一种基于荧光共振能量转移技术的g蛋白偶联受体40筛选模型的制作方法
一种基于荧光共振能量转移技术的g蛋白偶联受体40筛选模型的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于药理学领域，利用荧光检测技术，构建了稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂药物筛选模型，用于待测样品对稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂活性的高通量检测。
【背景技术】
[0002]脂肪酸受体GPR40是G蛋白偶联受体家族成员之一，主要与G蛋白q亚型和s亚型偶联发挥作用。GPR40人类肝脏、心脏、骨骼肌、胰腺和脑等组织中都有表达。GPR40通过激活多条细胞内信号途径发挥不同的生物学功能，在调节胰岛素分泌，引起胰岛B细胞过度增殖等过程中具有重要作用。所以建立GPR40激动剂筛选模型对治疗糖尿病等疾病具有重要意义。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于建立一种基于荧光的稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂高通量筛选模型，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。
[0004]本发明的技术方案:采用荧光方法建立稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂药物高通量筛选模型，通过该模型验证Oleic acid对GPR40的激动作用。具体步骤如下:
[0005]本发明利用荧光的方法建立了稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂药物高通量筛选模型。
[0006]步骤一:稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂筛选模型的建立与优化。
[0007]步骤二:阳性药验证模型可靠性。
[0008]步骤三:高通量筛选模型验证。
【附图说明】
[0009]图1:1P1标准曲线
[0010]图2:01eic acid刺激cAMP产生的量效关系
[0011]图3:01eic acid刺激cAMP产生的量效关系
[0012]图4:01eic acid刺激cAMP产生的量效关系
[0013]图5:激动剂验证结果
【具体实施方式】
[0014]以下结合【附图说明】本发明的【具体实施方式】:
[0015]一、稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂剂筛选方法建立
[0016]1、实验材料
[0017](1)细胞株:010 GPR40。
[0018](2)完全培养:01^]?;10%?85;200呢/1111 Zeocin，100ug/ml Hygromycin。
[0019](3)主要仪器:C02培养箱；384孔板;Paradigm? Detect1n Platform。
[0020]2、实验步骤
[0021](1)细胞培养
[0022]1)T25中培养的细胞贴壁度要达到80%，达到对数生长期。
[0023]2)弃去培养基后用lmL PBS冲洗细胞一次。
[0024]3)用3mL 0.5mM EDTA消化细胞5min后用3mL培养基终止消化。
[0025]4) lOOOrpm 离心 5min。
[0026]5)弃去上清液后用适量培养基重悬细胞，对细胞计数。
[0027]6)用培养基稀释细胞悬液至6mL，使细胞密度达到7.5 X 105cel 1 s/mL，将此细胞悬液移入T25培养瓶中，在37°C/5 % C02环境下培养细胞。
[0028]7)用于确定细胞数、验证阳性药及筛选GPR40激动剂试验的CH0 GPR40细胞应是复苏后至少传代3次且达到稳定生长状态的细胞。于实验前将其用PBS润洗细胞一次，接着用
0.5mM EDTA消化，离心，去除上层液体，最后将细胞用适量IP1 stimulat1n重悬至所需细胞密度。
[0029](2)标准曲线的测定及最佳细胞数确定
[0030]1)配制IP1标准稀释液:1P1标准溶液(试剂盒自带)逐级稀释。
[0031]2)配制Oleic acid梯度稀释液:需要用Oleic acid对细胞进行刺激，所以应将Oleic acid
[0032]储备液逐级稀释。
[0033]3)配制不同浓度的细胞稀释液:用IP1 stimulat1n buffer将1.(7)中重悬好的细胞分别稀释为 30000cells/well、15000cells/well 及 7500cells/well。
[0034]4)加样:将2.(1)中稀释好的IP1溶液按每个浓度1个复孔，10yL每孔加入384孔板中，再加入 1 孔 10yL的IP1 stimulat1n buffer作为negative control(NC);将2.(2)中稀释好的01 eic acid溶液按每个浓度2个复孔，5yL每孔加入384孔板中，再加入2孔每孔各5yL的IP1 stimulat1n buffer作为cell negative control(CNC)。接着向不同浓度的Oleicacid溶液及CNC中加入2.(3)配制好的不同浓度的细胞稀释液各5μL。将384孔板在500rpm下离心15s，使10yL试剂混合均勾以充分反应。为防止试剂蒸发造成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于室温下使之孵育60min。
[0035]5)终止试剂:用 conjugate&lysis buffer 将 IPl_d2con jugate 和 Ant1-1Plcryptate Tb conjugate进行稀释，配制好的IPl_d2conjugate和Ant1-1Plcryptate Tbcon jugate按1:1混勾后加入到其余各孔，每孔10yL。将384孔板在500rpm下离心15s，使20yL试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下继续孵育60min。
[0036]6)检测:孵育时间到达后，揭去TopSeal-A膜，将板放于设定好程序的Paradigm?Detect1n Platform上检测。处理数据，确定最佳细胞数。
[0037](3)激动剂验证
[0038]1)对Oleic acid进行梯度稀释。
[0039]2)配制含最佳细胞数的溶液:用IP1 stimulat1n buffer将1.(7)中重悬好的细胞稀释为2.(6)中得到的最佳细胞浓度。
[0040]3)加样:将3.(1)中稀释好的Oleic acid溶液按每个浓度2个复孔，5yL每孔加入384孔板中，再加入4孔每孔各5yL的IP1 stimulat1n buffer，其中2孔作为CNC，另2孔作为non-stimulated control (NSC)。将3.(2)配制的细胞溶液按每孔5yL加入384孔板中。将384孔板在500rpm下离心15s，使10yL试剂混合均勾以充分反应。为防止试剂蒸发造成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于室温下使之孵育60min。
[0041]4)按2.(5)配制终止试剂。配制好的 IPl_d2 con jugate 和 Ant1-1Pl cryptate Tbcon jugate按1:1混勾后加入到其余各孔，每孔10yL。将384孔板在500rpm下离心15s使20yL试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下继续孵育60min。
[0042]5)孵育时间到达后，揭去TopSeal-A膜，将板放于设定好程序的Beckman Paradigm上检测。处理数据，确定Oleic acid的EC50。
[0043]实验结果
[0044]以不同浓度的Oleic ac i d刺激使细胞产生cAMP。结果表明，384孔板中以30000CellS/well细胞数点板所产生的cAMP与信号的量效关系与标准曲线最吻合(见图1)。以不同浓度Oleic acid对30000cells/well CH0 GPR40进行实验(见图2、3、4)。验证了Oleic acid对GPR40的激动作用，其EC50=1.990e-005(见图5)。并表明采用本方法确定了稳转细胞株CH0 GPR40的激动剂药物筛选模型造模条件，实验结果稳定可靠，可以用于进行稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂的高通量筛选。
【主权项】
1.一种稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂高通量筛选模型，使用IP1对培养好细胞进行处理，检测最佳细胞数目，然后选用不同浓度Oleic acid对细胞进行刺激，并使其产生cAMP，确定Oleic acid的EC5Q。其特征在于确定了稳转细胞株CHO GPR40的激动剂药物筛选模型造模条件，每孔细胞数为30000cells，所得到Oleic acid刺激结果与标准曲线趋势最为一致。通过该模型验证了Oleic acid对GPR40的激动作用。
【专利摘要】一种利用荧光技术实现的稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂药物高通量筛选，本发明中利用IP1溶液对培养好的细胞进行处理并确定在384孔板中以最佳细胞数30000cells/well进行激动剂验证。从而确定了稳转细胞株CHO？GPR40的激动剂药物筛选模型造模条件，验证了Oleic？acid对GPR40的激动作用，其EC50＝1.990e-005。方法简便快捷；荧光检测值灵敏度高，提高检测精确度；结果稳定可靠，重现性好。
【IPC分类】G01N33/50
【公开号】CN105486850
【申请号】CN201510828101
【发明人】严明, 俞沁玮, 骆深玲, 张陆勇
【申请人】中国药科大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年11月20日
【技术领域】
[0001]本发明属于药理学领域，利用荧光检测技术，构建了稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂药物筛选模型，用于待测样品对稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂活性的高通量检测。
【背景技术】
[0002]脂肪酸受体GPR40是G蛋白偶联受体家族成员之一，主要与G蛋白q亚型和s亚型偶联发挥作用。GPR40人类肝脏、心脏、骨骼肌、胰腺和脑等组织中都有表达。GPR40通过激活多条细胞内信号途径发挥不同的生物学功能，在调节胰岛素分泌，引起胰岛B细胞过度增殖等过程中具有重要作用。所以建立GPR40激动剂筛选模型对治疗糖尿病等疾病具有重要意义。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于建立一种基于荧光的稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂高通量筛选模型，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。
[0004]本发明的技术方案:采用荧光方法建立稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂药物高通量筛选模型，通过该模型验证Oleic acid对GPR40的激动作用。具体步骤如下:
[0005]本发明利用荧光的方法建立了稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂药物高通量筛选模型。
[0006]步骤一:稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂筛选模型的建立与优化。
[0007]步骤二:阳性药验证模型可靠性。
[0008]步骤三:高通量筛选模型验证。
【附图说明】
[0009]图1:1P1标准曲线
[0010]图2:01eic acid刺激cAMP产生的量效关系
[0011]图3:01eic acid刺激cAMP产生的量效关系
[0012]图4:01eic acid刺激cAMP产生的量效关系
[0013]图5:激动剂验证结果
【具体实施方式】
[0014]以下结合【附图说明】本发明的【具体实施方式】:
[0015]一、稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂剂筛选方法建立
[0016]1、实验材料
[0017](1)细胞株:010 GPR40。
[0018](2)完全培养:01^]?;10%?85;200呢/1111 Zeocin，100ug/ml Hygromycin。
[0019](3)主要仪器:C02培养箱；384孔板;Paradigm? Detect1n Platform。
[0020]2、实验步骤
[0021](1)细胞培养
[0022]1)T25中培养的细胞贴壁度要达到80%，达到对数生长期。
[0023]2)弃去培养基后用lmL PBS冲洗细胞一次。
[0024]3)用3mL 0.5mM EDTA消化细胞5min后用3mL培养基终止消化。
[0025]4) lOOOrpm 离心 5min。
[0026]5)弃去上清液后用适量培养基重悬细胞，对细胞计数。
[0027]6)用培养基稀释细胞悬液至6mL，使细胞密度达到7.5 X 105cel 1 s/mL，将此细胞悬液移入T25培养瓶中，在37°C/5 % C02环境下培养细胞。
[0028]7)用于确定细胞数、验证阳性药及筛选GPR40激动剂试验的CH0 GPR40细胞应是复苏后至少传代3次且达到稳定生长状态的细胞。于实验前将其用PBS润洗细胞一次，接着用
0.5mM EDTA消化，离心，去除上层液体，最后将细胞用适量IP1 stimulat1n重悬至所需细胞密度。
[0029](2)标准曲线的测定及最佳细胞数确定
[0030]1)配制IP1标准稀释液:1P1标准溶液(试剂盒自带)逐级稀释。
[0031]2)配制Oleic acid梯度稀释液:需要用Oleic acid对细胞进行刺激，所以应将Oleic acid
[0032]储备液逐级稀释。
[0033]3)配制不同浓度的细胞稀释液:用IP1 stimulat1n buffer将1.(7)中重悬好的细胞分别稀释为 30000cells/well、15000cells/well 及 7500cells/well。
[0034]4)加样:将2.(1)中稀释好的IP1溶液按每个浓度1个复孔，10yL每孔加入384孔板中，再加入 1 孔 10yL的IP1 stimulat1n buffer作为negative control(NC);将2.(2)中稀释好的01 eic acid溶液按每个浓度2个复孔，5yL每孔加入384孔板中，再加入2孔每孔各5yL的IP1 stimulat1n buffer作为cell negative control(CNC)。接着向不同浓度的Oleicacid溶液及CNC中加入2.(3)配制好的不同浓度的细胞稀释液各5μL。将384孔板在500rpm下离心15s，使10yL试剂混合均勾以充分反应。为防止试剂蒸发造成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于室温下使之孵育60min。
[0035]5)终止试剂:用 conjugate&lysis buffer 将 IPl_d2con jugate 和 Ant1-1Plcryptate Tb conjugate进行稀释，配制好的IPl_d2conjugate和Ant1-1Plcryptate Tbcon jugate按1:1混勾后加入到其余各孔，每孔10yL。将384孔板在500rpm下离心15s，使20yL试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下继续孵育60min。
[0036]6)检测:孵育时间到达后，揭去TopSeal-A膜，将板放于设定好程序的Paradigm?Detect1n Platform上检测。处理数据，确定最佳细胞数。
[0037](3)激动剂验证
[0038]1)对Oleic acid进行梯度稀释。
[0039]2)配制含最佳细胞数的溶液:用IP1 stimulat1n buffer将1.(7)中重悬好的细胞稀释为2.(6)中得到的最佳细胞浓度。
[0040]3)加样:将3.(1)中稀释好的Oleic acid溶液按每个浓度2个复孔，5yL每孔加入384孔板中，再加入4孔每孔各5yL的IP1 stimulat1n buffer，其中2孔作为CNC，另2孔作为non-stimulated control (NSC)。将3.(2)配制的细胞溶液按每孔5yL加入384孔板中。将384孔板在500rpm下离心15s，使10yL试剂混合均勾以充分反应。为防止试剂蒸发造成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于室温下使之孵育60min。
[0041]4)按2.(5)配制终止试剂。配制好的 IPl_d2 con jugate 和 Ant1-1Pl cryptate Tbcon jugate按1:1混勾后加入到其余各孔，每孔10yL。将384孔板在500rpm下离心15s使20yL试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下继续孵育60min。
[0042]5)孵育时间到达后，揭去TopSeal-A膜，将板放于设定好程序的Beckman Paradigm上检测。处理数据，确定Oleic acid的EC50。
[0043]实验结果
[0044]以不同浓度的Oleic ac i d刺激使细胞产生cAMP。结果表明，384孔板中以30000CellS/well细胞数点板所产生的cAMP与信号的量效关系与标准曲线最吻合(见图1)。以不同浓度Oleic acid对30000cells/well CH0 GPR40进行实验(见图2、3、4)。验证了Oleic acid对GPR40的激动作用，其EC50=1.990e-005(见图5)。并表明采用本方法确定了稳转细胞株CH0 GPR40的激动剂药物筛选模型造模条件，实验结果稳定可靠，可以用于进行稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂的高通量筛选。
【主权项】
1.一种稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂高通量筛选模型，使用IP1对培养好细胞进行处理，检测最佳细胞数目，然后选用不同浓度Oleic acid对细胞进行刺激，并使其产生cAMP，确定Oleic acid的EC5Q。其特征在于确定了稳转细胞株CHO GPR40的激动剂药物筛选模型造模条件，每孔细胞数为30000cells，所得到Oleic acid刺激结果与标准曲线趋势最为一致。通过该模型验证了Oleic acid对GPR40的激动作用。
【专利摘要】一种利用荧光技术实现的稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂药物高通量筛选，本发明中利用IP1溶液对培养好的细胞进行处理并确定在384孔板中以最佳细胞数30000cells/well进行激动剂验证。从而确定了稳转细胞株CHO？GPR40的激动剂药物筛选模型造模条件，验证了Oleic？acid对GPR40的激动作用，其EC50＝1.990e-005。方法简便快捷；荧光检测值灵敏度高，提高检测精确度；结果稳定可靠，重现性好。
【IPC分类】G01N33/50
【公开号】CN105486850
【申请号】CN201510828101
【发明人】严明, 俞沁玮, 骆深玲, 张陆勇
【申请人】中国药科大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年11月20日
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