 本发明所述体积排阻色谱的流动相为硫酸钢溶液或憐酸盐溶液，优选为硫酸钢溶 液。其中，所述憐酸盐溶液中包括憐酸氨二钢和二水合憐酸二氨钢，所述憐酸氨二钢的浓度 优选为0.01~O.lmol/L，所述二水合憐酸二氨钢的浓度优选为0.01~O.lmol/L。其中，本发 明对所述憐酸盐溶液的配制方法并没有特殊限制，本领域技术人员公知的溶液配制方法即 可。在本发明中，优选按照如下方式进行憐酸盐溶液的配制:分别称取憐酸氨二钢和二水合 憐酸二氨钢，溶于水中，即得。
[0066] 在本发明中，所述体积排阻色谱的流动相优选为硫酸钢溶液，其中，所述硫酸钢溶 液的浓度优选为0.01~0.1 mo 1/L，在本发明的一些【具体实施方式】中，所述硫酸钢溶液的浓 度为O.Olmol/L，在本发明的另一些【具体实施方式】中，所述硫酸钢溶液的浓度为0.05mol/L， 在本发明的另一些【具体实施方式】中，所述硫酸钢溶液的浓度为O.lmol/L。
[0067] 本发明所述的体积排阻色谱流动相的流速优选为0.5~0.8ml/min;在本发明的一 些【具体实施方式】中，所述流速为〇.5ml/min;在本发明的另一些【具体实施方式】中，所述流速 为0.7ml/min;在本发明的另一些【具体实施方式】中，所述流速为0.8ml/min。
[0068] 在进行检测时，所述体积排阻色谱检测的柱溫为25~35°C，在本发明的一些具体 实施方式中，所述体积排阻色谱检测的柱溫为30°C。
[0069] 将待测溶液与对照品溶液分别注入高效液相色谱仪，通过高液相色谱的检测，得 到待测溶液色谱图W及对照品溶液色谱图，将待测溶液色谱图W及对照品溶液色谱图进行 比对，所述待测溶液色谱图中先于所述分子量为4600的右旋糖酢出峰时间的峰为大分子化 合物，采用面积归一化法得到所述大分子化合物的含量。
[0070] 本发明对所述采用体积排阻色谱进行银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子化合物 检测的具体方法并没有特殊限制，优选按照如下方法进行检测：
[0071] 在配制完成待测溶液后，设定高效液相色谱的流速W及柱溫，量取一定量的待测 溶液注入高效液相色谱仪进行体积排阻色谱检测，得到待测溶液的指纹图谱。即，得到银杏 二祗内醋葡胺注射液的指纹图谱。待测溶液注入高效液相色谱仪的量根据所选用的高效液 相色谱仪及其色谱柱所决定，在本发明中，优选注入lOyL。
[0072] 在配置完成对照品溶液后，设定高效液相色谱的流速W及柱溫，量取一定量的对 照品溶液注入高效液相色谱仪进行体积排阻色谱检测，得到对照品溶液的指纹图谱。对照 品溶液注入高效液相色谱仪的量根据所选用的高效液相色谱仪及其色谱柱所决定，在本发 明中，优选注入lOyL。
[0073] 本发明对上述待测溶液的体积排阻色谱检测W及对照品的体积排阻色谱检测的 顺序并没有限制。
[0074] 接着，将待测溶液色谱图W及对照品溶液色谱图进行比对，所述待测溶液色谱图 中先于所述分子量为4600的右旋糖酢出峰时间的峰为大分子化合物，采用面积归一化法得 到所述待测溶液中大分子化合物的含量。
[0075] 本发明还可W确定银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子化合物的分子量大小，具体 方法如下：
[0076] 选取右旋糖酢分子量D1、右旋糖酢分子量D2、右旋糖酢分子量D3、右旋糖酢分子量 D4、右旋糖酢分子量D5W及右旋糖酢分子量D7作为对照品，分别将上述六种对照品溶解，并 配制成一定浓度的对照品溶液，精密量取各对照品溶液一定体积，注入高效液相色谱仪，记 录色谱图。通过色谱图上的保留时间W及分子量的对数作图，得到右旋糖酢分子量对数-保 留时间曲线图，通过曲线图，可W计算出回归方程。采用本发明提供的测试方法，分子量在 2500~84400范围内，保留时间和分子量的对数关系呈现良好的线性关系。
[0077] 因此，可W通过上述曲线图，并结合银杏二祗内醋葡胺注射液的色谱图中大分子 化合物的出峰时间，可W确定银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子化合物的分子量大小。
[0078] 本发明还提供了一种银杏二祗内醋葡胺注射液制备原料中大分子化合物的检测 方法，包括W下步骤：
[0079] A)W银杏二祗内醋葡胺注射液制备原料溶液作为待测溶液，所述制备原料溶液为 银杏二祗内醋W及葡甲胺的混合溶液；W分子量为4600的右旋糖酢溶液作为对照品溶液； 将待测溶液W及对照品溶液分别进行体积排阻色谱检测，得到待测溶液色谱图W及对照品 溶液色谱图；所述体积排阻色谱的流动相为硫酸钢溶液或憐酸盐溶液，流速为0.5~0.8ml/ min;
[0080] B)将待测溶液色谱图W及对照品溶液色谱图进行比对，采用面积归一化法得到所 述大分子化合物的含量。
[0081] 本发明在进行银杏二祗内醋葡胺注射液制备原料中大分子化合物的检测时，与上 述银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子化合物的检测方法相同，仅是待测溶液不同，所述银 杏二祗内醋葡胺注射液制备原料中大分子化合物的检测中，W银杏二祗内醋葡胺注射液制 备原料溶液作为待测溶液，所述制备原料溶液为银杏二祗内醋W及葡甲胺的混合溶液。
[0082] 本发明对所述银杏二祗内醋W及葡甲胺的混合溶液的制备方法并没有特殊限制， 本领域技术人员公知的混合溶液配制方法即可。在本发明中，所述银杏二祗内醋W及葡甲 胺的混合溶液中银杏二祗内醋的浓度优选 为2~20mg/ml，在本发明的一些具体实施例中， 所述银杏二祗内醋的浓度为5mg/ml;所述葡甲胺的浓度优选为2~20mg/ml，在本发明的一 些具体实施例中，所述葡甲胺的浓度为5mg/ml。
[0083] 所述银杏二祗内醋W及葡甲胺的混合溶液优选按照如下方法进行配制：
[0084] 取银杏二祗内醋和葡甲胺，精密称定，称量精度为O.OOlg，将所述银杏二祗内醋和 葡甲胺置于同一量瓶内，加水适量，于热水浴内振摇溶解后加水稀释至刻度，摇匀，即得。
[0085] 得到待测溶液后，按照上述银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子化合物的检测方法 进行银杏二祗内醋葡胺注射液制备原料中大分子化合物的检测，在此不做寶述。
[0086] 本发明还可W确定银杏二祗内醋葡胺注射液制备原料中大分子化合物的分子量 大小，该方法与所述银杏二祗内醋葡胺注射液中大分子化合物的分子量大小的测定方法相 同，通过上述方法得到的右旋糖酢分子量对数-保留时间曲线图，并结合银杏二祗内醋葡胺 注射液制备原料的色谱图中大分子化合物的出峰时间，可W确定银杏二祗内醋葡胺注射液 制备原料中大分子化合物的分子量大小。
[0087] 本发明还对银杏二祗内醋葡胺注射液及其制备原料中大分子化合物的检测方法 进行了方法学的考察，主要包括:对照品保留时间及分子量对数的线性关系考察、待测溶液 和对照品溶液的稳定性考察、进样精密度考察、、检测方法的重复性考察、分离度和加样回 收率考察W及检测限考察。本发明对所述稳定性、精密度、重复性的考察方法W及加样回收 率和定量限与检测限的检测方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的考察稳定 性、精密度、重复性的技术方案W及检测加样回收率和定量限与检测限的方法即可。
[0088] 本发明待测溶液的稳定性考察结果说明，本发明提供的方法制备的待测溶液在24 小时内具有良好的稳定性;本发明对照品溶液的稳定性考察结果说明，本发明提供的方法 制备的对照品溶液在24小时内具有良好的稳定性;本发明对照品溶液的精密度考察结果说 明，本发明提供的方法制备的对照品溶液具有良好的精密度;本发明检测方法的重复性考 察结果说明，本发明提供的银杏二祗内醋葡胺注射液及其制备原料中大分子化合物的检测 方法具有良好的重复性;本发明对照品的加样回收率检测结果说明，本发明提供的检测方 法能准确测定银杏二祗内醋葡胺注射液及其制备原料中大分子化合物的含量;本发明对照 品的定量限与检测限检测结果为右旋糖酢分子量D2的定量限为2.01化g、检测限为0.604祉 g。运说明，本发明提供的方法对银杏二祗内醋葡胺注射液及其制备原料中大分子化合物的 测定具有较高的灵敏度。
[0089] 本发明采用体积排阻色谱法对银杏二祗内醋葡胺注射液及其制备原料中大分子 化合物进行检测，检测方法操作简便，灵敏度高、重复性好，各个峰之间有较好的分离度，有 利于计算色谱峰的峰面积。本发明提供的检测方法实现了对银杏二祗内醋葡胺注射液及其 制备原料中大分子化合物的检测。
[0090] 结果表明，本发明提供的银杏二祗内醋葡胺注射液及其制备原料中大分子化合物 的检测方法具有良好的重复性、稳定性和精密度。
[0091] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的银杏二祗内醋葡胺注射 液及其制备原料中大分子化合物的检测方法进行说明，本发明的保护范围不受W下实施例 的限制。
[0092] W下各实施例中，体积排阻色谱的检测仪器采用岛津LC-20AB高效液相色谱仪(配 示差检测器），凝胶柱型号为:Phenomenex Biosep-沈C-S2000，300mmX 7.8mmX 5皿。
[0093] 银杏二祗内醋葡胺注射液选用江苏康缘药业股份有限公司生产的，规格为5ml/ 支，批号分别为 110101、110102、110103、110601、110801、130301、130901、130903、140603、 140604、140605、140606、140607、140608和140609;
[0094] 银杏二祗内醋选用江苏康缘药业股份有限公司生产的批号分别为121101、 121102、121104、110302 和 110401 的银杏二祗内醋；
[00M]葡甲胺选用西安力邦制药有限公司生产的批号为100608B的葡甲胺；
[0096] 对照品：右旋糖酢分子量D1 (分子量2500)、右旋糖酢分子量D2(分子量4600)、右旋 糖酢分子量D3 (分子量7100)、右旋糖酢分子量D4(分子量10000)、右旋糖酢分子量D5 (分子 量21400)?及右旋糖酢分子量D7(分子量84400)均购自中国食品药品检定研究院，批号为 140644-201002。
[0097] 实施例1W0.05mol/L的憐酸盐为流动相
[0098] 1、待测溶液配制：
[0099] (1)取银杏二祗内醋葡胺注射液原液，即得。
[0100] (2)取银杏二祗内醋50mg、葡甲胺50mg，精密称定，置于同一 10ml量瓶内，加水适 量，于热水浴内振摇溶解后加水稀释至刻度，摇匀，即得。
[0101] 2、对照品溶液配制：
[0102] 分别取右旋糖酢分子量Dl(分子量2500)、右旋糖酢分子量D2(分子量4600)、右旋 糖酢分子量D3 (分子量7100)、右旋糖酢分子量D4(分子量10000)、右旋糖酢分子量D5 (分子 量21400)适量，分别加水溶解并制成Img/ml的溶液，作为对照品溶液。
[0103] 3、流动相的配置：
[0104] 将憐酸氨二钢4.2?和二水合憐酸二氨钢4.3始溶于1000ml水中，即得
[0105] 4、试验条件：
[0106] 仪器:岛津LC-20AB高效液相色谱仪(示差检测器）。
[0107] 凝胶柱：Phenomenex Biosep-SEC-S2000，300mm X 7.8mm X 5皿，适用分子量范围 1000Da-300000Da。
[010 引柱溫：30°C。
[0109] 流速:每分钟0.7ml。
[0110] 5、试验方法：
[0111] 精密量取步骤1得到的银杏二祗内醋葡胺注射液及其制备原料溶液各10化，分别 注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1和图2,图1为银杏二祗内醋葡胺注射液的制备原 料在憐酸盐为流动相的条件下的色谱图；图2为银杏二祗内醋葡胺注射液在憐酸盐为流动 相的条件下的色谱图。
[0112] 精密量取5种对照品溶液各10化，分别注入液相色谱仪，考察对照品溶液在憐酸盐 为流动相的条件下的保留时间及回归关系，结果见表1，表1为对照品溶液在憐酸盐为流动 相的条件下的保留时间及回归关系。
[0113] 表1对照品溶液在憐酸盐为流动相的条件下的保留时间及回归关系
[0114]
[0115] 实施例2 W0.05mol/L硫酸钢为流动相
[0116] 1、待测溶液配制：
[0117] (1)取银杏二祗内醋葡胺注射液原液，即得。
[0118] (2)取银杏二祗内醋50mg、葡甲胺50mg，精密称定，置于同一 10ml量瓶内，加水适 量，于热水浴内振摇溶解后加水稀释至刻度，摇匀，即得。
[0119] 2、对照品溶液配制：
[0120] 分别取右旋糖酢分子量Dl(分子量2500)、右旋糖酢分子量D2(分子量4600)、右旋 糖酢分子量D3 (分子量7100)、右旋糖酢分子量D4(分子量10000)、右旋糖酢分子量D5 (分子 量21400)适量，分别加水溶解并制成Img/ml的溶液，作为对照品溶液。
[0121] 3、流动相的配置：
[0122] 将7. Ig硫酸钢溶于1000ml水中，即得
[0123] 4、试验条件：
[0124] 仪器:岛津LC-20AB高效液相色谱仪(示差检测器）。
[01 巧]凝胶柱：Phenomenex Biosep-SEC-S2000，300mm X 7.8mm X 5皿，适用分子量范围 1000Da-300000Da。
[0126] 柱溫:30°C。
[0127] 流速:每分钟0.7ml。
[012引5、试验方法：
[0129] 精密量取步骤1得到的银杏二祗内醋葡胺注射液及其制备原料溶液各10化，分别 注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图3和图4,图3为银杏二祗内醋葡胺注射液的制备原 料在硫酸钢为流动相的条件下的色谱图；图4为银杏二祗内醋葡胺注射液在硫酸钢为流动 相的条件下的色谱图。
[0130] 精密量取5种对照品溶液各10化，分别注入液相色谱仪，考察对照品溶液在硫酸钢 为流动相的条件下的保留时间及回归关系，结果见表2,表2为对照品溶液在硫酸钢为流动 相的条件下的保留时间及回归关系。
[0131] 表1对照品溶液在硫酸钢为 流动相的条件下的保留时间及回归关系
[0132]
[0133]
[0134] 实施例3W对照品的保留时间及分子量对数的线性关系考察
[0135] 称取右旋糖酢分子量Dl(分子量2500)、右旋糖酢分子量D2(分子量4600)、右旋糖 酢分子量D3 (分子量7100)、右旋糖酢分子量D4 (分子量10000)、右旋糖酢分子量D5 (分子量 21400)?及右旋糖酢分子量D7(分子量84400)六种右旋糖酢对照品适量，分别加0.05mol/L 的硫酸钢溶解并制成一定浓度的对照品溶液，即右旋糖酢分子量D10.94mg/ml、右旋糖酢分 子量D21.008mg/ml、右旋糖酢分子量D31.42mg/ml、右旋糖酢分子量D40.92mg/ml、右旋糖酢 分子量D51.21mg/ml、右旋糖酢分子量D71.15mg/ml，精密量取各对照品溶液10μ1，注入高效 液相色谱仪，流动相的配置W及实验条件如实施例2,记录色谱图。具体结果见图5,图5为六 种右旋糖酢对照品的色谱图，图5中，1为右旋糖酢分子量D1的色谱图，2为右旋糖酢分子量 D2的色谱图，3为右旋糖酢分子量D3的色谱图，4为右旋糖酢分子量D4的色谱图，5为右旋糖 酢分子量D5的色谱图，6为右旋糖酢分子量D7的色谱图。对所述试验数据见表3,表3为6种右 旋糖酢分子量对数和保留时间结果。
[0136] 表3右旋糖酢分子量对数和保留时间结果
[0137]
[0138] 通过表3进行右旋糖酢分子量对数-保留时间曲线。W保留时间X(min)为横坐标， 分子量对数Y为纵坐标，绘制分子量对数-保留时间曲线，结果见图6，图6为六种右旋糖酢对 照品的分子量对数-保留时间曲线。得回归方程：Υ = -〇. 2988X^.4493，相关系数R2 = 0 · 9932 〇
[0139] 结果表明：在此色谱条件下，分子量在2500~84400范围，保留时间和分子量的对 数呈现良好的线性关系。
[0140] 实施例4不同流速的考察
[0141] W实施例3提供的试验过程为准，其他条件与实施例3相同，仅改变流动相流速，即 分别 W 流速 〇.51111/111111、0.61111/111111、0.81111/111111，考察右旋糖酢分子量01(分子量2500)、右旋 糖酢分子量D2(分子量4600)、右旋糖酢分子量D3(分子量7100)、右旋糖酢分子量D4(分子量 10000)、右旋糖酢分子量D5(分子量21400)?及右旋糖酢分子量D7(分子量84400)六种右旋 糖酢对照品的线性关系，结果见下表4,表4为在不同的流动相流速条件下右旋糖酢分子量 对数和保留时间结果。
[0142] 表4在不同的流动相流速条件下右旋糖酢分子量对数和保留时间结果
[0143]
[0144] 由表4可 W看出，分别在0.5ml/min、0.6ml/min、0.8ml/min的流速下，Κ〇ι、〇2、〇3、 D4、Ds、D7对照品的保留时间-分子量对数建立的线性方程，线性关系均良好，相关系数r均大 于0.99。
[0145] 实施例5
[0146] W实施例3提供的试验过程为准，其他条件与实施例3相同，仅改变流动相的浓度， 即分别W0.01M硫酸钢和0.1M硫酸钢为流动相，右旋糖酢分子量D1 (分子量2500)、右旋糖酢 分子量D2(分子量4600)、右旋糖酢分子量D3(分子量7100)、右旋糖酢分子量D4(分子量 10000)、右旋糖酢分子量D5(分子量21400)?及右旋糖酢分子量D7(分子量84400)六种右旋 糖酢对照品的线性关系，结果见下表5,表5为在不同的流动相浓度条件下右旋糖酢分子量 对数和保留时间结果。
[0147] 表5在不同的流动相浓度条件下右旋糖酢分子量对数和保留时间结果 [014 引
[0150] 由结果可W看出，在流动相分别为O.OIM硫酸钢和O.IM硫酸钢下，W化、〇2、化、〇4、 〇5、化对照品的保留时间-分子量对数建立的线性方程，线性关系均良好，相关系数r均大于 0 · 99 〇
[0151] 实施例6进样精密度试验
[0152] 选取实施例3中所用的右旋糖酢分子量D2对照品溶液，精密量取10μ1注入液相色 谱仪，连续进样6次，实验条件同实施例3,记录色谱图，考察化保留时间，结果见表6,表6为 右旋糖酢分子量D2的进样精密度考察结果。
[0153] 表6右旋糖酢分子量D2的进样精密度考察结果
[0154]
[0Κ5]结果表明:连续进样6次，RSD小于2.0%，表明在此条件下进样精密度良好。
[0156] 实施例7溶液稳定性试验
[0157] 1成品供试品溶液稳定性考察
[0158] 取110101批银杏二祗内醋葡胺注射液原液作为成品供试品溶液，于化、9h、13.5h、 1她、24h，精密量取成品供试品溶液10μ1，注入液相色谱仪，实验条件同实施例3,记录色谱 图，考察主峰保留时间和峰面积，结果见表7,表7为成品供试品溶液稳定性结果。
[0159] 表7成品供试品溶液稳定性结果
[0160]
[0161] 结果表明：成品供试品溶液色谱峰保留时间和峰面积的RSD均小于2%，故在24小 时内溶液稳定良好。
[0162] 2原料供试品溶液稳定性考察
[0163] 取银杏二祗内醋50mg、葡甲胺50mg，精密称定，置于同一10ml量瓶内，加水适量，于 热水浴内振摇溶解后加水稀释至刻度，摇匀，作为原料供试品溶液，于化、2h、化、她、12h、 16h，精密量取原料供试品溶液10μ1，注入液相色谱仪，实验条件同实施例3,记录色谱图，考 察保留时间，结果见表8,表8为原料供试品溶液稳定性结果。
[0164] 表8原料供试品溶液稳定性结果
[01 化]
[0166] 结果表明：原料供试品溶液色谱峰保留时间和峰面积的RSD均小于2%，故在16小 时内溶液稳定性良好。
[0167] 3对照品溶液稳定性考察
[0168] 取实施例3中所用的右旋糖酢分子量D2溶液为对照品溶液。分别于化、化、化、地、 化、她，精密量取供试品溶液、对照溶液各10μ1，分别注入液相色谱仪，实验条件同实施例3， 记录色谱图，考察保留时间，结果见表9。
[0169] 表9右旋糖酢分子量D2对照品溶液稳定性结果 [01701
[0171] 结果表明：对照品溶液的保留时间在化内无明显变化，但峰面积在化后明显增加， 故最好在化内完成进样测定。
[0172] 实施例8重复性考察
[0173] 1成品重复性考察
[0174] 取银杏二祗内醋葡胺注射液原液作为供试品溶液，平行制备供试品6份。精密量取 供试品溶液?〇μ1注入液相色谱仪，实验条件同实施例3,记录色谱图，计算大分子物质和聚 合物含量，考察主峰保留时间，结果见表10。
[01巧]表10成品重复性考察结果
[0176]
[0177] 结果表明：本品平行测定6份，均未检出分子量大于4600的大分子物质和聚合物， 供试品溶液主峰的保留时间的RSD均小于2%，本测定方法重复性良好。
[0178] 2原料重复性考察
[0179] 取银杏二祗内醋50mg、葡甲胺50mg，精密称定，置于同一10ml量瓶内，加水适量，于 热水浴内振摇溶解后加水稀释至刻度，摇匀，作为原料供试品溶液，平行制备供试品6份。精 密量取供试品溶液?〇μ1注入液相色谱仪，实验条件同实施例3,记录色谱图，计算大分子物 质和聚合物含量，考察主峰保留时间，结果见表11。
[0180] 表11原料重复性考察结果
[0181]
[0182] 结果表明：本品平行测定6份，均未检出分子量大于4600的大分子物质和聚合物， 供试品溶液色谱峰保留时间的RSD均小于2%，本测定方法重复性良好。
[0183] 实施例9分离度和加样回收率考察
[0184] 1成品分离度和加样回收率考察
[0185] 精密量取右旋糖酢分子量化对照品适量，用银杏二祗内醋葡胺注射液溶解并制成 每毫升含〇.2mg右旋糖酢分子量化的溶液作为供试品溶液，平行制备供试品6份，分别记为 样1~样6。精密量取供试品溶液10μ1注入液相色谱仪，实验条件同实施例3,记录色谱图，考 察右旋糖酢分子量化与邻近峰的分离度及加样回收率。结果见表12。
[0186] 表12成品分离度和加样回收率考察结果
[0187]
[0188] 结果表明：本品平行测定6份，右旋糖酢化与邻近峰的分离度均大于1.5,平均回收 率为97.2%，RSD小于2%，回收率良好，该色谱条件可W满足测定要求。
[0189] 2原料分离度和加样回收率考察
[0190] 取银杏二祗内醋50mg、葡甲胺50mg、右旋糖酢分子量化约 2mg，精密称定，置于同一 10ml量瓶内，加水适量，于热水浴内振摇溶解后加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，平 行制备供试品6份，分别记为样1~样6。精密量取供试品溶液10μ1注入液相色谱仪，实验条 件同实施例3,记录色谱图，考察化与邻近峰的分离度及加样回收率。结果见表13。
[0191] 表13原料分离度和加样回收率考察结果
[0192]
[0194] 结果表明：本品平行测定6份，右旋糖酢分子量化与邻近峰的分离度均不低于1.5， 平均回收率为96.8%，RSD小于2%，回收率良好，该色谱条件可W满足测定要求。
[01M]实施例10检测限考察
[0196] 精密量实施例3提供的右旋糖酢分子量化对照品溶液1ml，加0.05mol/L的硫酸钢 流动相稀释至10ml，摇匀，精密量取此溶液扣1、化1、化1、祉1、10μ1，依次注入液相色谱仪， 记录色谱图。结果见表14和图7,表14为检出限考察结果，图7为右旋糖酢分子量D2检测线考 察色谱图。
[0197] 表14检出限考察结果 [019 引
[0199] 结果表明：当进样量为0.604祉g时，信噪比约为3，故检测限为0.06048mg/ml，进样 10μ1(0.604祉邑）。
[0200] 实施例11银杏二祗内醋葡胺注射液及其制备原料中大分子化合物的检测
[0201] 1银杏二祗内醋葡胺注射液大分子、聚合物测定方法--W右旋糖酢D2为对照
[0202] 色谱条件与系统适用性试验：
[0203] 色谱柱：Phenomenex Bios邱-沈C-S2000(300mmX7.8mm);
[0204] W〇.〇5mol/L硫酸钢为流动相；
[02化]流速为每分钟0.7ml;
[0206]柱溫30°C;示差检测器。
[0207] 理论板数按右旋糖酢D2计算应不低于3000。
[0208] 供试品溶液制备取银杏二祗内醋葡胺注射液原液，即得。
[0209] 对照品溶液制备取右旋糖酢分子量D2对照品适量，精密称定，加0.05mol/L的硫酸 钢流动相溶解并稀释制成每1ml中约含Img的溶液，即得。
[0210] 测定仿法：
[0211] 精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μ1注入液相色谱仪，记录色谱图，将先于 右旋糖酢分子量D2(分子量4600)出峰时间的峰视为大分子物质或聚合物，按面积归一化法 计算其量。
[0212] 按上述大分子物质和聚合物测定方法对批号为110101、110102、110103、110601、 110801、130301、130901、130903、140603、140604、140605、140606、140607、140608、140609 十五批银杏二祗内醋葡胺注射液进行大分子物质和聚合物测定，结果：WD2为对照测定，十 四批银杏二祗内醋葡胺注射液均未检出分子量大于4600的大分子物质或聚合物。具体结果 见图8~图22。
[0213] 2银杏二祗内醋原料大分子、聚合物测定方法--W右旋糖酢D2为对照品
[0214] 色谱条件与系统适用性试验：
[0215] 色谱柱：Phenomenex Bios邱-沈C-S2000(300mmX7.8mm)示差检测器；
[0216] W〇.〇5mol/L硫酸钢为流动相；
[0217] 流速为每分钟0.7ml; 脚8] 柱溫30。。
[0219] 理论板数按右旋糖酢D2计算应不低于3000。
[0220] 供试品溶液制备：取银杏二祗内醋50mg、葡甲胺50mg，精密称定，置于同一 10ml量 瓶内，加水适量，于热水浴内振摇溶解后加水稀释至刻度，摇匀，即得。
[0221] 对照品溶液制备：取右旋糖酢分子量D2对照品适量，精密称定，加0.05mol/L的硫 酸钢流动相溶解并稀释制成每1ml中约含Img的溶液，即得。
[0222] 测定方法：
[0223] 精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μ1注入液相色谱仪，记录色谱图，将先于 右旋糖酢分子量D2(分子量4600)出峰时间的峰视为大分子物质或聚合物，按面积归一化法 计算其量。
[0224] 按上述大分子物质和聚合物测定方法对批号为121101、121102、121104、110302、 110401五批银杏二祗内醋进行大分子物质和聚合物测定，结果：WD2为对照测定，五批银杏 二祗内醋均未检出分子量大于4600的大分子物质或聚合物。结果见图23~图27。
[0225] 本研究选用6种右旋糖酢分别作为参照物进行研究，建立了银杏二祗内醋葡胺注 射液成品和原料的大分子物质和聚合物测定方法，示差检测器为通用型检测器，对多数物 质均有响应，可W较好的检测大分子物质或聚合物。本实验采用峰面积归一化法计算大分 子物质和聚合物含量，对14批成品、5批原料进行检测，结果均未检出大分子物质或聚合物。
[0226] 本研究建立了银杏二祗内醋葡胺注射液大分子物质和聚合物检测方法，通过重复 性、分离度、加样回收、检出限、精密度、分子量对数-保留时间曲线、溶液稳定性考察，证明 本方法操作简便、灵敏度高、重复性好，可用于中药注射液工艺过程质量控制。
[0227] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可w做出若干改进和润饰，运些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种银杏二萜内酯葡胺注射液中大分子化合物的检测方法，其特征在于，包括以下 步骤： A) 以银杏二萜内酯葡胺注射液作为待测溶液，以分子量为4600的右旋糖酐溶液作为对 照品溶液;将待测溶液以及对照品溶液分别进行体积排阻色谱检测，得到待测溶液色谱图 以及对照品溶液色谱图；所述体积排阻色谱的流动相为硫酸钠溶液或磷酸盐溶液，流速为 0.5~0.8ml/min; B) 将待测溶液色谱图以及对照品溶液色谱图进行比对，采用面积归一化法得到所述大 分子化合物的含量。2. -种银杏二萜内酯葡胺注射液制备原料中大分子化合物的检测方法，其特征在于， 包括以下步骤： A) 以银杏二萜内酯葡胺注射液制备原料溶液作为待测溶液，所述制备原料溶液为银杏 二萜内酯以及葡甲胺的混合溶液；以分子量为4600的右旋糖酐溶液作为对照品溶液;将待 测溶液以及对照品溶液分别进行体积排阻色谱检测，得到待测溶液色谱图以及对照品溶液 色谱图；所述体积排阻色谱的流动相为硫酸钠溶液或磷酸盐溶液，流速为〇. 5~0.8ml/min; B) 将待测溶液色谱图以及对照品溶液色谱图进行比对，采用面积归一化法得到所述大 分子化合物的含量。3. 根据权利要求1或权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述流动相为硫酸钠溶 液，所述硫酸钠溶液的浓度为〇. 01~〇.lmol/L。4. 根据权利要求1或权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述对照品还包括分子 量分别为2500、7100、10000、21400以及84400的右旋糖酐中的一种或多种。5. 根据权利要求1或权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述银杏二萜内酯以及 葡甲胺的混合溶液中银杏二萜内酯的浓度为2-20mg/ml，葡甲胺的浓度为2-20mg/ml。6. 根据权利要求1或权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述对照品溶液的浓度 为0·5_5mg/ml〇7. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述分子量分别为2500、7100、10000、 21400以及84400的右旋糖酐的溶液浓度均为0.5-5mg/ml。8. 根据权利要求1或权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述体积排阻色谱的检 测器为示差检测器。9. 根据权利要求1或权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述体积排阻色谱的色 谱柱为PhenomenexBiosep-SEC_S2000色谱柱。10. 根据权利要求1或权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述体积排阻色谱检测 的柱温为25~35°C。
【专利摘要】本发明采用体积排阻色谱法对银杏二萜内酯葡胺注射液及其制备原料中大分子化合物进行检测，检测方法操作简便，灵敏度高、重复性好，各个峰之间有较好的分离度，有利于计算色谱峰的峰面积。本发明提供的检测方法实现了对银杏二萜内酯葡胺注射液及其制备原料中大分子化合物的检测。结果表明，本发明提供的银杏二萜内酯葡胺注射液及其制备原料中大分子化合物的检测方法具有良好的重复性、稳定性和精密度。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/88
【公开号】CN105486792
【申请号】CN201510822358
【发明人】萧伟, 王雪, 张伟, 李家春, 黄文哲, 王振中
【申请人】江苏康缘药业股份有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年11月23日
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