一种用于检测样品中重金属离子砷含量的免疫试剂盒的制作方法
一种用于检测样品中重金属离子砷含量的免疫试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于检测重金属离子神离子的单克隆抗体及酶联免疫试剂盒。
【背景技术】
[0002] ±壤和农产品中的重金属与人类健康密切相关。重金属污染主要指生物毒性显著 地隶、館、領、铅W及类金属神，还包括具有毒性的重金属铜、钻、媒、锡等污染物。随 着城市的扩大和大规模工业的发展，大最重金属进入环境后，即使浓度很低，也可能造成危 害，通过饮用水，或者通过生物富集W及食物链等方式最终威胁入体健康。承金属污染不同 于其他类型污染，具有隐蔽性、长期性和不可逆转性等特点。
[0003] 神的污染，主要来自排放的废水。焦炭、含神黄铁矿床、及其它金属矿场的冲出物； 玻璃器皿制造、木材防腐剂、陶瓷制造业、冶金工业、制革厂、纺织业、染料厂、炼油工业、稀 ±金属工业等都可能排放出含神废水。若此含神废水流入河流中或湖泊中，不仅危害到水 中动植物，亦可能渗透到±壤中，而危害到陆生的动植物。工业上的神污染，也是造成人体 神中毒的祸首。因此，神离子污染已对人类健康构成了严重威胁，建市快速、简便、敏感、特 异、经济、筛检量大的离子锋离子免疫检测技术，对了减少环境污染、提高食品质量、保障食 品安全具有重要意义。
[0004] 所W，痕量重金属的定量分折在食品和环境检测等方而都是非常重要的。传统的 重金属离子检测法如无火焰原子吸收光谱法、火焰原子吸收光谱法、电感禪合等离子体质 谱浊、伏安法和离了色谱浊，W及电热原了化原了吸收光谱法等，偷测必须在只各大型分析 仪器的重点实验室内进行，无法用于现场检测，且受到费用高、处理量有限和检测时间长等 限制，郁小利于在生产中推广应用，难W适必环境及市场产品的现场抽查及产品进口快速 通关的要求；免疫学检测方法只有快速、廉价、灵敏和特异性强的优点，可同时完成高通量 样品的检测，建立免疫分析法检测神离子是生产及经济发展的需要。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的：针对现有检测技术的不足和缺陷，制备出抗神离子莖合物的高亲 和力、特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，W此为基础提供一种用于检测神离子含量的酶 联免疫试剂盒，能够快速、简便、敏感、特异的检测食品、茶叶、饲料、饮料、±壤、水、动物组 织等样品中的神离子的含量。
[0006] 所述的检测神离子的酶联免疫试剂盒，包括96孔或48孔酶标板、最佳工作浓度的 sn3++mAb或pAb、最佳工作浓度的RaMIgG-HRP或GaMIgG-HRP、底物显色剂A、底物显色剂B、 As3+-DTPA-0VA或As3+-DTPA-BSA包被并封闭好的酶标板、终止液，sn 3+莖合物配置的标准品 稀释液1~9,洗液（PBST)。
[0007] 所述的检测神离子的酶联免疫试剂盒，用眼观或酶标仪获取结果，并根据结果绘 制标准曲线，添加回归方程式，根据回归方程式分析计算所检测样品中的神离子含量，对神 离子进行痕量分析。
[0008] 所述的检测神离子的酶联免疫试剂盒，所用的神离子标准品为神离子与邸ΤΑ的 莖合物，莖合物中神离子含量采用石墨炉原子吸收光谱法检测获得莖合物半抗原中Sn的 含量。
[0009] 所述单克隆抗体或多克隆抗体的制备方法为： A1、双功能整合剂的选择：对氨基苯基-二己Η胺五己酸（P-N肥-Bn-DTPA)，双功能莖 合剂1- (4-异硫氯根苯基）-己二胺四己酸（ITCB巧，2- (4-异硫氯根苯基-1，4, 7,10-四氮 环十二焼四盐酸盐（P-SCN-Bn-DOTA)，然后在碱性或酸性环境下，将离子神离子莖合在双功 能莖合剂上； A2、sn3M)TPA-载体蛋白人工抗原的合成；分别称取鸡卵清白蛋白（0VA)，牛血清白蛋 白度SA)和血藍蛋白化LH) 20mg溶于1血浓度为10mmoL/L，pH9. 0的N-2-居己基脈嗦-N-己 礙酸缓冲液（皿巧中形成KLH、BSA、OVA溶液。称取lOmg金属藝合剂对氨基苯基-二己 Η胺五己酸（P-N肥-Bn-DTPA)溶于1血二甲基亚讽（DMS0)中形成金属藝合剂溶液；分别 取lOOuL金属藝合剂溶液轻轻揽拌下逐滴滴加到0. 5mLKLH和BSA溶液中，用lOmol/LKOH 调节抑至9. 0,室温下反应2地。制备出神离子人工抗原sn3M)TPA-0VA，sn3M)TPA-BSA， sn3+-DTPA-KLH，-20°C保存备用。
[0010] A3、神离子单克隆抗体和多克隆抗体的获得；用sn3M)TPA-BSA，sn3+-DTPA-KLH免 疫6周雌性BALB/C小鼠5只，剂量为25 ug/0. 2mL/只，背部皮下分点注射。采用细胞融合 技术制备抗神离子莖合物的单克隆抗体。无菌条件下取免疫鼠脾脏细胞，在聚己二醇PEG-1 500作用下与NS。骨髓瘤细胞进行融合；用间接化I SA法测定细胞上清抗体效价，用阻断 ELI SA法测定上清抗体抑制率，进行阳性孔筛选，用经GF-AAS检测获得sn3+-藝合剂做神 离子标准液，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行亚克隆和扩大培养、通过鉴定， 获得一株杂交瘤细胞株；之后采用体内诱生腹水法制备sn3+mAb ; 多抗制备：用sn3M)TPA-BSA，sn3M)TPA-KLH人工抗原免疫新西兰大白兔，免疫剂量为 50ug~100 ug/次，背部皮下分多点注射或足底注射；首免用弗氏完全佐剂乳化；加强免疫 用弗氏不完全佐剂乳化，连续免疫5次，每次间隔8周，最后一次免疫后10~15天，W ELISA 法测其定效价达到1〇5 W上时，采血并分离收集高免血清。W饱和硫酸倭盐析法提取IgG抗 体，-2(TC冻存备用。
[0011] 本发明的检测神离子酶联免疫试剂盒具有下列各项优点： ①特异性强，敏感性高。该检测神离子酶联免疫试剂盒W高亲和力的单克隆抗体（mAb) 或多克隆抗体（pAb)为基础制备而成。酶联免疫试剂盒采用的是非均相间接竞争模式，其 基本原理是样品中的sn3+与过量藝合剂藝合成可溶性的sn 3+-藝合剂复合物后，将其与已包 被于酶标板上的包被抗原sn3+-藝合剂-载体蛋白复合物共同竞争sn 3+mAb上有限的结合位 点，反应达到平衡后洗脱多余的sn3+-藝合剂和sn3+mAb，然后与酶标二抗反应，用酶及其底 物显色系统显示抗原抗体的结合情况，进而定量检测sn3+在样品中的含量。该试剂盒最低 检测限为0. 248 ug/l，检测范围为3. 774~442. 39 ug/l，与其它金属离子交叉反应较小。
[0012] ②简便、快速、时效性强。使用该检测神离子酶联免疫试剂盒，无需其它试剂和仪 器，可现场操作，只要按照该试剂盒说明书上操作步骤进行检测，60分钟内即可判定检测结 果，并根据结果可计算样品中神离子含量。
[0013] ⑨结果显示直观、形象、准确。酶联免疫试剂盒固相上的酶量与标本中受检物质的 量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。显色液和 底物不同显示不同颜色，本试剂盒底物为过氧化脈，显色剂为四甲基联苯胺（TMB)，终止液 为2mol/L的硫酸溶液，故显示藍色，终止后显色为黄色，肉眼可见。与所提供的标准检测液 比较，显色越深则待测物中神离子含量越低或不含，显色越淡或不显色者说明样品中含有 待检物，且含量越高，如有酶标仪可进行度数，度数后根据稀释比例进行计算可得出神离子 的含量。
[0014] ④适用范围广，节省费用，便于推广。使用酶联免疫试剂盒，比用仪器分析的费用 大幅下降。另外，酶联免疫试剂盒的适用范围广，可满足不同层次人员需要，包括专业检验， 海关检疫，卫生检疫，质量监测，加工企业和养殖场户等，便于推广应用，具有广阔的市场前 景和明显的经济、社会效益。
【附图说明】
[0015] 图1为检测神离子酶联免疫试剂盒的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0016] 一种用于检测神离子酶联免疫试剂盒，它包括检测酶标板、用于检测的试剂，其中 试剂包括样品稀释液，样品提取液。重金属离子免疫检测的关键在于重金属特异性单克隆 抗体的制备，重金属特异性单克隆抗体制备的关键又在于重金属免疫原。由于重金属离子 带有电荷，能与动物体内生物分子发生强烈的不可逆的反应，导致动物中毒。因此，可利用 特异性的双功能莖合剂莖合重金属离子，形成能被动物免疫系统识别的金属一莖合剂的复 合物，但送些重金属-莖合剂复合物是分子量低于IkD的半抗原，免疫原性低，不足W引起 免疫反应，还需将之与载体蛋白偶联，才能形成完整的免疫原。要制成神离子酶联免疫试剂 盒，首先需要对重金属离子神离子与双功能莖合剂进行莖合反应，制备神离子莖合物偶联 载体蛋白，用于制各相应的检测抗体。
[0017] 本发明还包括食品、饲料、饮料、±壤、动物组织等样品预处理方法。饲料、动物 组织±壤等固体样品，研磨捣碎后称取1. Og样品，加入10血肥阳S缓冲液，揽拌30min， 300化/min离必5min，在上清液中加入30mg邸TA，并用化OH溶液调抑至6. 0,室温反应 过夜；市场购买的饮料、自来水等液体样品，取lOmL样品，加入30mg邸TA，用化0H溶液调 抑至6. 0,室温反应过夜，反应后待检。
[0018] 本发明的检测神离子酶联免疫试剂盒，样品处理简单，适合于大量样品的快速检 测和筛选，具有高特异性、高灵敏度、高精确率等特点，最低检测限 为0. 248 11旨/1，检测范围 为 3. 774 ~442. 39ug/L。
[0019] W下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0020] 实施例1、神离子莖合物、多克隆、单克隆抗体的制备 1. 1神离子整合物的合成与鉴定 称取lOOmg纯度为99. 99%的氯化神溶于100 U L纯度为优级的浓硝酸，待充分溶解 加超纯水使终体积为1血，形成浓度为733. 7mmoL/L神溶液。称取lOmg邸TA溶于lOmMHBS 缓冲液配制成浓度为34. 2mmoL/L邸ΤΑ溶液。将两者混匀后，用化OH调节抑值为6. 0,室 温摇床反应24小时，即形成sn3+-EDTA藝合物溶液。
[002d 将100 mg/mL的sn3+标准储备液用2%的硝酸稀释成ο ug/血、0. 25 u 9 /血、 0. 5ug/mL、l ug/mL、2 ug/mL、4 ug/mL的浓度梯度，仪器软件自动绘制标准曲线，并得出线 性回归方程；样品溶液50倍稀释，用226nm波长在最佳优化实验条件下进行测定，仪器软件 自动分析结果。计算出所整合物种的神离子含量。
[0022] 1. 2神离子人工抗原的合成与鉴定 分别称取20mg KLH和BSA溶于1血浓度为lOmmoL/L，抑9. 0的N-2-居己基脈嗦-N-己 礙酸缓冲液（皿巧中形成KLH、BSA溶液。
[0023] 称取Img金属藝合剂对氨基苯基-二己Η胺五己酸（P-NH2-Bn-DTPA)溶于1血二 甲基亚讽（DMS0)中形成金属藝合剂溶液；分别取160UL金属藝合剂溶液轻轻揽拌下逐滴滴 加到ImLKLH和BSA溶液中，用lOmol/L化0H调节抑至9.0,室温下反应2地。反应产物用 30Kd的超滤管纯化，超滤管内加入反应产物超滤，超滤管内先用lOmmoL/L，抑9. 0皿S冲洗3 次，再用lOmmoL/L，抑7. 4的皿S缓冲液洗2次，除去其中未反应的小分子金属藝合剂。
[0024] 取16 U L浓度为733. 7mmoL/L神溶液滴加到已反应过的载体蛋白溶液中，用用 化0H调节抑值至9. 0,室温摇床反应24小时，然后移入透析袋中透析5天。所得产物即分 别为纯化的神离子藝合后的人工抗原；sn3M)TPA-BSA，sn3+-DTPA-KLH。用蛋白核酸分析仪 在280nm波长下测定人工抗原中的蛋白浓度。
[00巧]同法制得包被抗原sn3M)TPA-0VA。
[002引1. 3神离子单克隆抗体（sn3+mAb)和多克隆抗体（sn3+pAb)的获得 用sn3+-DTPA-BSA，sn3+-DTPA-KLH分别免疫6周雌性BALB/C小鼠5只，剂量为20 ug/0. 2mL /只，背部皮下分点注射。义用细胞融合技术，在PEG-1500作用下与NS。骨髓瘤 细胞进行融合；用间接化ISA和阻断化ISA进行阳性孔筛选，筛选后进行有限稀释克隆化， 扩大培养、冻存并鉴定，获得杂交瘤细胞株。采用体内诱生腹水法制备sn3+mAb。用蛋白核 酸分析仪在280nm波长下测定所获抗体的IgG含量。计算该单抗亲和力常数。
[0027] 多抗制备：用sn3+-DTPA-BSA，sn3+-DTPA-KLH分别免疫新西兰白兔，免疫剂量为50 ug~100 ug/次，背部皮下分多点注射。首免，加等量弗氏完全佐剂（FCA)乳化；加强免疫， 加等量弗氏不完全佐剂（FIA)乳化，连续免疫5次，每次间隔8周，最后一次免疫后10~15 天，W间接化TSA法测其定效价达到1 ;105 W上时，采血并分离收集高免血清W饱和硫酸倭 盐析法提取IgG抗体，-2(TC冻存备用。
[002引实施例2、神离子检测酶联免疫试剂盒的制备 2. 1酶联免疫试剂盒检测反应原理 免疫学检测即是根据抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用 已知的抗体检测未知的抗原。酶联免疫试剂盒选用合适浓度的包被抗原包被酶标板，将待 测己处理后的样品按要求取用和提供的多克隆或单克隆抗体结合反应，未完全结合的抗体 与酶标板上的位点结合，通过辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠或兔抗鼠二抗结合反应，通过 显色体现显色，观察结果，或用酶标仪读数，根据结果计算待测物的含量。结果的判断同所 提供的阴性、阳性对照比较，如显色深浅同阴性对照完全相同，则视为阴性，即为不含待测 物；如显色较弱，或是不显色则为阳性或弱阳性，即为含有待测物。如空白对照显色，或阴性 对照不显色则视为无效。
[0029] 2. 2神离子检测酶联免疫试剂盒的制备 (1)待标神离子mAb或pAb的工作浓度将待标离子神离子mAb或pAb溶液1000化pm离 >1_ι、30πι;?η,除去杂质。义用方阵法师选确志贸子神贸子mhb或pAb的工作浓度。用不问浓度 的包被抗原包被，测出包被原最佳包被浓度和最佳抗体浓度。本试剂盒最佳包被浓度即用 sn3+-DTPA-BSA包被，蛋白质浓度为0. 05mg/mL ;神离子ml·*的工作浓度为1 ;3. 2X 105 ;神 离子pAb的工作浓度为1 ;5. 2X 1〇5。
[0030] (2)神离子检测酶联免疫试剂盒标准品的制备称取10m姐DTA溶于lOmM皿S缓 冲液配制成浓度为34. 2mmoL/L邸TA溶液，将sn3+标准储备液稀释成0ug/mL、3. 906ug/ mL、7. 812ug/mL、15. 625ug/mL、31. 25ug/mL、62. 5ug/mL、125ug/mL、250ug/mL、500ug/mL、 lOOOug/mL的浓度梯度，用化OH调节抑值为6. 0,室温摇床反应24小时，即形成sn3+-邸TA 藝合物溶液。将1〇〇雌/11^的3]13+标准储备液用2%的硝酸稀释成〇11旨/1]^、0.25 11旨/血、 0. 5 ug/mL、l ug/mL、2 ug/mL、4 ug/mL的浓度梯度，仪器软件自动绘制标准曲线，并得出线 性回归方程；样品溶液50倍稀释，用226nm波长在最佳优化实验条件下进行测定，仪器软件 自动分析结果。
[0031] (3)神离子检测酶联免疫试剂盒的组装神离子残留与含量的酶联免疫试剂盒， 标准配置包括C1号液（最佳工作浓度的sn3+mAb)，C2号液（最佳工作浓度的RaMIgG- HRP)，C3号液（底物显色剂A)，C4号液（底物显色剂B)，sn3+-DTPA-BSA包被并封闭好的 8 X 12 (96孔）或酶8 X 12 (48孔）酶标板，巧号液（终止液），sn3+标准品稀释液1~9， 洗液（PBST)。洗液为0. 0 Imol/L、抑7. 4的磯酸盐缓冲液含0. 05% Tween-20(PBST)，底物 显色剂A为过氧化脈，底物显色剂B为四甲基联苯胺灯N3)，终止液为2moL/L的硫酸溶液。
[0032] (4)神离子酶联免疫试剂盒操作步骤 A1、样品前处理方法：用0.1mol / L邸TA溶液处理样品，离必取上清液用于检测。 [003引 A2、检测步骤： 第一步，除第一排最后两孔分别为阴性对照和空白对照外，每孔加入50 U L工作浓度 的C1号液sn3+mAb，同时加入等体积sn3+-邸TA藝合物标准液，其他孔根据检测要求加入50 U L已处理的待检样品和等体积工作浓度的C1号液sn3+mAb，混匀后37°C温育15min，反应 后用PBST洗板； 第二步，每孔加入50 U L工作浓度的RaRIgG-HRP，37°C温育25min，PBST洗板； 第Η步，每孔加入100 U L的酶底物A、B混合液显色，室温反应5min，每孔加入100 U L终止液，用酶标仪读A45。值，记录结果。
[0034] 如检测样品的显色未在标准品的显色范围内，可根据情况加倍稀释后重新检测， 计算结果时乘W稀释倍数。
[0035] A3、分析检测结果：将第一排的标准液显色的0D值进行数据处理，得出回归方程 式，然后将待测物的0D值放入标准曲线的回归方程式中进行计算，乘W稀释倍数后得出待 测样品中神离子的含量。
[0036] (5)神离子酶联免疫试剂盒标准曲线阻断ELISA测定单克隆抗体对不同浓度Sn标 准品的抑制率，W抑制率B/B。％度是sn 3+不同标准浓度的A4日。值，B。是sn3+0 ug/L的标准浓 度的A4印值）为纵坐标，W不同标准品浓度的对数值为横坐标，在半对数坐标纸上绘制标 准曲线，推导回归方程，进行回归分析。线性的回归方程为Υ=-33. 827X+99. 512，R2=0. 9891， IC5。为29. 08 u 9 / L。标准曲线见附图1。
[0037] 实施例3、神离子酶联免疫试剂盒的性能 3. 1灵敏性测定按照阻断化ISA最低检测限为B/B。％ =120%的方法，根据曲线回归方 程计算出试剂盒的灵敏度，确定检测限。测定结果，检测限为0.248 ug/L。根据阻断化ISA 所得结果中B/B。％ =10%~90%为检测范围，根据曲线回归方程计算出试剂盒的检测范围 为 3. 774 ~442. 39 ug/L。
[0038] 3. 2准确性测定将sn3+标准品W终浓度分别为5、10、20、40ug/L添加到±壤、自来 水和猪肉中，设6个重复，W回收率和变异系数（CV)确定其准确度。结果见表2。±壤的回收 率在84. 15%~87. 6%，平均85. 36%，变异系数（CV)在6. 05%~13. 09%;自来水的回收 率在76. 7%~88. 3%，平均81 . 43%，CV在10. 76%~12. 87%;猪肉的回收率在80. 2%~ 85. 4%，平均82. 76%，CV在12. 59%~15. 94%。平均CV小于15%，表明试剂盒具有较高 准确度。见表1。
[0039] 表1神离子酶联免疫试剂盒添加回收试验（n=6)
3. 3特异性测定采用交叉反应试验，选择隶、铅、領、铜、館、钻、铁等金属离子与邸ΤΑ的 莖合物、邸ΤΑ、口CBE、D0TA、DTPA为抑制物，用阻断ELISA测定各抑制物的ICs。，W sn3+mAb 对sn3+的ICw和对其它各竞争物的ICw的百分率为其交叉反应率（CR% )。见表2。
[0040] 表2 Sn3+-EDTA mAb与其它金属莖合物的交叉反应
3. 4稳定性；取同一批次的试剂盒保存于4(TC，测定保存6个月中各月份的A45。值、 ICw、R2变化情况，确定其稳定性。见表3 表3剂盒的保存期_
实施例4、神离子酶联免疫试剂盒的应用 4. 1固体样品的提取（饲料、动物组织、±壤等） 取组织（鸡肉、兔肉、饲料等）均质物1. 09,研磨捣碎后加入过量的已稀释的邸TA溶液 混匀，用化OH调节抑值为6. 0,室温摇床反应24小时，即形成sn3+-EDTA藝合物溶液。
[0041] 液体样品的提取不需研磨可直接加入邸TA溶液混匀进行莖合，用于检测。
[0042] 4. 2检测操作方法 第一步，除第一排最后两孔分别为阴性对照和空白对照外，每孔加入50 U L工作浓度 的C1号液sn3+mAb，同时加入等体积不同浓度的神离子标准液，其他孔根据检测要求加入50 U L已处理的待检样品和等体积工作浓度的C1号液sn3+mAb，混匀后37°C温育15min，反应 后用PBST洗板； 第二步，每孔加入50 U L工作浓度的RaRIgG-HRP，37°C温育25min，PBST洗板； 第Η步，每孔加入1 00 U L的酶底物A、B混合液显色，室温反应5min，每孔加入100 U L终止液，用酶标仪读A460值，记录结果。
[0043] 将获得的第一排的神离子标准液的0D值按照公式，绘出标准曲线图，并添加的回 归方程，待检物的0D值按照回归方程进行计算，乘W取样时的稀释倍数得出待测样品中神 离子的含量。如果没有酶标仪进行度数的，可根据肉眼观察判断结果，判断方法是观察待测 物的显色深浅与试剂盒提供的神离子标准液的显色进行比较，相近颜色的神离子标准液的 浓度可大概判定为该待测物的神离子含量，结果乘W取样时的稀释倍数即为该待检样中的 神离子的含量。
[0044] W上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何 不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的 保护范围应该W权利要求书所限定的保护范围为准。
【主权项】
1. 一种用于检测食品、饮料、茶叶、土壤、动物组织等样品中的砷离子残留与含量的酶 联免疫试剂盒。2. 根据权利要求1所述砷离子酶联免疫试剂盒，其特征在于：包括包被As3+-D0TA-BSA 或As3+-D0TA-0VA并封闭好的96孔或48孔酶标板，以As3+-D0TA-BSA或As3+-D0TA-0VA为抗 原制备的砷离子多克隆或单克隆抗体As3++mAb或pAb，酶标二抗为兔抗鼠或羊抗鼠抗体标 记辣根过氧化物酶RaMIgG-HRP或GaMIgG-HRP，sn3+螯合物配置的标准品稀释液，洗液为 0·Olmol/L、ρΗ7· 4的磷酸盐缓冲液含0· 05%Tween-20 (PBST)，底物显色剂A为过氧化脲， 底物显色剂B为四甲基联苯胺（TMB)，终止液为2mol/L的硫酸溶液。3. 根据权利要求1、2所述的砷离子酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的酶联免疫试 剂盒由以下步骤制备： (1) 包被：酶标板上用sn3+-DTPA-BSA包被； (2) 封闭；采用浓度为0. 05%的猪血清进行封闭； (3) 单克隆抗体的制备：用As3+-D0TA-KLH和As3+-D0TA-BSA分别免疫6周龄雌性BALB/ C小鼠；采用细胞融合技术无菌取脾脏制备脾细胞，在聚乙二醇-1500作用下与NS。骨髓瘤 细胞进行融合：用间接ELISA法和阻断ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细 胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，扩大培养、冻存并鉴定，获得一株杂交瘤细胞株；之 后采用体内诱生腹水法制备抗砷离子螯合物的mAb; (4)EDTA反应液的配制：称取10mgEDTA溶于10mMHBS缓冲液配制成浓度为34. 2mm〇L/ LEDTA溶液； (5)As3+标准溶液的配制：称取lOOmg氯化砷溶于100uL浓硝酸，待充分溶解加超纯 水使终体积为lmL，形成砷溶液，与EDTA溶液混匀后，用NaOH调节pH值，室温反应24小时， 即形成As3+-EDTA鳌合物溶液； (6) 二抗的配制：酶标二抗RaMIgG-HRP或GaMIgG-HRP按照1 :1000的工作浓度用洗液 稀释分装； (7) 底物、显色液与洗液的配制：底物、显色液与洗液分装配制； (8) 终止液为2mol/L的硫酸溶液。4. 根据权利要求3所述砷离子酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的检测抗原 As3+-D0TA-Proten，其制备步骤： (1)称取l〇〇mg氯化砷溶于浓硝酸，溶解后加超纯水使终体积为lmL，形成砷溶液； ⑵称取10mgEDTA溶于10mMHBS缓冲液配制成EDTA溶液； (3)将（1)，（2)混匀后，用NaOH调节pH值，反应24小时，形成As3+-EDTA螯合物溶液； (3) 分别称取20mg载体蛋白溶于lmL浓度为10mm〇L/LHBS中形成蛋白溶液： (4) 称取10mgDTPA溶于lmL二甲基亚砜（DMS0)中形成金属鳌合剂溶液； (5) 分别取160uLDTPA加到lmL蛋白溶液中，NaOH调节pH值，室温反应24h，形成蛋 白螯合剂； (6) 取16uL砷溶液到蛋白螯合剂溶液中，室温反应24小时，纯化后得砷离子鳌合物人 工抗原，As3+-DTPA-Proten。5. 根据权利要求1、2所述砷离子残留与含量的酶联免疫试剂盒，其特征在于：其检测 操作包括以下步骤： (1) 样品前处理方法：用0.lmol/LEDTA螫合物溶液处理待检样品，离心取上清液用于 检测； (2) 加样步骤： 第一步，除第一排最后两孔分别为阴性对照和空白对照外，每孔加入50uL工作浓度 的C1号液As3+mAb，同时加入等体积As3+-EDTA鳌合物标准液，其他孔根据检测要求加入50 uL已处理的待检样品和等体积工作浓度的C1号液As3+mAb，混匀后37°C温育15min，反应 后用PBST洗板； 第二步，每孔加入 50uL工作浓度的RaMIgG-HRP/GaMIgG-HRP，37°C温育 25min，PBST洗板； 第三步，每孔加入100UL的酶底物A、B混合液显色，室温反应5min，每孔加入100u L终止液，用酶标仪读A450值，记录结果； (3) 分析检测结果：将第一排的标准液显色的0D值进行数据处理，得出回归方程式，然 后将待测物的0D值放入标准曲线的回归方程式中进行计算，乘以稀释倍数后得出待测样 品中砷离子的含量。6. 根据权利4所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述载体蛋白包括鸡卵清白蛋白 (OVA)，牛血清白蛋白（BSA)，血蓝蛋白（KLH)。7.根据权利要求1一4所述砷离子酶联免疫试剂盒，其特征在于：酶标板上用 As3+-DTPA-BSA包被，包被蛋白质浓度为0.05mg/mL;砷离子mAb的工作浓度为1: 3· 2X106。8. 根据权利要求1~5所述砷离子酶联免疫试剂盒，其特征在于：样品处理简单，适合 于大量样品的快速检测和筛选，具有高特异性、高灵敏度、高精确率等特点，IC5。为29. 08u g/L，最低检测限为0· 248ug/L，检测范围为3. 774~442. 39ug/L。9. 根据权利要求1~8所述砷离子酶联免疫试剂盒，准确性测定通过对土壤、自来水和 猪肉的添加回收，以回收率和变异系数（CV)确定其准确度；土壤的回收率平均为85. 36% ; 自来水的回收率平均为81. 43% ;猪肉的回收率平均为82. 76% ;平均CV小于15%，砷离子 酶联免疫试剂盒具有较高准确度。
【专利摘要】本发明提供了一种检测重金属离子砷离子含量的酶联免疫试剂盒，包被有包被原的酶标板，酶标记物，砷离子螯合物特异性抗体，砷离子螯合物标准品溶液，底物显色液，终止液，浓缩洗涤液，浓缩复溶液。本发明还提供一种应用上述酶联免疫试剂盒检测砷离子螯合物的方法，它包括步骤：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的是检测食品、饲料、饮料、土壤、动物组织等样品中砷离子残留量的酶联免疫试剂盒及检测方法操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本筛查。
【IPC分类】G01N33/577, G01N33/14, G01N33/18, G01N33/02, G01N33/24
【公开号】CN105486822
【申请号】CN201410532231
【发明人】杜道林, 洪霞, 刘静
【申请人】江苏维赛科技生物发展有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年10月11日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于检测重金属离子神离子的单克隆抗体及酶联免疫试剂盒。
【背景技术】
[0002] ±壤和农产品中的重金属与人类健康密切相关。重金属污染主要指生物毒性显著 地隶、館、領、铅W及类金属神，还包括具有毒性的重金属铜、钻、媒、锡等污染物。随 着城市的扩大和大规模工业的发展，大最重金属进入环境后，即使浓度很低，也可能造成危 害，通过饮用水，或者通过生物富集W及食物链等方式最终威胁入体健康。承金属污染不同 于其他类型污染，具有隐蔽性、长期性和不可逆转性等特点。
[0003] 神的污染，主要来自排放的废水。焦炭、含神黄铁矿床、及其它金属矿场的冲出物； 玻璃器皿制造、木材防腐剂、陶瓷制造业、冶金工业、制革厂、纺织业、染料厂、炼油工业、稀 ±金属工业等都可能排放出含神废水。若此含神废水流入河流中或湖泊中，不仅危害到水 中动植物，亦可能渗透到±壤中，而危害到陆生的动植物。工业上的神污染，也是造成人体 神中毒的祸首。因此，神离子污染已对人类健康构成了严重威胁，建市快速、简便、敏感、特 异、经济、筛检量大的离子锋离子免疫检测技术，对了减少环境污染、提高食品质量、保障食 品安全具有重要意义。
[0004] 所W，痕量重金属的定量分折在食品和环境检测等方而都是非常重要的。传统的 重金属离子检测法如无火焰原子吸收光谱法、火焰原子吸收光谱法、电感禪合等离子体质 谱浊、伏安法和离了色谱浊，W及电热原了化原了吸收光谱法等，偷测必须在只各大型分析 仪器的重点实验室内进行，无法用于现场检测，且受到费用高、处理量有限和检测时间长等 限制，郁小利于在生产中推广应用，难W适必环境及市场产品的现场抽查及产品进口快速 通关的要求；免疫学检测方法只有快速、廉价、灵敏和特异性强的优点，可同时完成高通量 样品的检测，建立免疫分析法检测神离子是生产及经济发展的需要。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的：针对现有检测技术的不足和缺陷，制备出抗神离子莖合物的高亲 和力、特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，W此为基础提供一种用于检测神离子含量的酶 联免疫试剂盒，能够快速、简便、敏感、特异的检测食品、茶叶、饲料、饮料、±壤、水、动物组 织等样品中的神离子的含量。
[0006] 所述的检测神离子的酶联免疫试剂盒，包括96孔或48孔酶标板、最佳工作浓度的 sn3++mAb或pAb、最佳工作浓度的RaMIgG-HRP或GaMIgG-HRP、底物显色剂A、底物显色剂B、 As3+-DTPA-0VA或As3+-DTPA-BSA包被并封闭好的酶标板、终止液，sn 3+莖合物配置的标准品 稀释液1~9,洗液（PBST)。
[0007] 所述的检测神离子的酶联免疫试剂盒，用眼观或酶标仪获取结果，并根据结果绘 制标准曲线，添加回归方程式，根据回归方程式分析计算所检测样品中的神离子含量，对神 离子进行痕量分析。
[0008] 所述的检测神离子的酶联免疫试剂盒，所用的神离子标准品为神离子与邸ΤΑ的 莖合物，莖合物中神离子含量采用石墨炉原子吸收光谱法检测获得莖合物半抗原中Sn的 含量。
[0009] 所述单克隆抗体或多克隆抗体的制备方法为： A1、双功能整合剂的选择：对氨基苯基-二己Η胺五己酸（P-N肥-Bn-DTPA)，双功能莖 合剂1- (4-异硫氯根苯基）-己二胺四己酸（ITCB巧，2- (4-异硫氯根苯基-1，4, 7,10-四氮 环十二焼四盐酸盐（P-SCN-Bn-DOTA)，然后在碱性或酸性环境下，将离子神离子莖合在双功 能莖合剂上； A2、sn3M)TPA-载体蛋白人工抗原的合成；分别称取鸡卵清白蛋白（0VA)，牛血清白蛋 白度SA)和血藍蛋白化LH) 20mg溶于1血浓度为10mmoL/L，pH9. 0的N-2-居己基脈嗦-N-己 礙酸缓冲液（皿巧中形成KLH、BSA、OVA溶液。称取lOmg金属藝合剂对氨基苯基-二己 Η胺五己酸（P-N肥-Bn-DTPA)溶于1血二甲基亚讽（DMS0)中形成金属藝合剂溶液；分别 取lOOuL金属藝合剂溶液轻轻揽拌下逐滴滴加到0. 5mLKLH和BSA溶液中，用lOmol/LKOH 调节抑至9. 0,室温下反应2地。制备出神离子人工抗原sn3M)TPA-0VA，sn3M)TPA-BSA， sn3+-DTPA-KLH，-20°C保存备用。
[0010] A3、神离子单克隆抗体和多克隆抗体的获得；用sn3M)TPA-BSA，sn3+-DTPA-KLH免 疫6周雌性BALB/C小鼠5只，剂量为25 ug/0. 2mL/只，背部皮下分点注射。采用细胞融合 技术制备抗神离子莖合物的单克隆抗体。无菌条件下取免疫鼠脾脏细胞，在聚己二醇PEG-1 500作用下与NS。骨髓瘤细胞进行融合；用间接化I SA法测定细胞上清抗体效价，用阻断 ELI SA法测定上清抗体抑制率，进行阳性孔筛选，用经GF-AAS检测获得sn3+-藝合剂做神 离子标准液，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行亚克隆和扩大培养、通过鉴定， 获得一株杂交瘤细胞株；之后采用体内诱生腹水法制备sn3+mAb ; 多抗制备：用sn3M)TPA-BSA，sn3M)TPA-KLH人工抗原免疫新西兰大白兔，免疫剂量为 50ug~100 ug/次，背部皮下分多点注射或足底注射；首免用弗氏完全佐剂乳化；加强免疫 用弗氏不完全佐剂乳化，连续免疫5次，每次间隔8周，最后一次免疫后10~15天，W ELISA 法测其定效价达到1〇5 W上时，采血并分离收集高免血清。W饱和硫酸倭盐析法提取IgG抗 体，-2(TC冻存备用。
[0011] 本发明的检测神离子酶联免疫试剂盒具有下列各项优点： ①特异性强，敏感性高。该检测神离子酶联免疫试剂盒W高亲和力的单克隆抗体（mAb) 或多克隆抗体（pAb)为基础制备而成。酶联免疫试剂盒采用的是非均相间接竞争模式，其 基本原理是样品中的sn3+与过量藝合剂藝合成可溶性的sn 3+-藝合剂复合物后，将其与已包 被于酶标板上的包被抗原sn3+-藝合剂-载体蛋白复合物共同竞争sn 3+mAb上有限的结合位 点，反应达到平衡后洗脱多余的sn3+-藝合剂和sn3+mAb，然后与酶标二抗反应，用酶及其底 物显色系统显示抗原抗体的结合情况，进而定量检测sn3+在样品中的含量。该试剂盒最低 检测限为0. 248 ug/l，检测范围为3. 774~442. 39 ug/l，与其它金属离子交叉反应较小。
[0012] ②简便、快速、时效性强。使用该检测神离子酶联免疫试剂盒，无需其它试剂和仪 器，可现场操作，只要按照该试剂盒说明书上操作步骤进行检测，60分钟内即可判定检测结 果，并根据结果可计算样品中神离子含量。
[0013] ⑨结果显示直观、形象、准确。酶联免疫试剂盒固相上的酶量与标本中受检物质的 量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。显色液和 底物不同显示不同颜色，本试剂盒底物为过氧化脈，显色剂为四甲基联苯胺（TMB)，终止液 为2mol/L的硫酸溶液，故显示藍色，终止后显色为黄色，肉眼可见。与所提供的标准检测液 比较，显色越深则待测物中神离子含量越低或不含，显色越淡或不显色者说明样品中含有 待检物，且含量越高，如有酶标仪可进行度数，度数后根据稀释比例进行计算可得出神离子 的含量。
[0014] ④适用范围广，节省费用，便于推广。使用酶联免疫试剂盒，比用仪器分析的费用 大幅下降。另外，酶联免疫试剂盒的适用范围广，可满足不同层次人员需要，包括专业检验， 海关检疫，卫生检疫，质量监测，加工企业和养殖场户等，便于推广应用，具有广阔的市场前 景和明显的经济、社会效益。
【附图说明】
[0015] 图1为检测神离子酶联免疫试剂盒的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0016] 一种用于检测神离子酶联免疫试剂盒，它包括检测酶标板、用于检测的试剂，其中 试剂包括样品稀释液，样品提取液。重金属离子免疫检测的关键在于重金属特异性单克隆 抗体的制备，重金属特异性单克隆抗体制备的关键又在于重金属免疫原。由于重金属离子 带有电荷，能与动物体内生物分子发生强烈的不可逆的反应，导致动物中毒。因此，可利用 特异性的双功能莖合剂莖合重金属离子，形成能被动物免疫系统识别的金属一莖合剂的复 合物，但送些重金属-莖合剂复合物是分子量低于IkD的半抗原，免疫原性低，不足W引起 免疫反应，还需将之与载体蛋白偶联，才能形成完整的免疫原。要制成神离子酶联免疫试剂 盒，首先需要对重金属离子神离子与双功能莖合剂进行莖合反应，制备神离子莖合物偶联 载体蛋白，用于制各相应的检测抗体。
[0017] 本发明还包括食品、饲料、饮料、±壤、动物组织等样品预处理方法。饲料、动物 组织±壤等固体样品，研磨捣碎后称取1. Og样品，加入10血肥阳S缓冲液，揽拌30min， 300化/min离必5min，在上清液中加入30mg邸TA，并用化OH溶液调抑至6. 0,室温反应 过夜；市场购买的饮料、自来水等液体样品，取lOmL样品，加入30mg邸TA，用化0H溶液调 抑至6. 0,室温反应过夜，反应后待检。
[0018] 本发明的检测神离子酶联免疫试剂盒，样品处理简单，适合于大量样品的快速检 测和筛选，具有高特异性、高灵敏度、高精确率等特点，最低检测限 为0. 248 11旨/1，检测范围 为 3. 774 ~442. 39ug/L。
[0019] W下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0020] 实施例1、神离子莖合物、多克隆、单克隆抗体的制备 1. 1神离子整合物的合成与鉴定 称取lOOmg纯度为99. 99%的氯化神溶于100 U L纯度为优级的浓硝酸，待充分溶解 加超纯水使终体积为1血，形成浓度为733. 7mmoL/L神溶液。称取lOmg邸TA溶于lOmMHBS 缓冲液配制成浓度为34. 2mmoL/L邸ΤΑ溶液。将两者混匀后，用化OH调节抑值为6. 0,室 温摇床反应24小时，即形成sn3+-EDTA藝合物溶液。
[002d 将100 mg/mL的sn3+标准储备液用2%的硝酸稀释成ο ug/血、0. 25 u 9 /血、 0. 5ug/mL、l ug/mL、2 ug/mL、4 ug/mL的浓度梯度，仪器软件自动绘制标准曲线，并得出线 性回归方程；样品溶液50倍稀释，用226nm波长在最佳优化实验条件下进行测定，仪器软件 自动分析结果。计算出所整合物种的神离子含量。
[0022] 1. 2神离子人工抗原的合成与鉴定 分别称取20mg KLH和BSA溶于1血浓度为lOmmoL/L，抑9. 0的N-2-居己基脈嗦-N-己 礙酸缓冲液（皿巧中形成KLH、BSA溶液。
[0023] 称取Img金属藝合剂对氨基苯基-二己Η胺五己酸（P-NH2-Bn-DTPA)溶于1血二 甲基亚讽（DMS0)中形成金属藝合剂溶液；分别取160UL金属藝合剂溶液轻轻揽拌下逐滴滴 加到ImLKLH和BSA溶液中，用lOmol/L化0H调节抑至9.0,室温下反应2地。反应产物用 30Kd的超滤管纯化，超滤管内加入反应产物超滤，超滤管内先用lOmmoL/L，抑9. 0皿S冲洗3 次，再用lOmmoL/L，抑7. 4的皿S缓冲液洗2次，除去其中未反应的小分子金属藝合剂。
[0024] 取16 U L浓度为733. 7mmoL/L神溶液滴加到已反应过的载体蛋白溶液中，用用 化0H调节抑值至9. 0,室温摇床反应24小时，然后移入透析袋中透析5天。所得产物即分 别为纯化的神离子藝合后的人工抗原；sn3M)TPA-BSA，sn3+-DTPA-KLH。用蛋白核酸分析仪 在280nm波长下测定人工抗原中的蛋白浓度。
[00巧]同法制得包被抗原sn3M)TPA-0VA。
[002引1. 3神离子单克隆抗体（sn3+mAb)和多克隆抗体（sn3+pAb)的获得 用sn3+-DTPA-BSA，sn3+-DTPA-KLH分别免疫6周雌性BALB/C小鼠5只，剂量为20 ug/0. 2mL /只，背部皮下分点注射。义用细胞融合技术，在PEG-1500作用下与NS。骨髓瘤 细胞进行融合；用间接化ISA和阻断化ISA进行阳性孔筛选，筛选后进行有限稀释克隆化， 扩大培养、冻存并鉴定，获得杂交瘤细胞株。采用体内诱生腹水法制备sn3+mAb。用蛋白核 酸分析仪在280nm波长下测定所获抗体的IgG含量。计算该单抗亲和力常数。
[0027] 多抗制备：用sn3+-DTPA-BSA，sn3+-DTPA-KLH分别免疫新西兰白兔，免疫剂量为50 ug~100 ug/次，背部皮下分多点注射。首免，加等量弗氏完全佐剂（FCA)乳化；加强免疫， 加等量弗氏不完全佐剂（FIA)乳化，连续免疫5次，每次间隔8周，最后一次免疫后10~15 天，W间接化TSA法测其定效价达到1 ;105 W上时，采血并分离收集高免血清W饱和硫酸倭 盐析法提取IgG抗体，-2(TC冻存备用。
[002引实施例2、神离子检测酶联免疫试剂盒的制备 2. 1酶联免疫试剂盒检测反应原理 免疫学检测即是根据抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用 已知的抗体检测未知的抗原。酶联免疫试剂盒选用合适浓度的包被抗原包被酶标板，将待 测己处理后的样品按要求取用和提供的多克隆或单克隆抗体结合反应，未完全结合的抗体 与酶标板上的位点结合，通过辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠或兔抗鼠二抗结合反应，通过 显色体现显色，观察结果，或用酶标仪读数，根据结果计算待测物的含量。结果的判断同所 提供的阴性、阳性对照比较，如显色深浅同阴性对照完全相同，则视为阴性，即为不含待测 物；如显色较弱，或是不显色则为阳性或弱阳性，即为含有待测物。如空白对照显色，或阴性 对照不显色则视为无效。
[0029] 2. 2神离子检测酶联免疫试剂盒的制备 (1)待标神离子mAb或pAb的工作浓度将待标离子神离子mAb或pAb溶液1000化pm离 >1_ι、30πι;?η,除去杂质。义用方阵法师选确志贸子神贸子mhb或pAb的工作浓度。用不问浓度 的包被抗原包被，测出包被原最佳包被浓度和最佳抗体浓度。本试剂盒最佳包被浓度即用 sn3+-DTPA-BSA包被，蛋白质浓度为0. 05mg/mL ;神离子ml·*的工作浓度为1 ;3. 2X 105 ;神 离子pAb的工作浓度为1 ;5. 2X 1〇5。
[0030] (2)神离子检测酶联免疫试剂盒标准品的制备称取10m姐DTA溶于lOmM皿S缓 冲液配制成浓度为34. 2mmoL/L邸TA溶液，将sn3+标准储备液稀释成0ug/mL、3. 906ug/ mL、7. 812ug/mL、15. 625ug/mL、31. 25ug/mL、62. 5ug/mL、125ug/mL、250ug/mL、500ug/mL、 lOOOug/mL的浓度梯度，用化OH调节抑值为6. 0,室温摇床反应24小时，即形成sn3+-邸TA 藝合物溶液。将1〇〇雌/11^的3]13+标准储备液用2%的硝酸稀释成〇11旨/1]^、0.25 11旨/血、 0. 5 ug/mL、l ug/mL、2 ug/mL、4 ug/mL的浓度梯度，仪器软件自动绘制标准曲线，并得出线 性回归方程；样品溶液50倍稀释，用226nm波长在最佳优化实验条件下进行测定，仪器软件 自动分析结果。
[0031] (3)神离子检测酶联免疫试剂盒的组装神离子残留与含量的酶联免疫试剂盒， 标准配置包括C1号液（最佳工作浓度的sn3+mAb)，C2号液（最佳工作浓度的RaMIgG- HRP)，C3号液（底物显色剂A)，C4号液（底物显色剂B)，sn3+-DTPA-BSA包被并封闭好的 8 X 12 (96孔）或酶8 X 12 (48孔）酶标板，巧号液（终止液），sn3+标准品稀释液1~9， 洗液（PBST)。洗液为0. 0 Imol/L、抑7. 4的磯酸盐缓冲液含0. 05% Tween-20(PBST)，底物 显色剂A为过氧化脈，底物显色剂B为四甲基联苯胺灯N3)，终止液为2moL/L的硫酸溶液。
[0032] (4)神离子酶联免疫试剂盒操作步骤 A1、样品前处理方法：用0.1mol / L邸TA溶液处理样品，离必取上清液用于检测。 [003引 A2、检测步骤： 第一步，除第一排最后两孔分别为阴性对照和空白对照外，每孔加入50 U L工作浓度 的C1号液sn3+mAb，同时加入等体积sn3+-邸TA藝合物标准液，其他孔根据检测要求加入50 U L已处理的待检样品和等体积工作浓度的C1号液sn3+mAb，混匀后37°C温育15min，反应 后用PBST洗板； 第二步，每孔加入50 U L工作浓度的RaRIgG-HRP，37°C温育25min，PBST洗板； 第Η步，每孔加入100 U L的酶底物A、B混合液显色，室温反应5min，每孔加入100 U L终止液，用酶标仪读A45。值，记录结果。
[0034] 如检测样品的显色未在标准品的显色范围内，可根据情况加倍稀释后重新检测， 计算结果时乘W稀释倍数。
[0035] A3、分析检测结果：将第一排的标准液显色的0D值进行数据处理，得出回归方程 式，然后将待测物的0D值放入标准曲线的回归方程式中进行计算，乘W稀释倍数后得出待 测样品中神离子的含量。
[0036] (5)神离子酶联免疫试剂盒标准曲线阻断ELISA测定单克隆抗体对不同浓度Sn标 准品的抑制率，W抑制率B/B。％度是sn 3+不同标准浓度的A4日。值，B。是sn3+0 ug/L的标准浓 度的A4印值）为纵坐标，W不同标准品浓度的对数值为横坐标，在半对数坐标纸上绘制标 准曲线，推导回归方程，进行回归分析。线性的回归方程为Υ=-33. 827X+99. 512，R2=0. 9891， IC5。为29. 08 u 9 / L。标准曲线见附图1。
[0037] 实施例3、神离子酶联免疫试剂盒的性能 3. 1灵敏性测定按照阻断化ISA最低检测限为B/B。％ =120%的方法，根据曲线回归方 程计算出试剂盒的灵敏度，确定检测限。测定结果，检测限为0.248 ug/L。根据阻断化ISA 所得结果中B/B。％ =10%~90%为检测范围，根据曲线回归方程计算出试剂盒的检测范围 为 3. 774 ~442. 39 ug/L。
[0038] 3. 2准确性测定将sn3+标准品W终浓度分别为5、10、20、40ug/L添加到±壤、自来 水和猪肉中，设6个重复，W回收率和变异系数（CV)确定其准确度。结果见表2。±壤的回收 率在84. 15%~87. 6%，平均85. 36%，变异系数（CV)在6. 05%~13. 09%;自来水的回收 率在76. 7%~88. 3%，平均81 . 43%，CV在10. 76%~12. 87%;猪肉的回收率在80. 2%~ 85. 4%，平均82. 76%，CV在12. 59%~15. 94%。平均CV小于15%，表明试剂盒具有较高 准确度。见表1。
[0039] 表1神离子酶联免疫试剂盒添加回收试验（n=6)
3. 3特异性测定采用交叉反应试验，选择隶、铅、領、铜、館、钻、铁等金属离子与邸ΤΑ的 莖合物、邸ΤΑ、口CBE、D0TA、DTPA为抑制物，用阻断ELISA测定各抑制物的ICs。，W sn3+mAb 对sn3+的ICw和对其它各竞争物的ICw的百分率为其交叉反应率（CR% )。见表2。
[0040] 表2 Sn3+-EDTA mAb与其它金属莖合物的交叉反应
3. 4稳定性；取同一批次的试剂盒保存于4(TC，测定保存6个月中各月份的A45。值、 ICw、R2变化情况，确定其稳定性。见表3 表3剂盒的保存期_
实施例4、神离子酶联免疫试剂盒的应用 4. 1固体样品的提取（饲料、动物组织、±壤等） 取组织（鸡肉、兔肉、饲料等）均质物1. 09,研磨捣碎后加入过量的已稀释的邸TA溶液 混匀，用化OH调节抑值为6. 0,室温摇床反应24小时，即形成sn3+-EDTA藝合物溶液。
[0041] 液体样品的提取不需研磨可直接加入邸TA溶液混匀进行莖合，用于检测。
[0042] 4. 2检测操作方法 第一步，除第一排最后两孔分别为阴性对照和空白对照外，每孔加入50 U L工作浓度 的C1号液sn3+mAb，同时加入等体积不同浓度的神离子标准液，其他孔根据检测要求加入50 U L已处理的待检样品和等体积工作浓度的C1号液sn3+mAb，混匀后37°C温育15min，反应 后用PBST洗板； 第二步，每孔加入50 U L工作浓度的RaRIgG-HRP，37°C温育25min，PBST洗板； 第Η步，每孔加入1 00 U L的酶底物A、B混合液显色，室温反应5min，每孔加入100 U L终止液，用酶标仪读A460值，记录结果。
[0043] 将获得的第一排的神离子标准液的0D值按照公式，绘出标准曲线图，并添加的回 归方程，待检物的0D值按照回归方程进行计算，乘W取样时的稀释倍数得出待测样品中神 离子的含量。如果没有酶标仪进行度数的，可根据肉眼观察判断结果，判断方法是观察待测 物的显色深浅与试剂盒提供的神离子标准液的显色进行比较，相近颜色的神离子标准液的 浓度可大概判定为该待测物的神离子含量，结果乘W取样时的稀释倍数即为该待检样中的 神离子的含量。
[0044] W上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何 不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的 保护范围应该W权利要求书所限定的保护范围为准。
【主权项】
1. 一种用于检测食品、饮料、茶叶、土壤、动物组织等样品中的砷离子残留与含量的酶 联免疫试剂盒。2. 根据权利要求1所述砷离子酶联免疫试剂盒，其特征在于：包括包被As3+-D0TA-BSA 或As3+-D0TA-0VA并封闭好的96孔或48孔酶标板，以As3+-D0TA-BSA或As3+-D0TA-0VA为抗 原制备的砷离子多克隆或单克隆抗体As3++mAb或pAb，酶标二抗为兔抗鼠或羊抗鼠抗体标 记辣根过氧化物酶RaMIgG-HRP或GaMIgG-HRP，sn3+螯合物配置的标准品稀释液，洗液为 0·Olmol/L、ρΗ7· 4的磷酸盐缓冲液含0· 05%Tween-20 (PBST)，底物显色剂A为过氧化脲， 底物显色剂B为四甲基联苯胺（TMB)，终止液为2mol/L的硫酸溶液。3. 根据权利要求1、2所述的砷离子酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的酶联免疫试 剂盒由以下步骤制备： (1) 包被：酶标板上用sn3+-DTPA-BSA包被； (2) 封闭；采用浓度为0. 05%的猪血清进行封闭； (3) 单克隆抗体的制备：用As3+-D0TA-KLH和As3+-D0TA-BSA分别免疫6周龄雌性BALB/ C小鼠；采用细胞融合技术无菌取脾脏制备脾细胞，在聚乙二醇-1500作用下与NS。骨髓瘤 细胞进行融合：用间接ELISA法和阻断ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细 胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，扩大培养、冻存并鉴定，获得一株杂交瘤细胞株；之 后采用体内诱生腹水法制备抗砷离子螯合物的mAb; (4)EDTA反应液的配制：称取10mgEDTA溶于10mMHBS缓冲液配制成浓度为34. 2mm〇L/ LEDTA溶液； (5)As3+标准溶液的配制：称取lOOmg氯化砷溶于100uL浓硝酸，待充分溶解加超纯 水使终体积为lmL，形成砷溶液，与EDTA溶液混匀后，用NaOH调节pH值，室温反应24小时， 即形成As3+-EDTA鳌合物溶液； (6) 二抗的配制：酶标二抗RaMIgG-HRP或GaMIgG-HRP按照1 :1000的工作浓度用洗液 稀释分装； (7) 底物、显色液与洗液的配制：底物、显色液与洗液分装配制； (8) 终止液为2mol/L的硫酸溶液。4. 根据权利要求3所述砷离子酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的检测抗原 As3+-D0TA-Proten，其制备步骤： (1)称取l〇〇mg氯化砷溶于浓硝酸，溶解后加超纯水使终体积为lmL，形成砷溶液； ⑵称取10mgEDTA溶于10mMHBS缓冲液配制成EDTA溶液； (3)将（1)，（2)混匀后，用NaOH调节pH值，反应24小时，形成As3+-EDTA螯合物溶液； (3) 分别称取20mg载体蛋白溶于lmL浓度为10mm〇L/LHBS中形成蛋白溶液： (4) 称取10mgDTPA溶于lmL二甲基亚砜（DMS0)中形成金属鳌合剂溶液； (5) 分别取160uLDTPA加到lmL蛋白溶液中，NaOH调节pH值，室温反应24h，形成蛋 白螯合剂； (6) 取16uL砷溶液到蛋白螯合剂溶液中，室温反应24小时，纯化后得砷离子鳌合物人 工抗原，As3+-DTPA-Proten。5. 根据权利要求1、2所述砷离子残留与含量的酶联免疫试剂盒，其特征在于：其检测 操作包括以下步骤： (1) 样品前处理方法：用0.lmol/LEDTA螫合物溶液处理待检样品，离心取上清液用于 检测； (2) 加样步骤： 第一步，除第一排最后两孔分别为阴性对照和空白对照外，每孔加入50uL工作浓度 的C1号液As3+mAb，同时加入等体积As3+-EDTA鳌合物标准液，其他孔根据检测要求加入50 uL已处理的待检样品和等体积工作浓度的C1号液As3+mAb，混匀后37°C温育15min，反应 后用PBST洗板； 第二步，每孔加入 50uL工作浓度的RaMIgG-HRP/GaMIgG-HRP，37°C温育 25min，PBST洗板； 第三步，每孔加入100UL的酶底物A、B混合液显色，室温反应5min，每孔加入100u L终止液，用酶标仪读A450值，记录结果； (3) 分析检测结果：将第一排的标准液显色的0D值进行数据处理，得出回归方程式，然 后将待测物的0D值放入标准曲线的回归方程式中进行计算，乘以稀释倍数后得出待测样 品中砷离子的含量。6. 根据权利4所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述载体蛋白包括鸡卵清白蛋白 (OVA)，牛血清白蛋白（BSA)，血蓝蛋白（KLH)。7.根据权利要求1一4所述砷离子酶联免疫试剂盒，其特征在于：酶标板上用 As3+-DTPA-BSA包被，包被蛋白质浓度为0.05mg/mL;砷离子mAb的工作浓度为1: 3· 2X106。8. 根据权利要求1~5所述砷离子酶联免疫试剂盒，其特征在于：样品处理简单，适合 于大量样品的快速检测和筛选，具有高特异性、高灵敏度、高精确率等特点，IC5。为29. 08u g/L，最低检测限为0· 248ug/L，检测范围为3. 774~442. 39ug/L。9. 根据权利要求1~8所述砷离子酶联免疫试剂盒，准确性测定通过对土壤、自来水和 猪肉的添加回收，以回收率和变异系数（CV)确定其准确度；土壤的回收率平均为85. 36% ; 自来水的回收率平均为81. 43% ;猪肉的回收率平均为82. 76% ;平均CV小于15%，砷离子 酶联免疫试剂盒具有较高准确度。
【专利摘要】本发明提供了一种检测重金属离子砷离子含量的酶联免疫试剂盒，包被有包被原的酶标板，酶标记物，砷离子螯合物特异性抗体，砷离子螯合物标准品溶液，底物显色液，终止液，浓缩洗涤液，浓缩复溶液。本发明还提供一种应用上述酶联免疫试剂盒检测砷离子螯合物的方法，它包括步骤：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的是检测食品、饲料、饮料、土壤、动物组织等样品中砷离子残留量的酶联免疫试剂盒及检测方法操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本筛查。
【IPC分类】G01N33/577, G01N33/14, G01N33/18, G01N33/02, G01N33/24
【公开号】CN105486822
【申请号】CN201410532231
【发明人】杜道林, 洪霞, 刘静
【申请人】江苏维赛科技生物发展有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年10月11日
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