一种信号放大方法及相关装置的制造方法
一种信号放大方法及相关装置的制造方法
【技术领域】
[0001 ]本发明设及一种用于检测祀物质的信号放大方法及相关装置。
【背景技术】
[0002] 简单、灵敏、有效的检测技术在疾病诊断、新药开发、生化防御等领域意义重大。中 国专利CN 01822390.7公开了一种检测分析物的测试条测试法，该方法是首先对检测抗体 (祀向试剂)进行生物素(配体)化修饰，示踪颗粒标记了抗生物素抗体(标记物），运样在检 测过程中会形成"树枝状"结构，使检测信号得W放大。基于运一原理制备的乙肝表面抗原 检测试纸条较Abbott公司的乙肝表面抗原检测试纸条更为灵敏。中国专利CN200880132189 公开了一种免疫层析测试中信号放大的方法W及使用该方法的免疫层析试剂盒，该方法采 用两种不同粒径的偶联物超灵敏检测祀物质的信号方法，也是采用了树枝状信号放大技 术。
[0003] 现有的检测祀物质(或分析物)的信号放大方法只能针对一种祀物质进行分析，但 在检测领域，往往需要对样品中的多种祀物质进行超灵敏检测，方可作出准确可靠的判断， 现有的检测方法往往是每个项目单独检测，然后综合各个检测结果，得出检测结论，且需要 准备多种试纸条并采用多份样品进行测试。现有的联检方法都是在各个单检体系中寻找一 个折衷的体系建立起来的，运个折衷的体系往往是W牺牲检测灵敏性为代价的，所W目前 已有的联合同时检测方法的灵敏性往往不够理想，无法满足现实需要。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测祀物质的信号放大方法及相关 装置，该信号放大方法不但能够高灵敏检测祀物质，而且实现了多种祀物质的同时检测。 [000引本发明所要解决的技术问题通过W下技术方案予W实现： 一种检测祀物质的信号放大方法，包括： 将具有能特异性结合不同祀物质的多种第一分子的偶联体与多种祀物质结合，偶联体 还包括连接体、和与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒； 桥接体与偶联体的连接体结合，桥接体包括能特异性结合偶联体的连接体的第二分 子； 通过能特异性结合不同祀物质的多种第Ξ分子分别捕获与桥接体结合后的偶联体上 的多种祀物质。
[0006] -种检测祀物质的信号放大方法，包括： 将具有能特异性结合不同祀物质的多种第一分子的偶联体与多种祀物质结合，偶联体 还包括与多种第一分子结合的第一颗粒； 桥接体与偶联体的第一分子结合，所述桥接体包括能特异性结合偶联体的多种第一分 子的第二分子； 通过能特异性结合不同祀物质的多种第Ξ分子分别捕获与桥接体结合后的偶联体上 的多种祀物质。
[0007] 优选地，所述祀物质为蛋白质分子、蛋白质分子复合物、核酸、核酸复合物中的任 意一种。
[0008] -种检测祀物质的免疫层析试纸，包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第一结 合垫、层析膜、吸水垫;所述第一结合垫包被有偶联体和桥接体，其中该偶联体包括能特异 性结合不同祀物质的多种第一分子、连接体及与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒， 桥接体包括能特异性结合偶联体的连接体的第二分子;所述层析膜上不同区域的检测线固 定有能特异性结合不同祀物质的多种第Ξ分子。
[0009] -种检测祀物质的免疫层析试纸，包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第一结 合垫、层析膜、吸水垫;所述第一结合垫包被有偶联体和桥接体，其中该偶联体包括能特异 性结合不同祀物质的多种第一分子、和与多种第一分子结合的第一颗粒，桥接体包括能特 异性结合偶联体的连接体的第二分子;所述层析膜上不同区域的检测线固定有能特异性结 合不同祀物质的多种第Ξ分子。
[0010] -种检测祀物质的免疫层析试纸，包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第二结 合垫、第Ξ结合垫、层析膜、吸水垫;所述第Ξ结合垫包被有偶联体，该偶联体包括能特异性 结合不同祀物质的多种第一分子、连接体及与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒，所 述第二结合垫包被有具有能特异性结合偶联体的连接体的第二分子的桥接体;所述层析膜 上不同区域的检测线固定有能特异性结合不同祀物质的多种第Ξ分子。
[0011] -种检测祀物质的免疫层析试纸，包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第二结 合垫、第Ξ结合垫、层析膜、吸水垫;所述第Ξ结合垫包被有偶联体，该偶联体包括能特异性 结合不同祀物质的多种第一分子、和与多种第一分子结合的第一颗粒;所述第二结合垫包 被有具有能特异性结合偶联体的多种第一分子的第二分子的桥接体;所述层析膜上不同区 域的检测线固定有能特异性结合不同祀物质的多种第Ξ分子。
[0012] 优选地，所述第二结合垫与第Ξ结合垫调换位置顺序。
[0013] -种检测祀物质的免疫层析装置，包括反应微孔和免疫层析试纸，该免疫层析试 纸包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第四结合垫、层析膜、吸水垫;所述反应微孔含有 偶联体，该偶联体包括能特异性结合不同祀物质的多种第一分子、连接体及与多种第一分 子和连接体结合的第一颗粒;所述第四结合垫包被有具有能特异性结合偶联体的连接体的 第二分子的桥接体，所述层析膜上不同区域的检测线固定有能特异性结合不同祀物质的多 种第Ξ分子。
[0014] -种检测祀物质的免疫层析装置，包括反应微孔和免疫层析试纸，该免疫层析试 纸包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第四结合垫、层析膜、吸水垫;所述反应微孔含有 偶联体，该偶联体包括能特异性结合不同祀物质的多种第一分子、和与多种第一分子结合 的第一颗粒;所述第四结合垫包被有具有能特异性结合偶联体的多种第一分子的第二分子 的桥接体，所述层析膜上不同区域的检测线固定有能特异性结合不同祀物质的多种第Ξ分 子。
[0015] -种祀物质的免疫渗滤装置，由渗滤卡、封闭液、偶联体、桥接体、洗涂液组成，其 中渗滤卡由卡底、吸水垫料、渗滤膜、卡盖依次叠加组成，该免疫渗滤装置的检测方法包括 W下步骤： 1) 往渗滤膜上滴加一滴封闭液； 2) 液体滤过之后，滴加一滴血清样本； 3) 血清滤完之后，滴加一滴洗涂液； 4) 滤完之后滴加一滴权利要求1或2所述的偶联体、一滴权利要求1或2所述的桥接体； 5) 等液体滤完之后，滴加一滴洗涂液； 6) 滤完之后，观察结果； 其中，渗滤膜上不同区域的检测点固定有能特异性结合不同祀物质的多种第Ξ分子。
[0016] 本发明具有如下有益效果： 本发明的信号放大方法将具有能特异性结合不同祀物质的多种第一分子与样品中不 同祀物质结合后与桥接体结合，随后由位于固相上的能特异性结合不同祀物质的多种第Ξ 分子捕获固定，从而得到信号放大效果，不但能够高灵敏检测祀物质，而且实现了多种祀物 质的同时检测。同样，也使用该信号放大方法制造出了高灵敏度且同时检测多种祀物质的 免疫层析试纸条或免疫层析装置，其层析膜上不同区域上设有多个检测线，各个检测线的 夹屯、反应不会相互影响，达到了一份液体样品同时检测多种祀物质，且在同样条件下进行， 既节约了检测时间，也减小了检测误差，同时降低了检测成本。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明同时检测两种祀物质的信号放大的原理示意图； 图2为本发明一种使用该信号放大方法同时检测多种祀物质的免疫层析试纸的结构示 意图； 图3为本发明另一种使用该信号放大方法同时检测多种祀物质的免疫层析试纸的结构 示意图。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施 方式，不是对本发明的限定。
[0019] 本发明所提及的术语"连接体"表示通过特异性反应(如:抗原-抗体反应、核酸杂 交反应)与第Ξ分子特异性结合使得偶联体与桥接体结合的材料;术语"桥接体"表示通过 特异性反应(如:抗原-抗体反应、核酸杂交反应)与偶联体上的连接体或第一分子进行特异 性结合将偶联体桥接在一起形成树枝状结构的材料。
[0020] 本发明的信号放大方法中，偶联体包括多种第一分子、连接体及与多种第一分子 和连接体结合的第一颗粒，多种第一分子能分别特异性结合不同的祀物质;桥接体包括能 特异性结合偶联体的连接体的第二分子;在检测时，偶联体上多种第一分子与样品中的不 同祀物质结合，随后桥接体的第二分子与偶联体的连接体结合将偶联体桥接在一起形成多 个树枝状结构，该树枝状结构上含有多种不同的祀物质，位于固相上的能特异性结合不同 祀物质的多种第Ξ分子捕获该树枝状结构上的多种祀物质(偶联体的第一分子与位于固相 上的第Ξ分子分别结合同一祀物质上的不同位点），进而达到放大信号的目的。当桥接体的 第二分子可与偶联体的第一分子结合，则偶联体上可不含有连接体。
[0021] 所述祀物质可W为蛋白质分子、蛋白质分子复合物、核酸、核酸复合物中的任意一 种，还可w是其他能够发生特异性结合的分子。
[0022] 多种第一分子包括至少两种能特异性结合不同祀物质的单克隆抗体或多克隆抗 体，但不局限于抗体。多种第Ξ分子包括至少两种能特异性结合不同祀物质的单克隆抗体 或多克隆抗体，但不局限于抗体。所述第一分子和第Ξ分子可W相同或不同。
[0023] 连接体可W是蛋白质、核酸、多糖、肤等可W与桥接体发生特异性结合的材料。
[0024] 桥接体可W是能特异性结合偶联体的连接体或第一分子的第二分子，还可W是偶 联有能特异性结合偶联体的连接体或第 一分子的第二分子的第二颗粒。第一颗粒或第二颗 粒为金属颗粒、彩色乳胶颗粒、巧光颗粒中的一种，或者其他任何一种可W作为信号标记物 的颗粒。第一颗粒或第二颗粒的形状为球形、管状、棒状，或者多面体状中的任一种。第一颗 粒与第二颗粒可相同或不同。第一颗粒的粒径小于或等于第二颗粒的粒径。
[002引图1显示了本发明同时检测两种祀物质A1、A2的信号放大的原理，其中偶联体包括 连接体。参考图1，两种第一分子al、a2和连接体11与第一颗粒12结合形成偶联体1，第二分 子21和第二颗粒22结合形成桥接体2,两种第Ξ分子曰1'、曰2'分别位于固相上的不同区域 的检测位点或检测线上。检测时，偶联体1的两种第一分子al、a2分别与样品中的两种祀物 质A1、A2结合，随后偶联体1的连接体11与桥接体2的第二分子结合形成含有祀物质A1、A2的 树枝状结构，流经测试条时，树枝状结构上的祀物质A1、A2与检测位点上的第Ξ分子al'、 a2'结合W放大信号。
[0026] 请参考图2,本发明的一种使用该信号放大方法同时检测多种祀物质的免疫层析 试纸，包括依次搭接粘贴在底板3上的样品垫31、第一结合垫32、层析膜33、吸水垫34;所述 第一结合垫32包被有偶联体及桥接体，其中偶联体包括能特异性结合不同祀物质的多种第 一分子、连接体及与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒，桥接体包括能特异性结合偶 联体的连接体的第二分子;所述层析膜33上设置质控线C及在不同区域的检测线Τ(优选不 重叠的多个检测线1'1、了2'''化，11>2)分别固定有能特异性结合不同祀物质的多种第^分 子。若桥接体的第二分子可与偶联体的第一分子结合，则偶联体上可不含有连接体。
[0027] 请参考图3,本发明的另一种使用该信号放大方法同时检测多种祀物质的免疫层 析试纸，偶联体和桥接体分别位于不同的结合垫上，该免疫层析试纸包括依次搭接粘贴在 底板4上的样品垫41、第二结合垫42、第Ξ结合垫43、层析膜44、吸水垫45;所述第Ξ结合垫 43包被有偶联体，该偶联体包括能特异性结合不同祀物质的多种第一分子、连接体及与多 种第一分子和连接体结合的第一颗粒;所述第二结合垫42包被有桥接体，该桥接体包括能 特异性结合偶联体的连接体的第二分子;所述层析膜44上设置质控线C及在不同区域的检 测线Τ分别固定有能特异性结合不同祀物质的多种第Ξ分子。若桥接体的第二分子可与偶 联体的第一分子结合，则偶联体上可不含有连接体。在该免疫层析试纸上，第二结合垫42与 第Ξ结合垫43的位置顺序可调换。
[0028] 本发明还提供了一种使用该信号放大方法同时检测多种祀物质的免疫层析装置， 包括反应微孔和免疫层析试纸，该免疫层析试纸包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第 四结合垫、层析膜、吸水垫;所述反应微孔含有偶联体，该偶联体包括能特异性结合不同祀 物质的多种第一分子、连接体及与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒;所述第四结合 垫包被有能特异性结合偶联体的连接体的第二分子的桥接体，所述层析膜上设置质控线及 在不同区域的检测线分别固定有能特异性结合不同祀物质的多种第Ξ分子。若桥接体的第 二分子可与偶联体的第一分子结合，则偶联体上可不含有连接体。
[0029] 免疫层析用的垫可W是任何天然多孔材料或任何合成多孔材料，如硝酸纤维素或 聚醋纤维素形成的垫。
[0030] 样品垫用于吸收含有多种祀物质的液体样品，并经毛细作用将祀物质转移至结合 垫上;吸水垫可W是任何能充分吸收反应后残液的垫。
[0031] 第一结合垫上含有已干燥的偶联体和桥接体，偶联体与桥接体不相互接触。
[0032] 层析膜上不同区域上设有多个检测线或检测位点，且检测线或检测位点在垂直方 向上不重叠。每个检测位点或检测线固定有能特异性结合一种祀物质的第Ξ分子。质控线 位于检测线与吸水垫之间的层析膜上。
[0033] W下结合实施例对本发明做进一步描述。
[0034] 实施例1 免疫层析试纸条同时检测艾滋病毒P24蛋白和丙型肝炎病毒core蛋白 1、偶联体的制备:按照化ens法(1973)制备40nm胶体金颗粒;按照每毫升胶体金颗粒加 入化L 0.2M碳酸钟的量调节PH;按照每毫升胶体金颗粒加入祉g艾滋病毒P24蛋白单克隆抗 体I、化g丙型肝炎病毒core蛋白单克隆抗体I，室溫反应15min;加入牛血清白蛋白（BSA)，使 其终浓度为1%，室溫静置15min; lOOOOrpm离屯、lOmin;弃掉上清，加入1/10胶体金体积的重 悬液(1 OmM TriS (P册.0)，0.5%Tween20、0.4%酪蛋白、2%薦糖)重悬颗粒。
[003引2.桥接体的制备:按照Frens法（1973)制备20皿胶体金颗粒;按照每毫升胶体金 颗粒加入化L 0.2M碳酸钟的量调节PH;按照每毫升胶体金颗粒加入lOyg BSA的单克隆抗体 室溫反应15min;加入酪蛋白，使其终浓度为0.2%，室溫静置15min; 100(K)rpm离屯、lOmin;弃 掉上清，加入与胶体金体积相同的虫悬液（lOmM Tris(P册.0)、0.5%Tween20、0.4%酪蛋白、 8%薦糖)重悬颗粒。
[0036] 3.第Ξ结合垫的制备:按照扣L/cm喷偶联体于奥斯龙8964玻璃纤维素膜上，置于 37°C烘干，裁成0.4cm宽，备用。
[0037] 4.第二结合垫的制备:按照扣L/cm喷桥接体于奥斯龙8964玻璃纤维素膜上，置于 37°C烘干，裁成0.4cm宽，备用。
[0038] 5.层析膜的制备:按照化L/cm喷涂浓度为Img/mL的艾滋病毒P24蛋白单克隆抗体 Π 作为检测线T1，按照化L/cm喷涂浓度为2mg/mL的丙型肝炎病毒core蛋白多克隆抗体Π 作 为检测线T2，按照化L/cm喷涂浓度为0.2mg/mL的羊抗鼠 IgG作为质控线，置于室溫惊干，备 用。
[0039] 6.样品垫的制备：用[lOOmM Tris(P册.0)，0.5%Tween20]浸泡聚醋纤维素膜，置 于37°C烘干，裁成1.2cm宽，备用。
[0040] 7.试纸条的组装:将样品垫、第二结合垫、第Ξ结合垫、层析膜、吸水垫依次搭接 粘贴到PVC底板上，裁成3.5mm宽的试纸条，干燥保存，备用。
[0041] 8.试纸条的使用：1)样品处理：取血清样品，加入等体积的的样品处理液（0.3M 甘氨酸，l%Triton X100)，置于56°C30min; 2)取80化处理后的产物于样品垫上，lOmin后观 察结果(质控线不显色判定检测无效，否则只要检测线有红色出现即判定为阳性）。
[0042] 9.检测5648份血浆样本，本方法与美国化tho公司的丙型肝炎Core抗原检测试剂 盒化LISA)的符合率达到95.4%，与ZeptoMetrix公司的P24酶联免疫试剂盒的符合率达到 98.5〇/〇。
[0043] 实施例2 免疫层析试纸条同时检测布鲁氏菌脂多糖和大肠杆菌0157脂多糖 1.偶联体的制备:取1(Κ)化浓度为lOmg/mL的稀±巧光纳米颗粒(粒径:300皿)于90化1 MES( 50mM，PH6.1)中，满旋混匀；加入20mg NHS、20mg抓C，满旋混匀；室溫反应30min ; 1000化pm离屯、lOmin，弃上清；满旋重悬颗粒；加入布鲁氏菌脂多糖抗体12化g、大肠杆菌 0157脂多糖单克隆抗体15扣g，室溫反应2-4h;加入酪蛋白，使其终浓度为0.1%，继续反应2-地；10000巧m离屯、lOmin，弃上清；用PBST洗涂颗粒Ξ次；加入20血颗粒重悬液（1〇1111化13-肥1，1%BSA，5%海藻糖），重悬颗粒，备用。
[0044] 2.第Ξ结合垫的制备:按照扣L/cm喷偶联体与聚醋玻璃纤维素膜上，置于37°C烘 干，裁成0.4cm宽，备用。
[004引3.第二结合垫的制备：按照化L/cm喷桥接体（酪蛋白单克隆抗体，浓度为long/ mL)与聚醋纤维素膜上，置于37°C烘干，裁成0.4cm宽，备用。
[0046] 4.层析膜的制备：按照化L/cm喷涂浓度为1.5mg/mL的大肠杆菌0157单克隆抗体 Π 作为检测线T1，按照化L/cm喷涂浓度为1.2mg/mL的布鲁氏菌单克隆抗体Π 作为检测线 T2，按照化L/cm喷涂浓度为0.2mg/mL的羊抗鼠IgG作为质控线，置于室溫惊干，备用。
[0047] 5.样品垫的制备：用[lOOmM Tris(P册.0)，0.5%Tween20]浸泡聚醋纤维素膜，置 于37°C烘干，裁成1.2cm宽，备用。
[0048] 6.试纸条的组装：将样品垫、第二结合垫、第Ξ结合垫、层析膜、吸水垫依次搭接 粘贴到PVC底板上，裁成3.5mm宽的试纸条，干燥保存，备用。
[0049] 7.试纸条的使用：1)样品处理:取牛奶样品20化，用0.45μΜ滤膜过滤，用生理盐水 洗下滤膜上的菌体，置于l〇〇°C沸水浴10min;2)取80化处理后的产物于样品垫上，15min后 观察结果(质控线不显色判定检测无效，否则只要检测线有红色出现即判定为阳性）。
[0050] 8.本方法与检测梯度稀释的羊布鲁氏菌和大肠杆菌0157,其检测下限分别达到 102CFU/ML和101CFU/ML，显著优于目前的方法。[0051 ]实施例3 免疫层析试纸条检测禽流感流感病毒 1.偶联体的制备:取100化浓度为lOmg/mL的彩色乳胶颗粒，满旋混匀；加入册型禽流 感病毒单克隆抗体II扣g、H5型禽流感病毒单克隆抗体12扣g、朋型禽流感病毒单克隆抗体I 12yg，4°C过夜；加入BSA，使其终浓度为1%，37°C解育化；10000巧m离屯、lOmin，弃上清；用 PBST洗涂颗粒Ξ次;加入20mL颗粒重悬液（lOmM Tris-肥1,1%酪蛋白，3%海藻糖），重悬颗 粒，备用。
[0052] 2.第一结合垫的制备:按照祉L/cm喷偶联体与聚醋玻璃纤维素膜上，置于37°C烘 干;裁成0.4cm宽；按照扣L/cm喷桥接体(BSA单克隆抗体，浓度lOng/mL)，置于37°C烘干;备 用。
[0053] 3.层析膜的制备：按照化L/cm喷涂浓度为1.5mg/mL的册禽流感单克隆抗体Π 作 为检测线T1，按照化L/cm喷涂浓度为1.2mg/mL的H7禽流感单克隆抗体Π作为检测线T2，按 照化L/cm喷涂浓度为2mg/mL的H7禽流感多克隆抗体作为检测线T3，按照化L/cm喷涂浓度为 0.2mg/mL的羊抗鼠IgG作为质控线，置于室溫惊干，备用。
[0054] 4.样品垫的制备：用[lOOmM Tris(P册.0)、0.5%Tween20]浸泡聚醋纤维素膜，置 于37°C烘干，裁成1.2cm宽，备用。
[00曰引5.试纸条的组装:将样品垫、第一结合垫、层析膜、吸水垫依次搭接粘贴到PVC底 板上，裁成3.5mm宽的试纸条，干燥保存，备用。
[0056] 6.试纸条的使用：1)样品处理:取咽拭子，于2mL生理盐水中洗下上面的病毒；2) 取80化病毒样品于样品垫上，15min后观察结果（质控线不显色判定检测无效，否则只要检 测线有红色出现即判定为阳性）。
[0057] 7.用本试纸条检测97份禽流感咽拭子样本，从中检测出12份阳性，其中H7 2份，朋 3份，册7份。上述阳性样本经病毒培养检测均为阳性。采用IDEXX禽流感抗体检测试剂盒检 测，从中检测出53份禽流感阳性样本，经病毒培养检测，7份为阳性。
[005引 实施例4 免疫层析装置同时检测布鲁氏菌BP26蛋白和0MP31蛋白 1.偶联体的制备:取10化L浓度为lOmg/mL的金纳米棒，满旋混匀;加入BP26单克隆抗 体I扣g、0MP31单克隆抗体I5yg，4°C过夜;加入BSA，使其终浓度为1%，室溫解育2h;100(K)巧m 离屯、lOmin，弃上清；用PBST洗涂颗粒Ξ次；加入20mL颗粒重悬液（lOmM Tris-HCl ,1%酪蛋 白，3%海藻糖），重悬颗粒，备用。
[0059] 2.反应微孔的制备:取25化偶联体，加入微孔中，冻干，密封，备用。
[0060] 3.第四结合垫的制备：按照化L/cm喷桥接体(BSA单克隆抗体，浓度lOng/mL)，裁 成0.4cm宽；置于37°C烘干;备用。
[0061] 4.层析膜的制备：按照化L/cm喷涂浓度为1.5mg/mL的BP26单克隆抗体Π 作为检 测线T1，按照化L/cm喷涂浓度为1.8mg/mL的0MP31单克隆抗体Π 作为检测线T2，按照化L/cm 喷涂浓度为0.2mg/mL的羊抗鼠 IgG作为质控线，置于室溫惊干，备用。
[006引 5.样品垫的制备：用[lOOmM Tris(P册.0)、0.5%Tween20]浸泡聚醋纤维素膜，置 于37°C烘干，裁成1.2cm宽，备用。
[0063] 6.试纸条的组装:将样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫依次搭接粘贴到PVC底板上， 裁成3.5mm宽的试纸条，干燥保存，备用。
[0064] 7.试纸条的使用：1)样品处理:取牛奶样品20血，用0.45μΜ滤膜过滤，用生理盐水 洗下滤膜上的菌体，置于100°c沸水浴10min;2)取20化L处理后的产物于反应微孔中，混匀， 40°C解育3min，将试纸条的样品垫端插入反应微孔，15min后观察结果（质控线不显色判定 检测无效，否则只要检测线有红色出现即判定为阳性）。
[0065] 8.本方法检测150份牛奶样品（其中23份经分离培养法检测为阳性），与布鲁氏菌 分离培养法的吻合率达到100%。
[0066] 实施例5 免疫层析试纸同时检测HIV抗体和HCV抗体 1.偶联体的制备:按照Frens法（1973)制备30nm胶体金颗粒;按照每毫升胶体金颗粒 加入化L 0.2M碳酸钟的量调节PH;按照每毫升胶体金颗粒加入祉g HIV检测抗原(深圳菲鹏 生物）、llyg肥V检测抗原(深圳菲鹏生物），室溫反应15min;加入牛血清白蛋白（BSA)，使其 终浓度为1%，室溫静置15min;10000rpm离屯、lOmin;弃掉上清，加入1/10胶体金体积的重悬 液[1 OmM TriS (P册.0)，0.5%Tween20，0.4%酪蛋白 J%薦糖]重悬颗粒。
[0067] 2.桥接体的制备:按照Frens法（1973)制备20皿胶体金颗粒;按照每毫升胶体金 颗粒加入化L 0.2M碳酸钟的量调节PH;按照每毫升胶体金颗粒加入lOyg BSA的单克隆抗体 室溫反应15min;加入酪蛋白，使其终浓度为0.2%，室溫静置15min; 100(K)rpm离屯、lOmin;弃 掉上清，加入与胶体金体积相同的重悬液[lOmM Tri S(P册.0)，0.5%Tween20，0.4%酪蛋白、 2%薦糖]重悬颗粒。
[0068] 3.第Ξ结合垫的制备:按照扣L/cm喷偶联体于奥斯龙8964玻璃纤维素膜上，置于 37°C烘干，裁成0.4cm宽，备用。
[0069] 4.第二结合垫的制备:按照扣L/cm喷桥接体于奥斯龙8964玻璃纤维素膜上，置于 37°C烘干，裁成0.4cm宽，备用。
[0070] 5.层析膜的制备：按照化L/cm喷涂浓度为Img/mL的HIV包被抗体作为检测线T1， 按照lyL/cm喷涂浓度为2mg/mL的HCV包被抗体作为检测线T2,按照lyL/cm喷涂浓度为 0.2mg/mL的羊抗鼠 IgG作为质控线，置于室溫惊干，备用。
[00川 6.样品垫的制备：用[lOOmM Tris(P册.0)、0.5%Tween20]浸泡聚醋纤维素膜，置 于37°C烘干，裁成0.8cm宽，备用。
[0072] 7.试纸条的组装:将样品垫、第二结合垫、第Ξ结合垫、层析膜、吸水垫依次搭接 粘贴到PVC底板上，裁成3.5mm宽的试纸条，干燥保存，备用。
[0073] 8.试纸条的使用：取化L血清或血浆于样品垫上，加8化L生理盐水于样品垫上， lOmin后观察结果（质控线不显色判定检测无效，否则只要检测线有红色出现即判定为阳 性)。
[0074] 9.检测2546份血浆样本，本方法与Abbott公司的丙型肝炎HCV抗体检测微粒发光 试剂盒吻合率达到99.6%W上，与上海科华HIV抗体酶联免疫试剂盒吻合率达到99.3%。
[007引实施例6 同时检测沙口氏菌、大肠杆菌0157、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌 1.引物序列如下表所示：上下游引物的5'端分别有不同的半抗原分子标记（如生物 素)。
[0076] 2.PCR扩增体系：2.5化10XPCRBuffer，0.1化上下游引物（100nM)，2UTaq酶， 加水至23化;加入模板(DNA)2化;扩增条件:95°C 5min;94°C 5s，55°C40s，72°C40s; 30个循 环。
[0077] 3.偶联体的制备:按照Frens法（1973)制备30皿胶体金颗粒;按照每毫升胶体金 颗粒加入化L 0.2M碳酸钟的量调节PH;按照每毫升胶体金颗粒加入化g地高辛单克隆抗体、 3yg罗丹明B单克隆抗体、3yg肥X单克隆抗体、4yg切3抗体，室溫反应15min;加入牛血清白 蛋白（BSA)，使其终浓度为1%，室溫静置15min;10000rpm离屯、lOmin;弃掉上清，加入1/10胶 体金体积的重悬液[1 OmM TriS (P册.0)，0.5%Tween20，0.4%酪蛋白J%薦糖]重悬颗粒。
[0078] 4.桥接体的制备:按照Frens法（1973)制备20皿胶体金颗粒;按照每毫升胶体金 颗粒加入化L 0.2M碳酸钟的量调节PH;按照每毫升胶体金颗粒加入lOyg BSA的单克隆抗体 室溫反应15min;加入酪蛋白，使其终浓度为0.2%，室溫静置15min; 100(K)rpm离屯、lOmin;弃 掉上清，加入与胶体金体积相同的重悬液[lOmM TriS(P册.0)、0.5%Tween20、0.4%酪蛋白、 2%薦糖]重悬颗粒。
[0079] 5.第Ξ结合垫的制备:按照化L/cm喷偶联体于奥斯龙8964玻璃纤维素膜上，置于 37°C烘干，裁成0.4cm宽，备用。
[0080] 6.第二结合垫的制备:按照扣L/cm喷桥接体于奥斯龙8964玻璃纤维素膜上，置于 37°C烘干，裁成0.4cm宽，备用。
[0081] 7.层析膜的制备：按照化L/cm喷涂浓度为Img/mL的抗生物素单克隆抗体作为检 测线T1，按照化L/cm喷涂浓度为2mg/mL的抗FITC单克隆抗体作为检测线T2,按照化L/cm喷 涂浓度为Img/mL的抗 切5单克隆抗体作为检测线T3,按照化L/cm喷涂浓度为2mg/mL的抗FAM 单克隆抗体作为检测线T4，按照化L/cm喷涂浓度为0.2mg/mL的羊抗鼠 IgG作为质控线，置于 室溫惊干，备用。
[008引 8.样品垫的制备：用[lOOmM Tris(P册.0)、0.5%Tween20]浸泡聚醋纤维素膜，置 于37°C烘干，裁成0.8cm宽，备用。
[0083] 9.试纸条的组装:将样品垫、第二结合垫、第Ξ结合垫、层析膜、吸水垫依次搭接 粘贴到PVC底板上，裁成3.5mm宽的试纸条，干燥保存，备用。
[0084] 10.试纸条的使用:将PCR产物用生理盐水稀释5倍，取80化于样品垫上，5min后观 察结果(质控线不显色判定检测无效，否则只要检测线有红色出现即判定为阳性）。
[0085] 11.本方法与检测用生理盐水梯度稀释的菌体的灵敏性分别达到100c化/mL(金黄 色葡萄球菌）、lOlCFU/mUE. coli 0157 :H7)、102C即/mL(L.mono巧togenes)、100C即/mL(沙 口氏菌）。
[0086] 实施例6 免疫渗滤法检测流感病毒 1.偶联体的制备:按照Frens法（1973)制备40nm胶体金颗粒;按照每毫升胶体金颗粒 加入扣L 0.2M碳酸钟的量调节PH;按照每毫升胶体金颗粒加入8yg流感A病毒单克隆抗体I、 12yg流感B病毒单克隆抗体I，室溫反应15min;加入牛血清白蛋白（BSA)，使其终浓度为1%， 室溫静置15mi η; 1000化pm离屯、1 Omiη ;弃掉上清，加入等胶体金体积的重悬液[1 OmM PB (PH7.4)、0.4%酪蛋白、5%薦糖]重悬颗粒。
[0087] 2.桥接体的制备:按照Frens法（1973)制备20皿胶体金颗粒;按照每毫升胶体金 颗粒加入化L 0.2M碳酸钟的量调节PH;按照每毫升胶体金颗粒加入lOyg BSA的单克隆抗体 室溫反应15min;加入酪蛋白，使其终浓度为0.2%，室溫静置15min; 100(K)rpm离屯、lOmin;弃 掉上清，加入两倍胶体金体积的重悬液[lOmM PB(PH7.4)、0.4%酪蛋白、5%薦糖]重悬颗粒。
[0088] 3.渗滤膜的制备:按照0.扣L/点喷涂浓度为Img/mL的流感A病毒单克隆抗体Π 作 为检测点1，按照0.扣L/点喷涂浓度为1.5mg/mL的流感B病毒单克隆抗体Π 作为检测点2，按 照化L/点喷涂浓度为ο. 3mg/mL的羊抗鼠 IgG作为质控点，置于37°C惊干，备用。
[0089] 4.渗滤卡的组装:按照卡底、吸水垫料、渗滤膜、卡盖的次序组装渗滤卡，备用。
[0090] 5.检测：1)往滤膜上滴加一滴封闭液（20mM PB、0.5%酪蛋白）；2)液体滤过之后， 滴加一滴血清样本；3)血清滤完之后，滴加一滴洗涂液(PBST) ; 4)滤完之后滴加一滴偶联 体、一滴桥接体;5)等液体滤完之后，滴加一滴洗涂液(PBST) ; 6)滤完之后，观察结果（质控 点不显色判定检测无效，否则只要检测点有红色出现即判定为阳性）。
[0091] 6.分别采用上述流感病毒检测方法和北京万泰生物药业股份有限公司的甲型/乙 型流感病毒抗原检测试剂盒检测梯度稀释的流感A和流感B病毒阳性样本。检测结果显示， 本发明所公开的方法在灵敏性上具有明显优势。将流感A病毒阳性样本用生理盐水倍比稀 释，稀释512倍后本发明所公开的方法检测结果仍为阳性，而万泰的检测试剂盒检测稀释到 128倍的样本，检测结果为阴性。同样将将流感B病毒阳性样本用生理盐水倍比稀释，稀释 256倍后本发明所公开的方法检测结果仍为阳性，而万泰的检测试剂盒检测稀释到64倍的 样本，检测结果为阴性。
[0092] W上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能 因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技 术方案，均应落在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种信号放大方法，其用于检测靶物质，包括： 将具有能特异性结合不同靶物质的多种第一分子的偶联体与多种靶物质结合，偶联体 还包括连接体、和与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒； 桥接体与偶联体的连接体结合，桥接体包括能特异性结合偶联体的连接体的第二分 子； 通过能特异性结合不同靶物质的多种第三分子分别捕获与桥接体结合后的偶联体上 的多种靶物质。2. -种信号放大方法，其用于检测靶物质，包括： 将具有能特异性结合不同靶物质的多种第一分子的偶联体与多种靶物质结合，偶联体 还包括与多种第一分子结合的第一颗粒； 桥接体与偶联体的第一分子结合，所述桥接体包括能特异性结合偶联体的多种第一分 子的第二分子； 通过能特异性结合不同靶物质的多种第三分子分别捕获与桥接体结合后的偶联体上 的多种靶物质。3. -种检测靶物质的免疫层析试纸，包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第一结合 垫、层析膜、吸水垫;所述第一结合垫包被有偶联体和桥接体，其中该偶联体包括能特异性 结合不同靶物质的多种第一分子、连接体及与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒，桥 接体包括能特异性结合偶联体的连接体的第二分子;所述层析膜上不同区域的检测线固定 有能特异性结合不同靶物质的多种第三分子。4. 一种检测靶物质的免疫层析试纸，包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第一结合 垫、层析膜、吸水垫;所述第一结合垫包被有偶联体和桥接体，其中该偶联体包括能特异性 结合不同靶物质的多种第一分子、和与多种第一分子结合的第一颗粒，桥接体包括能特异 性结合偶联体的连接体的第二分子;所述层析膜上不同区域的检测线固定有能特异性结合 不同靶物质的多种第三分子。5. -种检测靶物质的免疫层析试纸，包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第二结合 垫、第三结合垫、层析膜、吸水垫;所述第三结合垫包被有偶联体，该偶联体包括能特异性结 合不同靶物质的多种第一分子、连接体及与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒，所述 第二结合垫包被有具有能特异性结合偶联体的连接体的第二分子的桥接体;所述层析膜上 不同区域的检测线固定有能特异性结合不同靶物质的多种第三分子。6. -种检测靶物质的免疫层析试纸，包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第二结合 垫、第三结合垫、层析膜、吸水垫;所述第三结合垫包被有偶联体，该偶联体包括能特异性结 合不同靶物质的多种第一分子、和与多种第一分子结合的第一颗粒;所述第二结合垫包被 有具有能特异性结合偶联体的多种第一分子的第二分子的桥接体;所述层析膜上不同区域 的检测线固定有能特异性结合不同靶物质的多种第三分子。7. 根据权利要求5或6所述的免疫层析试纸，其特征在于，所述第二结合垫与第三结合 垫调换位置顺序。8. -种检测靶物质的免疫层析装置，包括反应微孔和免疫层析试纸，该免疫层析试纸 包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第四结合垫、层析膜、吸水垫;所述反应微孔含有偶 联体，该偶联体包括能特异性结合不同靶物质的多种第一分子、连接体及与多种第一分子 和连接体结合的第一颗粒;所述第四结合垫包被有具有能特异性结合偶联体的连接体的第 二分子的桥接体，所述层析膜上不同区域的检测线固定有能特异性结合不同靶物质的多种 第三分子。9. 一种检测靶物质的免疫层析装置，包括反应微孔和免疫层析试纸，该免疫层析试纸 包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第四结合垫、层析膜、吸水垫;所述反应微孔含有偶 联体，该偶联体包括能特异性结合不同靶物质的多种第一分子、和与多种第一分子结合的 第一颗粒;所述第四结合垫包被有具有能特异性结合偶联体的多种第一分子的第二分子的 桥接体，所述层析膜上不同区域的检测线固定有能特异性结合不同靶物质的多种第三分 子。10. -种靶物质的免疫渗滤装置，由渗滤卡、封闭液、偶联体、桥接体、洗涤液组成，其中 渗滤卡由卡底、吸水垫料、渗滤膜、卡盖依次叠加组成，该免疫渗滤装置的检测方法包括以 下步骤： 往渗滤膜上滴加一滴封闭液； 液体滤过之后，滴加一滴血清样本； 血清滤完之后，滴加一滴洗涤液； 滤完之后滴加一滴权利要求1或2所述的偶联体、一滴权利要求1或2所述的桥接体； 等液体滤完之后，滴加一滴洗涤液； 滤完之后，观察结果； 其中，渗滤膜上不同区域的检测点固定有能特异性结合不同靶物质的多种第三分子。
【专利摘要】本发明公开了一种信号放大方法，其用于检测靶物质，包括：将具有能特异性结合不同靶物质的多种第一分子的偶联体与多种靶物质结合，偶联体还包括连接体、和与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒；桥接体与偶联体的连接体结合，桥接体包括能特异性结合偶联体的连接体的第二分子；通过能特异性结合不同靶物质的多种第三分子分别捕获与桥接体结合后的偶联体上的多种靶物质。当桥接体的第二分子可与偶联体的第一分子结合，则偶联体上可不含有连接体。本发明还公开了使用该信号放大方法的相关装置。该同时检测多种靶物质的信号放大方法不但能够高灵敏检测靶物质，而且实现了多种靶物质的同时检测。
【IPC分类】G01N33/53
【公开号】CN105486854
【申请号】CN201510632072
【发明人】黎诚耀, 李金峰, 张玲
【申请人】南方医科大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年9月29日
【技术领域】
[0001 ]本发明设及一种用于检测祀物质的信号放大方法及相关装置。
【背景技术】
[0002] 简单、灵敏、有效的检测技术在疾病诊断、新药开发、生化防御等领域意义重大。中 国专利CN 01822390.7公开了一种检测分析物的测试条测试法，该方法是首先对检测抗体 (祀向试剂)进行生物素(配体)化修饰，示踪颗粒标记了抗生物素抗体(标记物），运样在检 测过程中会形成"树枝状"结构，使检测信号得W放大。基于运一原理制备的乙肝表面抗原 检测试纸条较Abbott公司的乙肝表面抗原检测试纸条更为灵敏。中国专利CN200880132189 公开了一种免疫层析测试中信号放大的方法W及使用该方法的免疫层析试剂盒，该方法采 用两种不同粒径的偶联物超灵敏检测祀物质的信号方法，也是采用了树枝状信号放大技 术。
[0003] 现有的检测祀物质(或分析物)的信号放大方法只能针对一种祀物质进行分析，但 在检测领域，往往需要对样品中的多种祀物质进行超灵敏检测，方可作出准确可靠的判断， 现有的检测方法往往是每个项目单独检测，然后综合各个检测结果，得出检测结论，且需要 准备多种试纸条并采用多份样品进行测试。现有的联检方法都是在各个单检体系中寻找一 个折衷的体系建立起来的，运个折衷的体系往往是W牺牲检测灵敏性为代价的，所W目前 已有的联合同时检测方法的灵敏性往往不够理想，无法满足现实需要。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测祀物质的信号放大方法及相关 装置，该信号放大方法不但能够高灵敏检测祀物质，而且实现了多种祀物质的同时检测。 [000引本发明所要解决的技术问题通过W下技术方案予W实现： 一种检测祀物质的信号放大方法，包括： 将具有能特异性结合不同祀物质的多种第一分子的偶联体与多种祀物质结合，偶联体 还包括连接体、和与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒； 桥接体与偶联体的连接体结合，桥接体包括能特异性结合偶联体的连接体的第二分 子； 通过能特异性结合不同祀物质的多种第Ξ分子分别捕获与桥接体结合后的偶联体上 的多种祀物质。
[0006] -种检测祀物质的信号放大方法，包括： 将具有能特异性结合不同祀物质的多种第一分子的偶联体与多种祀物质结合，偶联体 还包括与多种第一分子结合的第一颗粒； 桥接体与偶联体的第一分子结合，所述桥接体包括能特异性结合偶联体的多种第一分 子的第二分子； 通过能特异性结合不同祀物质的多种第Ξ分子分别捕获与桥接体结合后的偶联体上 的多种祀物质。
[0007] 优选地，所述祀物质为蛋白质分子、蛋白质分子复合物、核酸、核酸复合物中的任 意一种。
[0008] -种检测祀物质的免疫层析试纸，包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第一结 合垫、层析膜、吸水垫;所述第一结合垫包被有偶联体和桥接体，其中该偶联体包括能特异 性结合不同祀物质的多种第一分子、连接体及与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒， 桥接体包括能特异性结合偶联体的连接体的第二分子;所述层析膜上不同区域的检测线固 定有能特异性结合不同祀物质的多种第Ξ分子。
[0009] -种检测祀物质的免疫层析试纸，包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第一结 合垫、层析膜、吸水垫;所述第一结合垫包被有偶联体和桥接体，其中该偶联体包括能特异 性结合不同祀物质的多种第一分子、和与多种第一分子结合的第一颗粒，桥接体包括能特 异性结合偶联体的连接体的第二分子;所述层析膜上不同区域的检测线固定有能特异性结 合不同祀物质的多种第Ξ分子。
[0010] -种检测祀物质的免疫层析试纸，包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第二结 合垫、第Ξ结合垫、层析膜、吸水垫;所述第Ξ结合垫包被有偶联体，该偶联体包括能特异性 结合不同祀物质的多种第一分子、连接体及与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒，所 述第二结合垫包被有具有能特异性结合偶联体的连接体的第二分子的桥接体;所述层析膜 上不同区域的检测线固定有能特异性结合不同祀物质的多种第Ξ分子。
[0011] -种检测祀物质的免疫层析试纸，包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第二结 合垫、第Ξ结合垫、层析膜、吸水垫;所述第Ξ结合垫包被有偶联体，该偶联体包括能特异性 结合不同祀物质的多种第一分子、和与多种第一分子结合的第一颗粒;所述第二结合垫包 被有具有能特异性结合偶联体的多种第一分子的第二分子的桥接体;所述层析膜上不同区 域的检测线固定有能特异性结合不同祀物质的多种第Ξ分子。
[0012] 优选地，所述第二结合垫与第Ξ结合垫调换位置顺序。
[0013] -种检测祀物质的免疫层析装置，包括反应微孔和免疫层析试纸，该免疫层析试 纸包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第四结合垫、层析膜、吸水垫;所述反应微孔含有 偶联体，该偶联体包括能特异性结合不同祀物质的多种第一分子、连接体及与多种第一分 子和连接体结合的第一颗粒;所述第四结合垫包被有具有能特异性结合偶联体的连接体的 第二分子的桥接体，所述层析膜上不同区域的检测线固定有能特异性结合不同祀物质的多 种第Ξ分子。
[0014] -种检测祀物质的免疫层析装置，包括反应微孔和免疫层析试纸，该免疫层析试 纸包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第四结合垫、层析膜、吸水垫;所述反应微孔含有 偶联体，该偶联体包括能特异性结合不同祀物质的多种第一分子、和与多种第一分子结合 的第一颗粒;所述第四结合垫包被有具有能特异性结合偶联体的多种第一分子的第二分子 的桥接体，所述层析膜上不同区域的检测线固定有能特异性结合不同祀物质的多种第Ξ分 子。
[0015] -种祀物质的免疫渗滤装置，由渗滤卡、封闭液、偶联体、桥接体、洗涂液组成，其 中渗滤卡由卡底、吸水垫料、渗滤膜、卡盖依次叠加组成，该免疫渗滤装置的检测方法包括 W下步骤： 1) 往渗滤膜上滴加一滴封闭液； 2) 液体滤过之后，滴加一滴血清样本； 3) 血清滤完之后，滴加一滴洗涂液； 4) 滤完之后滴加一滴权利要求1或2所述的偶联体、一滴权利要求1或2所述的桥接体； 5) 等液体滤完之后，滴加一滴洗涂液； 6) 滤完之后，观察结果； 其中，渗滤膜上不同区域的检测点固定有能特异性结合不同祀物质的多种第Ξ分子。
[0016] 本发明具有如下有益效果： 本发明的信号放大方法将具有能特异性结合不同祀物质的多种第一分子与样品中不 同祀物质结合后与桥接体结合，随后由位于固相上的能特异性结合不同祀物质的多种第Ξ 分子捕获固定，从而得到信号放大效果，不但能够高灵敏检测祀物质，而且实现了多种祀物 质的同时检测。同样，也使用该信号放大方法制造出了高灵敏度且同时检测多种祀物质的 免疫层析试纸条或免疫层析装置，其层析膜上不同区域上设有多个检测线，各个检测线的 夹屯、反应不会相互影响，达到了一份液体样品同时检测多种祀物质，且在同样条件下进行， 既节约了检测时间，也减小了检测误差，同时降低了检测成本。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明同时检测两种祀物质的信号放大的原理示意图； 图2为本发明一种使用该信号放大方法同时检测多种祀物质的免疫层析试纸的结构示 意图； 图3为本发明另一种使用该信号放大方法同时检测多种祀物质的免疫层析试纸的结构 示意图。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施 方式，不是对本发明的限定。
[0019] 本发明所提及的术语"连接体"表示通过特异性反应(如:抗原-抗体反应、核酸杂 交反应)与第Ξ分子特异性结合使得偶联体与桥接体结合的材料;术语"桥接体"表示通过 特异性反应(如:抗原-抗体反应、核酸杂交反应)与偶联体上的连接体或第一分子进行特异 性结合将偶联体桥接在一起形成树枝状结构的材料。
[0020] 本发明的信号放大方法中，偶联体包括多种第一分子、连接体及与多种第一分子 和连接体结合的第一颗粒，多种第一分子能分别特异性结合不同的祀物质;桥接体包括能 特异性结合偶联体的连接体的第二分子;在检测时，偶联体上多种第一分子与样品中的不 同祀物质结合，随后桥接体的第二分子与偶联体的连接体结合将偶联体桥接在一起形成多 个树枝状结构，该树枝状结构上含有多种不同的祀物质，位于固相上的能特异性结合不同 祀物质的多种第Ξ分子捕获该树枝状结构上的多种祀物质(偶联体的第一分子与位于固相 上的第Ξ分子分别结合同一祀物质上的不同位点），进而达到放大信号的目的。当桥接体的 第二分子可与偶联体的第一分子结合，则偶联体上可不含有连接体。
[0021] 所述祀物质可W为蛋白质分子、蛋白质分子复合物、核酸、核酸复合物中的任意一 种，还可w是其他能够发生特异性结合的分子。
[0022] 多种第一分子包括至少两种能特异性结合不同祀物质的单克隆抗体或多克隆抗 体，但不局限于抗体。多种第Ξ分子包括至少两种能特异性结合不同祀物质的单克隆抗体 或多克隆抗体，但不局限于抗体。所述第一分子和第Ξ分子可W相同或不同。
[0023] 连接体可W是蛋白质、核酸、多糖、肤等可W与桥接体发生特异性结合的材料。
[0024] 桥接体可W是能特异性结合偶联体的连接体或第一分子的第二分子，还可W是偶 联有能特异性结合偶联体的连接体或第 一分子的第二分子的第二颗粒。第一颗粒或第二颗 粒为金属颗粒、彩色乳胶颗粒、巧光颗粒中的一种，或者其他任何一种可W作为信号标记物 的颗粒。第一颗粒或第二颗粒的形状为球形、管状、棒状，或者多面体状中的任一种。第一颗 粒与第二颗粒可相同或不同。第一颗粒的粒径小于或等于第二颗粒的粒径。
[002引图1显示了本发明同时检测两种祀物质A1、A2的信号放大的原理，其中偶联体包括 连接体。参考图1，两种第一分子al、a2和连接体11与第一颗粒12结合形成偶联体1，第二分 子21和第二颗粒22结合形成桥接体2,两种第Ξ分子曰1'、曰2'分别位于固相上的不同区域 的检测位点或检测线上。检测时，偶联体1的两种第一分子al、a2分别与样品中的两种祀物 质A1、A2结合，随后偶联体1的连接体11与桥接体2的第二分子结合形成含有祀物质A1、A2的 树枝状结构，流经测试条时，树枝状结构上的祀物质A1、A2与检测位点上的第Ξ分子al'、 a2'结合W放大信号。
[0026] 请参考图2,本发明的一种使用该信号放大方法同时检测多种祀物质的免疫层析 试纸，包括依次搭接粘贴在底板3上的样品垫31、第一结合垫32、层析膜33、吸水垫34;所述 第一结合垫32包被有偶联体及桥接体，其中偶联体包括能特异性结合不同祀物质的多种第 一分子、连接体及与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒，桥接体包括能特异性结合偶 联体的连接体的第二分子;所述层析膜33上设置质控线C及在不同区域的检测线Τ(优选不 重叠的多个检测线1'1、了2'''化，11>2)分别固定有能特异性结合不同祀物质的多种第^分 子。若桥接体的第二分子可与偶联体的第一分子结合，则偶联体上可不含有连接体。
[0027] 请参考图3,本发明的另一种使用该信号放大方法同时检测多种祀物质的免疫层 析试纸，偶联体和桥接体分别位于不同的结合垫上，该免疫层析试纸包括依次搭接粘贴在 底板4上的样品垫41、第二结合垫42、第Ξ结合垫43、层析膜44、吸水垫45;所述第Ξ结合垫 43包被有偶联体，该偶联体包括能特异性结合不同祀物质的多种第一分子、连接体及与多 种第一分子和连接体结合的第一颗粒;所述第二结合垫42包被有桥接体，该桥接体包括能 特异性结合偶联体的连接体的第二分子;所述层析膜44上设置质控线C及在不同区域的检 测线Τ分别固定有能特异性结合不同祀物质的多种第Ξ分子。若桥接体的第二分子可与偶 联体的第一分子结合，则偶联体上可不含有连接体。在该免疫层析试纸上，第二结合垫42与 第Ξ结合垫43的位置顺序可调换。
[0028] 本发明还提供了一种使用该信号放大方法同时检测多种祀物质的免疫层析装置， 包括反应微孔和免疫层析试纸，该免疫层析试纸包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第 四结合垫、层析膜、吸水垫;所述反应微孔含有偶联体，该偶联体包括能特异性结合不同祀 物质的多种第一分子、连接体及与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒;所述第四结合 垫包被有能特异性结合偶联体的连接体的第二分子的桥接体，所述层析膜上设置质控线及 在不同区域的检测线分别固定有能特异性结合不同祀物质的多种第Ξ分子。若桥接体的第 二分子可与偶联体的第一分子结合，则偶联体上可不含有连接体。
[0029] 免疫层析用的垫可W是任何天然多孔材料或任何合成多孔材料，如硝酸纤维素或 聚醋纤维素形成的垫。
[0030] 样品垫用于吸收含有多种祀物质的液体样品，并经毛细作用将祀物质转移至结合 垫上;吸水垫可W是任何能充分吸收反应后残液的垫。
[0031] 第一结合垫上含有已干燥的偶联体和桥接体，偶联体与桥接体不相互接触。
[0032] 层析膜上不同区域上设有多个检测线或检测位点，且检测线或检测位点在垂直方 向上不重叠。每个检测位点或检测线固定有能特异性结合一种祀物质的第Ξ分子。质控线 位于检测线与吸水垫之间的层析膜上。
[0033] W下结合实施例对本发明做进一步描述。
[0034] 实施例1 免疫层析试纸条同时检测艾滋病毒P24蛋白和丙型肝炎病毒core蛋白 1、偶联体的制备:按照化ens法(1973)制备40nm胶体金颗粒;按照每毫升胶体金颗粒加 入化L 0.2M碳酸钟的量调节PH;按照每毫升胶体金颗粒加入祉g艾滋病毒P24蛋白单克隆抗 体I、化g丙型肝炎病毒core蛋白单克隆抗体I，室溫反应15min;加入牛血清白蛋白（BSA)，使 其终浓度为1%，室溫静置15min; lOOOOrpm离屯、lOmin;弃掉上清，加入1/10胶体金体积的重 悬液(1 OmM TriS (P册.0)，0.5%Tween20、0.4%酪蛋白、2%薦糖)重悬颗粒。
[003引2.桥接体的制备:按照Frens法（1973)制备20皿胶体金颗粒;按照每毫升胶体金 颗粒加入化L 0.2M碳酸钟的量调节PH;按照每毫升胶体金颗粒加入lOyg BSA的单克隆抗体 室溫反应15min;加入酪蛋白，使其终浓度为0.2%，室溫静置15min; 100(K)rpm离屯、lOmin;弃 掉上清，加入与胶体金体积相同的虫悬液（lOmM Tris(P册.0)、0.5%Tween20、0.4%酪蛋白、 8%薦糖)重悬颗粒。
[0036] 3.第Ξ结合垫的制备:按照扣L/cm喷偶联体于奥斯龙8964玻璃纤维素膜上，置于 37°C烘干，裁成0.4cm宽，备用。
[0037] 4.第二结合垫的制备:按照扣L/cm喷桥接体于奥斯龙8964玻璃纤维素膜上，置于 37°C烘干，裁成0.4cm宽，备用。
[0038] 5.层析膜的制备:按照化L/cm喷涂浓度为Img/mL的艾滋病毒P24蛋白单克隆抗体 Π 作为检测线T1，按照化L/cm喷涂浓度为2mg/mL的丙型肝炎病毒core蛋白多克隆抗体Π 作 为检测线T2，按照化L/cm喷涂浓度为0.2mg/mL的羊抗鼠 IgG作为质控线，置于室溫惊干，备 用。
[0039] 6.样品垫的制备：用[lOOmM Tris(P册.0)，0.5%Tween20]浸泡聚醋纤维素膜，置 于37°C烘干，裁成1.2cm宽，备用。
[0040] 7.试纸条的组装:将样品垫、第二结合垫、第Ξ结合垫、层析膜、吸水垫依次搭接 粘贴到PVC底板上，裁成3.5mm宽的试纸条，干燥保存，备用。
[0041] 8.试纸条的使用：1)样品处理：取血清样品，加入等体积的的样品处理液（0.3M 甘氨酸，l%Triton X100)，置于56°C30min; 2)取80化处理后的产物于样品垫上，lOmin后观 察结果(质控线不显色判定检测无效，否则只要检测线有红色出现即判定为阳性）。
[0042] 9.检测5648份血浆样本，本方法与美国化tho公司的丙型肝炎Core抗原检测试剂 盒化LISA)的符合率达到95.4%，与ZeptoMetrix公司的P24酶联免疫试剂盒的符合率达到 98.5〇/〇。
[0043] 实施例2 免疫层析试纸条同时检测布鲁氏菌脂多糖和大肠杆菌0157脂多糖 1.偶联体的制备:取1(Κ)化浓度为lOmg/mL的稀±巧光纳米颗粒(粒径:300皿)于90化1 MES( 50mM，PH6.1)中，满旋混匀；加入20mg NHS、20mg抓C，满旋混匀；室溫反应30min ; 1000化pm离屯、lOmin，弃上清；满旋重悬颗粒；加入布鲁氏菌脂多糖抗体12化g、大肠杆菌 0157脂多糖单克隆抗体15扣g，室溫反应2-4h;加入酪蛋白，使其终浓度为0.1%，继续反应2-地；10000巧m离屯、lOmin，弃上清；用PBST洗涂颗粒Ξ次；加入20血颗粒重悬液（1〇1111化13-肥1，1%BSA，5%海藻糖），重悬颗粒，备用。
[0044] 2.第Ξ结合垫的制备:按照扣L/cm喷偶联体与聚醋玻璃纤维素膜上，置于37°C烘 干，裁成0.4cm宽，备用。
[004引3.第二结合垫的制备：按照化L/cm喷桥接体（酪蛋白单克隆抗体，浓度为long/ mL)与聚醋纤维素膜上，置于37°C烘干，裁成0.4cm宽，备用。
[0046] 4.层析膜的制备：按照化L/cm喷涂浓度为1.5mg/mL的大肠杆菌0157单克隆抗体 Π 作为检测线T1，按照化L/cm喷涂浓度为1.2mg/mL的布鲁氏菌单克隆抗体Π 作为检测线 T2，按照化L/cm喷涂浓度为0.2mg/mL的羊抗鼠IgG作为质控线，置于室溫惊干，备用。
[0047] 5.样品垫的制备：用[lOOmM Tris(P册.0)，0.5%Tween20]浸泡聚醋纤维素膜，置 于37°C烘干，裁成1.2cm宽，备用。
[0048] 6.试纸条的组装：将样品垫、第二结合垫、第Ξ结合垫、层析膜、吸水垫依次搭接 粘贴到PVC底板上，裁成3.5mm宽的试纸条，干燥保存，备用。
[0049] 7.试纸条的使用：1)样品处理:取牛奶样品20化，用0.45μΜ滤膜过滤，用生理盐水 洗下滤膜上的菌体，置于l〇〇°C沸水浴10min;2)取80化处理后的产物于样品垫上，15min后 观察结果(质控线不显色判定检测无效，否则只要检测线有红色出现即判定为阳性）。
[0050] 8.本方法与检测梯度稀释的羊布鲁氏菌和大肠杆菌0157,其检测下限分别达到 102CFU/ML和101CFU/ML，显著优于目前的方法。[0051 ]实施例3 免疫层析试纸条检测禽流感流感病毒 1.偶联体的制备:取100化浓度为lOmg/mL的彩色乳胶颗粒，满旋混匀；加入册型禽流 感病毒单克隆抗体II扣g、H5型禽流感病毒单克隆抗体12扣g、朋型禽流感病毒单克隆抗体I 12yg，4°C过夜；加入BSA，使其终浓度为1%，37°C解育化；10000巧m离屯、lOmin，弃上清；用 PBST洗涂颗粒Ξ次;加入20mL颗粒重悬液（lOmM Tris-肥1,1%酪蛋白，3%海藻糖），重悬颗 粒，备用。
[0052] 2.第一结合垫的制备:按照祉L/cm喷偶联体与聚醋玻璃纤维素膜上，置于37°C烘 干;裁成0.4cm宽；按照扣L/cm喷桥接体(BSA单克隆抗体，浓度lOng/mL)，置于37°C烘干;备 用。
[0053] 3.层析膜的制备：按照化L/cm喷涂浓度为1.5mg/mL的册禽流感单克隆抗体Π 作 为检测线T1，按照化L/cm喷涂浓度为1.2mg/mL的H7禽流感单克隆抗体Π作为检测线T2，按 照化L/cm喷涂浓度为2mg/mL的H7禽流感多克隆抗体作为检测线T3，按照化L/cm喷涂浓度为 0.2mg/mL的羊抗鼠IgG作为质控线，置于室溫惊干，备用。
[0054] 4.样品垫的制备：用[lOOmM Tris(P册.0)、0.5%Tween20]浸泡聚醋纤维素膜，置 于37°C烘干，裁成1.2cm宽，备用。
[00曰引5.试纸条的组装:将样品垫、第一结合垫、层析膜、吸水垫依次搭接粘贴到PVC底 板上，裁成3.5mm宽的试纸条，干燥保存，备用。
[0056] 6.试纸条的使用：1)样品处理:取咽拭子，于2mL生理盐水中洗下上面的病毒；2) 取80化病毒样品于样品垫上，15min后观察结果（质控线不显色判定检测无效，否则只要检 测线有红色出现即判定为阳性）。
[0057] 7.用本试纸条检测97份禽流感咽拭子样本，从中检测出12份阳性，其中H7 2份，朋 3份，册7份。上述阳性样本经病毒培养检测均为阳性。采用IDEXX禽流感抗体检测试剂盒检 测，从中检测出53份禽流感阳性样本，经病毒培养检测，7份为阳性。
[005引 实施例4 免疫层析装置同时检测布鲁氏菌BP26蛋白和0MP31蛋白 1.偶联体的制备:取10化L浓度为lOmg/mL的金纳米棒，满旋混匀;加入BP26单克隆抗 体I扣g、0MP31单克隆抗体I5yg，4°C过夜;加入BSA，使其终浓度为1%，室溫解育2h;100(K)巧m 离屯、lOmin，弃上清；用PBST洗涂颗粒Ξ次；加入20mL颗粒重悬液（lOmM Tris-HCl ,1%酪蛋 白，3%海藻糖），重悬颗粒，备用。
[0059] 2.反应微孔的制备:取25化偶联体，加入微孔中，冻干，密封，备用。
[0060] 3.第四结合垫的制备：按照化L/cm喷桥接体(BSA单克隆抗体，浓度lOng/mL)，裁 成0.4cm宽；置于37°C烘干;备用。
[0061] 4.层析膜的制备：按照化L/cm喷涂浓度为1.5mg/mL的BP26单克隆抗体Π 作为检 测线T1，按照化L/cm喷涂浓度为1.8mg/mL的0MP31单克隆抗体Π 作为检测线T2，按照化L/cm 喷涂浓度为0.2mg/mL的羊抗鼠 IgG作为质控线，置于室溫惊干，备用。
[006引 5.样品垫的制备：用[lOOmM Tris(P册.0)、0.5%Tween20]浸泡聚醋纤维素膜，置 于37°C烘干，裁成1.2cm宽，备用。
[0063] 6.试纸条的组装:将样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫依次搭接粘贴到PVC底板上， 裁成3.5mm宽的试纸条，干燥保存，备用。
[0064] 7.试纸条的使用：1)样品处理:取牛奶样品20血，用0.45μΜ滤膜过滤，用生理盐水 洗下滤膜上的菌体，置于100°c沸水浴10min;2)取20化L处理后的产物于反应微孔中，混匀， 40°C解育3min，将试纸条的样品垫端插入反应微孔，15min后观察结果（质控线不显色判定 检测无效，否则只要检测线有红色出现即判定为阳性）。
[0065] 8.本方法检测150份牛奶样品（其中23份经分离培养法检测为阳性），与布鲁氏菌 分离培养法的吻合率达到100%。
[0066] 实施例5 免疫层析试纸同时检测HIV抗体和HCV抗体 1.偶联体的制备:按照Frens法（1973)制备30nm胶体金颗粒;按照每毫升胶体金颗粒 加入化L 0.2M碳酸钟的量调节PH;按照每毫升胶体金颗粒加入祉g HIV检测抗原(深圳菲鹏 生物）、llyg肥V检测抗原(深圳菲鹏生物），室溫反应15min;加入牛血清白蛋白（BSA)，使其 终浓度为1%，室溫静置15min;10000rpm离屯、lOmin;弃掉上清，加入1/10胶体金体积的重悬 液[1 OmM TriS (P册.0)，0.5%Tween20，0.4%酪蛋白 J%薦糖]重悬颗粒。
[0067] 2.桥接体的制备:按照Frens法（1973)制备20皿胶体金颗粒;按照每毫升胶体金 颗粒加入化L 0.2M碳酸钟的量调节PH;按照每毫升胶体金颗粒加入lOyg BSA的单克隆抗体 室溫反应15min;加入酪蛋白，使其终浓度为0.2%，室溫静置15min; 100(K)rpm离屯、lOmin;弃 掉上清，加入与胶体金体积相同的重悬液[lOmM Tri S(P册.0)，0.5%Tween20，0.4%酪蛋白、 2%薦糖]重悬颗粒。
[0068] 3.第Ξ结合垫的制备:按照扣L/cm喷偶联体于奥斯龙8964玻璃纤维素膜上，置于 37°C烘干，裁成0.4cm宽，备用。
[0069] 4.第二结合垫的制备:按照扣L/cm喷桥接体于奥斯龙8964玻璃纤维素膜上，置于 37°C烘干，裁成0.4cm宽，备用。
[0070] 5.层析膜的制备：按照化L/cm喷涂浓度为Img/mL的HIV包被抗体作为检测线T1， 按照lyL/cm喷涂浓度为2mg/mL的HCV包被抗体作为检测线T2,按照lyL/cm喷涂浓度为 0.2mg/mL的羊抗鼠 IgG作为质控线，置于室溫惊干，备用。
[00川 6.样品垫的制备：用[lOOmM Tris(P册.0)、0.5%Tween20]浸泡聚醋纤维素膜，置 于37°C烘干，裁成0.8cm宽，备用。
[0072] 7.试纸条的组装:将样品垫、第二结合垫、第Ξ结合垫、层析膜、吸水垫依次搭接 粘贴到PVC底板上，裁成3.5mm宽的试纸条，干燥保存，备用。
[0073] 8.试纸条的使用：取化L血清或血浆于样品垫上，加8化L生理盐水于样品垫上， lOmin后观察结果（质控线不显色判定检测无效，否则只要检测线有红色出现即判定为阳 性)。
[0074] 9.检测2546份血浆样本，本方法与Abbott公司的丙型肝炎HCV抗体检测微粒发光 试剂盒吻合率达到99.6%W上，与上海科华HIV抗体酶联免疫试剂盒吻合率达到99.3%。
[007引实施例6 同时检测沙口氏菌、大肠杆菌0157、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌 1.引物序列如下表所示：上下游引物的5'端分别有不同的半抗原分子标记（如生物 素)。
[0076] 2.PCR扩增体系：2.5化10XPCRBuffer，0.1化上下游引物（100nM)，2UTaq酶， 加水至23化;加入模板(DNA)2化;扩增条件:95°C 5min;94°C 5s，55°C40s，72°C40s; 30个循 环。
[0077] 3.偶联体的制备:按照Frens法（1973)制备30皿胶体金颗粒;按照每毫升胶体金 颗粒加入化L 0.2M碳酸钟的量调节PH;按照每毫升胶体金颗粒加入化g地高辛单克隆抗体、 3yg罗丹明B单克隆抗体、3yg肥X单克隆抗体、4yg切3抗体，室溫反应15min;加入牛血清白 蛋白（BSA)，使其终浓度为1%，室溫静置15min;10000rpm离屯、lOmin;弃掉上清，加入1/10胶 体金体积的重悬液[1 OmM TriS (P册.0)，0.5%Tween20，0.4%酪蛋白J%薦糖]重悬颗粒。
[0078] 4.桥接体的制备:按照Frens法（1973)制备20皿胶体金颗粒;按照每毫升胶体金 颗粒加入化L 0.2M碳酸钟的量调节PH;按照每毫升胶体金颗粒加入lOyg BSA的单克隆抗体 室溫反应15min;加入酪蛋白，使其终浓度为0.2%，室溫静置15min; 100(K)rpm离屯、lOmin;弃 掉上清，加入与胶体金体积相同的重悬液[lOmM TriS(P册.0)、0.5%Tween20、0.4%酪蛋白、 2%薦糖]重悬颗粒。
[0079] 5.第Ξ结合垫的制备:按照化L/cm喷偶联体于奥斯龙8964玻璃纤维素膜上，置于 37°C烘干，裁成0.4cm宽，备用。
[0080] 6.第二结合垫的制备:按照扣L/cm喷桥接体于奥斯龙8964玻璃纤维素膜上，置于 37°C烘干，裁成0.4cm宽，备用。
[0081] 7.层析膜的制备：按照化L/cm喷涂浓度为Img/mL的抗生物素单克隆抗体作为检 测线T1，按照化L/cm喷涂浓度为2mg/mL的抗FITC单克隆抗体作为检测线T2,按照化L/cm喷 涂浓度为Img/mL的抗 切5单克隆抗体作为检测线T3,按照化L/cm喷涂浓度为2mg/mL的抗FAM 单克隆抗体作为检测线T4，按照化L/cm喷涂浓度为0.2mg/mL的羊抗鼠 IgG作为质控线，置于 室溫惊干，备用。
[008引 8.样品垫的制备：用[lOOmM Tris(P册.0)、0.5%Tween20]浸泡聚醋纤维素膜，置 于37°C烘干，裁成0.8cm宽，备用。
[0083] 9.试纸条的组装:将样品垫、第二结合垫、第Ξ结合垫、层析膜、吸水垫依次搭接 粘贴到PVC底板上，裁成3.5mm宽的试纸条，干燥保存，备用。
[0084] 10.试纸条的使用:将PCR产物用生理盐水稀释5倍，取80化于样品垫上，5min后观 察结果(质控线不显色判定检测无效，否则只要检测线有红色出现即判定为阳性）。
[0085] 11.本方法与检测用生理盐水梯度稀释的菌体的灵敏性分别达到100c化/mL(金黄 色葡萄球菌）、lOlCFU/mUE. coli 0157 :H7)、102C即/mL(L.mono巧togenes)、100C即/mL(沙 口氏菌）。
[0086] 实施例6 免疫渗滤法检测流感病毒 1.偶联体的制备:按照Frens法（1973)制备40nm胶体金颗粒;按照每毫升胶体金颗粒 加入扣L 0.2M碳酸钟的量调节PH;按照每毫升胶体金颗粒加入8yg流感A病毒单克隆抗体I、 12yg流感B病毒单克隆抗体I，室溫反应15min;加入牛血清白蛋白（BSA)，使其终浓度为1%， 室溫静置15mi η; 1000化pm离屯、1 Omiη ;弃掉上清，加入等胶体金体积的重悬液[1 OmM PB (PH7.4)、0.4%酪蛋白、5%薦糖]重悬颗粒。
[0087] 2.桥接体的制备:按照Frens法（1973)制备20皿胶体金颗粒;按照每毫升胶体金 颗粒加入化L 0.2M碳酸钟的量调节PH;按照每毫升胶体金颗粒加入lOyg BSA的单克隆抗体 室溫反应15min;加入酪蛋白，使其终浓度为0.2%，室溫静置15min; 100(K)rpm离屯、lOmin;弃 掉上清，加入两倍胶体金体积的重悬液[lOmM PB(PH7.4)、0.4%酪蛋白、5%薦糖]重悬颗粒。
[0088] 3.渗滤膜的制备:按照0.扣L/点喷涂浓度为Img/mL的流感A病毒单克隆抗体Π 作 为检测点1，按照0.扣L/点喷涂浓度为1.5mg/mL的流感B病毒单克隆抗体Π 作为检测点2，按 照化L/点喷涂浓度为ο. 3mg/mL的羊抗鼠 IgG作为质控点，置于37°C惊干，备用。
[0089] 4.渗滤卡的组装:按照卡底、吸水垫料、渗滤膜、卡盖的次序组装渗滤卡，备用。
[0090] 5.检测：1)往滤膜上滴加一滴封闭液（20mM PB、0.5%酪蛋白）；2)液体滤过之后， 滴加一滴血清样本；3)血清滤完之后，滴加一滴洗涂液(PBST) ; 4)滤完之后滴加一滴偶联 体、一滴桥接体;5)等液体滤完之后，滴加一滴洗涂液(PBST) ; 6)滤完之后，观察结果（质控 点不显色判定检测无效，否则只要检测点有红色出现即判定为阳性）。
[0091] 6.分别采用上述流感病毒检测方法和北京万泰生物药业股份有限公司的甲型/乙 型流感病毒抗原检测试剂盒检测梯度稀释的流感A和流感B病毒阳性样本。检测结果显示， 本发明所公开的方法在灵敏性上具有明显优势。将流感A病毒阳性样本用生理盐水倍比稀 释，稀释512倍后本发明所公开的方法检测结果仍为阳性，而万泰的检测试剂盒检测稀释到 128倍的样本，检测结果为阴性。同样将将流感B病毒阳性样本用生理盐水倍比稀释，稀释 256倍后本发明所公开的方法检测结果仍为阳性，而万泰的检测试剂盒检测稀释到64倍的 样本，检测结果为阴性。
[0092] W上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能 因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技 术方案，均应落在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种信号放大方法，其用于检测靶物质，包括： 将具有能特异性结合不同靶物质的多种第一分子的偶联体与多种靶物质结合，偶联体 还包括连接体、和与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒； 桥接体与偶联体的连接体结合，桥接体包括能特异性结合偶联体的连接体的第二分 子； 通过能特异性结合不同靶物质的多种第三分子分别捕获与桥接体结合后的偶联体上 的多种靶物质。2. -种信号放大方法，其用于检测靶物质，包括： 将具有能特异性结合不同靶物质的多种第一分子的偶联体与多种靶物质结合，偶联体 还包括与多种第一分子结合的第一颗粒； 桥接体与偶联体的第一分子结合，所述桥接体包括能特异性结合偶联体的多种第一分 子的第二分子； 通过能特异性结合不同靶物质的多种第三分子分别捕获与桥接体结合后的偶联体上 的多种靶物质。3. -种检测靶物质的免疫层析试纸，包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第一结合 垫、层析膜、吸水垫;所述第一结合垫包被有偶联体和桥接体，其中该偶联体包括能特异性 结合不同靶物质的多种第一分子、连接体及与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒，桥 接体包括能特异性结合偶联体的连接体的第二分子;所述层析膜上不同区域的检测线固定 有能特异性结合不同靶物质的多种第三分子。4. 一种检测靶物质的免疫层析试纸，包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第一结合 垫、层析膜、吸水垫;所述第一结合垫包被有偶联体和桥接体，其中该偶联体包括能特异性 结合不同靶物质的多种第一分子、和与多种第一分子结合的第一颗粒，桥接体包括能特异 性结合偶联体的连接体的第二分子;所述层析膜上不同区域的检测线固定有能特异性结合 不同靶物质的多种第三分子。5. -种检测靶物质的免疫层析试纸，包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第二结合 垫、第三结合垫、层析膜、吸水垫;所述第三结合垫包被有偶联体，该偶联体包括能特异性结 合不同靶物质的多种第一分子、连接体及与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒，所述 第二结合垫包被有具有能特异性结合偶联体的连接体的第二分子的桥接体;所述层析膜上 不同区域的检测线固定有能特异性结合不同靶物质的多种第三分子。6. -种检测靶物质的免疫层析试纸，包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第二结合 垫、第三结合垫、层析膜、吸水垫;所述第三结合垫包被有偶联体，该偶联体包括能特异性结 合不同靶物质的多种第一分子、和与多种第一分子结合的第一颗粒;所述第二结合垫包被 有具有能特异性结合偶联体的多种第一分子的第二分子的桥接体;所述层析膜上不同区域 的检测线固定有能特异性结合不同靶物质的多种第三分子。7. 根据权利要求5或6所述的免疫层析试纸，其特征在于，所述第二结合垫与第三结合 垫调换位置顺序。8. -种检测靶物质的免疫层析装置，包括反应微孔和免疫层析试纸，该免疫层析试纸 包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第四结合垫、层析膜、吸水垫;所述反应微孔含有偶 联体，该偶联体包括能特异性结合不同靶物质的多种第一分子、连接体及与多种第一分子 和连接体结合的第一颗粒;所述第四结合垫包被有具有能特异性结合偶联体的连接体的第 二分子的桥接体，所述层析膜上不同区域的检测线固定有能特异性结合不同靶物质的多种 第三分子。9. 一种检测靶物质的免疫层析装置，包括反应微孔和免疫层析试纸，该免疫层析试纸 包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第四结合垫、层析膜、吸水垫;所述反应微孔含有偶 联体，该偶联体包括能特异性结合不同靶物质的多种第一分子、和与多种第一分子结合的 第一颗粒;所述第四结合垫包被有具有能特异性结合偶联体的多种第一分子的第二分子的 桥接体，所述层析膜上不同区域的检测线固定有能特异性结合不同靶物质的多种第三分 子。10. -种靶物质的免疫渗滤装置，由渗滤卡、封闭液、偶联体、桥接体、洗涤液组成，其中 渗滤卡由卡底、吸水垫料、渗滤膜、卡盖依次叠加组成，该免疫渗滤装置的检测方法包括以 下步骤： 往渗滤膜上滴加一滴封闭液； 液体滤过之后，滴加一滴血清样本； 血清滤完之后，滴加一滴洗涤液； 滤完之后滴加一滴权利要求1或2所述的偶联体、一滴权利要求1或2所述的桥接体； 等液体滤完之后，滴加一滴洗涤液； 滤完之后，观察结果； 其中，渗滤膜上不同区域的检测点固定有能特异性结合不同靶物质的多种第三分子。
【专利摘要】本发明公开了一种信号放大方法，其用于检测靶物质，包括：将具有能特异性结合不同靶物质的多种第一分子的偶联体与多种靶物质结合，偶联体还包括连接体、和与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒；桥接体与偶联体的连接体结合，桥接体包括能特异性结合偶联体的连接体的第二分子；通过能特异性结合不同靶物质的多种第三分子分别捕获与桥接体结合后的偶联体上的多种靶物质。当桥接体的第二分子可与偶联体的第一分子结合，则偶联体上可不含有连接体。本发明还公开了使用该信号放大方法的相关装置。该同时检测多种靶物质的信号放大方法不但能够高灵敏检测靶物质，而且实现了多种靶物质的同时检测。
【IPC分类】G01N33/53
【公开号】CN105486854
【申请号】CN201510632072
【发明人】黎诚耀, 李金峰, 张玲
【申请人】南方医科大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年9月29日
最新回复(0)