一种新型改进免疫层析试纸条及其制备和应用
一种新型改进免疫层析试纸条及其制备和应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物技术领域，具体来说，设及一种新型改进免疫层析试纸条构建及 其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 免疫层析法是二十世纪九十年代兴起的快速诊断技术，其原理是利用抗原抗体反 应，在反应膜上预先固定好特异性抗原（或抗体)和第二抗体两种捕获剂，分别作为检测线 (Test line)和对照线（Con化〇1 line);及固定于胶体微粒结合物释放垫上并标记了抗待 测物抗体的胶体微粒。试纸条插入样品液中，样品液先溶解固定在胶体微粒结合物释放垫 上的胶体微粒，并与之发生特异性反应并形成复合物，当溶液在毛细管作用下到达抗原(或 抗体）区域(检测线)时，检测线上的特异性抗原与待测物和胶体微粒复合物再次发生特异 性结合，而被截留在检测线上，并显示出颜色。因此，可W根据试纸条检测线的颜色深浅或 有无来判断溶液中是否含有待测物。该方法与W往常规诊断方法相比具有W下突出优点：
[0003] 1).快速:全部检测过程仅需3-20分钟；
[0004] 2).简便:不需其它任何仪器设备，操作也极其简单，可随时随地进行；
[0005] 3).灵活:对标本既能成批检测，又可单份检测，患者可立刻拿到结果，不必等待；
[0006] 4).稳定:试剂稳定性好，可长期保存。
[0007] 该技术自发明W来得到了快速的发展，并应用在多个检测领域。被广大基层医疗 机构和家庭个人用户接受。是进行定性或半定量检测的一种有效途径，适用的检测标本种 类广泛。既可用于检查血，又可用于检验尿液或唾液，因而适合各种人群的疾病检查。
[000引传统旧有的免疫层析试纸条构成如图1所示，免疫层析试纸条主要包含五个部分： 加样区(样品垫）1、标记区（标记了抗待测物抗体的胶体微粒结合物释放垫)2、显示区（反应 膜)4、吸水区（吸收垫)6W及背衬7。所述试纸条由样品垫1、标记了抗待测物抗体的胶体微 粒结合物释放垫2、反应膜4、吸收垫6顺次搭接粘贴在背衬7上构成。其中，标记区(标记了抗 待测物抗体的胶体微粒结合物释放垫)2与显示区（反应膜)4是紧密相邻的。采用图1构成传 统旧有的免疫层析试纸条结合了免疫学实验的原理与薄层色谱技术，操作非常简单。
[0009]但是，传统旧有的免疫层析试纸条在设置存在着一个明显的缺陷，即在使用过程 中标记了抗待测物抗体的胶体微粒从结合物释放垫上崩解后就直接到达显示区并迅速地 通过了检测线3(Test line)。在运个过程中，标记了抗待测物抗体的胶体微粒往往无法迅 速均一地复溶在检测样品中，并与对应的目的检测物充分地进行免疫反应。事实上，在许多 传统旧有的免疫层析试纸条的检测中发现，由于传统旧有的免疫层析试纸条设置的局限， 加上抗待测物抗体的胶体微粒制作工艺的不完善W及检测样品在粘度及体积上的差异，使 得许多传统旧有的免疫层析试纸条中抗待测物抗体的胶体微粒崩解后均复溶得很不充分， 致使显示区（反应膜)膜面出现很多成团的不均匀的胶体微粒层析现象，即便有些免疫层析 试纸条表面上看起来较好的解决了标记了抗待测物抗体的胶体微粒从胶体微粒结合物释 放垫上的崩解后与检测样品的溶解问题，在显示区（反应膜)膜面上标记了抗待测物抗体的 胶体微粒裸眼目测也较为均匀，但实际上将崩解后标记了抗待测物抗体的胶体微粒与检测 样品的混溶液放在显微镜下观察，就可W看到标记了抗待测物抗体的胶体微粒并没有充分 均一地溶解在检测样品中因而无法与对应的目的检测物进行充分地免疫反应。致使标记 了抗待测物抗体的胶体微粒结合物释放垫的效率不能得到充分的发挥。运导致了传统旧有 的免疫层析试纸条灵敏度低、假阳性较高及检测线色不匀等质量问题，因此有必要对传统 旧有的免疫层析试纸条设置进行改良W弥补上述不足，W便进一步提高免疫层析试纸条灵 敏度及检测线色不匀等质量问题。
【发明内容】
[0010] 本发明提供了一种新型改进免疫层析试纸条及其制备和应用，本发明提供的试纸 条结构见图2.
[0011] 本发明经过大量研究，意外地发现如果在标记了待测物抗体的胶体微粒结合物释 放垫2与显示区（反应膜)4之间增设一个缓冲垫8,让从胶体微粒结合物释放垫2上崩解下来 的抗待测物抗体的胶体微粒上反应膜之前，能在缓冲垫8内更均一地溶解在检测样品中，并 获得相对充足的反应时间与对应的目的检测物进行更充分地免疫反应。从而达到抗待测物 抗体与样品中目的检测物反应效率的最大化的结果。结构示意图见图2。
[0012] 针对不同的检测样品W及相关免疫层析试纸条质控要求，缓冲垫8可选用的材质 包括有:玻璃纤维、滤纸、无纺布、无尘纸、反应膜、聚醋膜、高分子复合物等;优选无尘纸。
[0013] 针对不同的检测样品W及相关免疫层析试纸条质控要求，缓冲垫8可选用的材质 尺寸：厚度 0.1mm-1mm，长度 3mm-10mm。
[0014] 本发明中，标记待测物抗体的胶体微粒优选为胶体金。
[0015] 针对不同的检测样品W及相关免疫层析试纸条质控要求，缓冲垫8引入缓冲盐体 系W控制体系的PH值促进抗待测物抗体的胶体微粒溶解并充分地进行免疫反应。
[0016] 缓冲垫8(图2)可引入缓冲盐体系包括有:碳酸盐缓冲盐、棚酸盐缓冲盐、憐酸盐缓 冲盐、巧樣酸盐缓冲盐、Tris-HCl缓冲盐等;本发明的优选方案为:检测样本为血液类时，优 选棚酸盐缓冲盐;检测样本为尿液，优选化i S-肥1缓冲盐;检测样本为分泌物时，优选憐酸 盐缓冲盐。
[0017] 针对不同的检测样品W及相关免疫层析试纸条质控要求，缓冲垫8可引入的缓冲 盐体系所控制的PH值范围为6-10，优选PH范围为7.4-8.5。
[0018] 针对不同的检测样品W及相关免疫层析试纸条具体要求，可在胶体微粒结合物缓 冲垫8引入缓冲盐体系的基础上进一步加入表面活性剂。胶体微粒结合物缓冲垫8上可加入 的表面活性剂缓冲盐体系包括有:非离子型表面活性剂；阴离子型表面活性剂及两性离子 型表面活性剂。
[0019] 胶体微粒结合物缓冲垫8上可加入的非离子型表面活性剂优选:吐溫系列、曲通系 列、NP系列、0P乳化剂系列、高级脂肪醇聚氧乙締酸及高级脂肪醇聚氧丙締酸系列中的一种 或几种促进免疫反应。最优选吐溫-20。
[0020] 胶体微粒结合物缓冲垫8上可加入的非离子型表面活性剂的质量百分比浓度浓度 范围优选为0.02%-0.5%:更优选0.05%-0.2%。
[0021] 胶体微粒结合物缓冲垫8上可加入的阴离子型表面活性剂优选:十二烷基硫酸钢、 直链烷基苯横酸钢、a-締控横酸盐、烷基横酸盐、X-横基单簇酸及其衍生物、脂肪酸横烷基 醋和脂肪酸横烷基酷胺、油酷氧基乙横酸钢、二辛基班巧酸横酸钢、胆酸钢、去氧胆酸钢、硫 酸醋盐、憐酸醋盐等及其类似结构的阴离子表面活性剂一种或几种促进促进抗待测物抗体 的胶体微粒溶解并充分地进行免疫反应。最优选十二烷基硫酸钢。
[0022] 胶体微粒结合物缓冲垫8上可加入的阴离子型的表面活性剂的质量百分比浓度浓 度范围优选为0.02%-0.5%:更优选为0.05%-0.2%。
[0023] 针对不同的检测样品W及相关免疫层析试纸条质控要求，可在缓冲垫8进一步引 入无机盐及金属络合剂促进促进抗待测物抗体的胶体微粒溶解并充分地进行免疫反应。无 机盐及金属络合剂包括有:船(：1、船(：03、1(2(：03、邸了4、邸了4-船2等；
[0024] 针对不同的检测样品W及相关免疫层析试纸条具体要求，可在缓冲垫8进一步引 入亲水的高分子促进抗待测物抗体的胶体微粒溶解并充分地进行免疫反应。亲水的高分子 包括有:PVP系列、PEG系列、PVA系列及天然的琼脂、明胶等;优选PVP系列。
[0025] 针对不同的检测样品W及相关免疫层析试纸条具体要求，可在缓冲垫8进一步引 入天然生物大分子促进抗待测物抗体的胶体微粒溶解并充分地进行免疫反应。天然生物大 分子包括有:BSA系列、OVA系列、酪蛋白、奶粉及脱脂奶粉等;优选酪蛋白。
[0026] 针对血液类检测样品，还可在缓冲垫8引入的动物血清用于消除或减少非特异性 反应。动物血清包括有:小鼠血清、山羊血清、羊血清等；
[0027] 可在缓冲垫8引入的其它试剂还包括有:蛋白A、植物凝集素、特异性抗体或抗原、 阻断剂等，去除非特异性，减少假阳的发生率。
[0028] 本发明提供的新型改进免疫层析试纸条，解决了现有技术中的试纸条标记了抗待 测物抗体的胶体微粒无法迅速均一地复溶在检测样品中，并与对应的目的检测物充分地进 行免疫反应的不足，克服或消除了显示区（反应膜)膜面出现很多成团的不均匀的胶体微粒 层析现象、W及标记了抗待测物抗体的胶体微粒金标结合物释放垫的效率不能得到充分的 发挥等质量问题。通过对传统旧有的免疫层析试纸条设置的改进，本发明与现有的免疫层 析试纸条相比，具有灵敏度高、假阳性低及检测线色均匀等优点，而且成本低廉，制作简便， 适用于各种形式的免疫层析法检测试纸。
【附图说明】
[0029] 图1为传统旧有的免疫层析法检测试纸结构示意图。其中，1为加样区（样品垫）、2 为标记区（标记了抗待测物抗体的胶体微粒结合物释放垫）、3为检测线、4为显示区（反应 膜）、5为对照线、6为吸水区（吸收垫）、7为背衬。
[0030] 图2为本发明实施例中新型改进的免疫层析法检测试纸结构示意图。其中，1为加 样区（样品垫）、2为标记区（标记了抗待测物抗体的胶体微粒结合物释放垫）、3为检测线、4 为显示区(反应膜）、5为对照线、6为吸水区（吸收垫）、7为背衬、8为缓冲垫 。
【具体实施方式】
[0031] 从实施例的快速免疫层析显色标记物胶体金，相应的也可W顺延到其它显色标记 物的免疫层析体系中。
[0032] 提供下述最佳实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施 方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明的 其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均属于本发明 的保护范围之内。
[0033] 实施例1
[0034] 乙肝表面抗原胶体金检测试纸提高灵敏度，去除假阳性，加快反应膜本底稱白，提 升杠色均匀。
[0035] 1-1制备过程：
[0036] 1)反应膜4:将0.5mg/ml的乙肝表面抗原单克隆抗体A及1.2mg/ml的羊抗鼠多克隆 抗体平行包被于硝酸纤维膜的检测线位及对照线位，惊干制得反应膜4;
[0037] 2)胶体微粒(金标)结合物释放垫2:用巧樣酸Ξ钢还原法制得粒径为40nm的胶体 金颗粒，用胶体金溶液质量1% (质量百分数）的0.1M/L碳酸钟溶液调整PH，再加入lOug/ml 乙肝表面抗原单克隆抗体B，快速混匀并加入胶体金体积溶液质量1% (质量百分数)的稳定 剂，高速冷冻离屯、机5000转/分钟、10000转/分钟两次离屯、收集金标沉淀，用纯化水及稳定 剂等稀释金标沉淀涂布于聚醋膜上制得胶体微粒(金标)结合物释放垫2;
[003引 3)样品垫1:用浓度为211^(毫摩尔）/1，？巧直为8.6的时13寸(：1缓冲盐，加入0.1% (质量百分数)的0P-10表面活性剂涂布玻璃纤维上，惊干制得样品垫2;
[0039] 4)缓冲垫8:用浓度为2mM(毫摩尔)/L，PH值为8.0的棚酸缓冲盐、0.05% (质量百分 数)的吐溫20，0.45 % (质量百分数)化C1，2 % (质量百分数）山羊血清，0.02 % (质量百分数） PVA涂布于无纺纸上，惊干制得缓冲垫8。
[0040] 1-2 组装：
[0041] 传统旧有模式(图1)
[0042] 在背衬(7)上，吸收垫(6)压贴反应膜(4)对照线巧)侧0.5-lmm，胶体微粒(金标)结 合物释放垫(2)压贴反应膜(4)靠近检测线(3)侧0.5-lmm，样品垫1压贴胶体微粒(金标)结 合物释放垫(2)约2-3mm;
[0043] 新型改进模式(图2)
[0044] 在背衬(7)上，吸收垫(6)压贴反应膜(4)靠近对照线（5)侧约0.5-lmm，胶体微粒 (金标)结合物缓冲垫(8)压贴反应膜(4)靠近检测线3侧约0.5-lmm，胶体微粒(金标)结合物 释放垫（2)压贴缓冲垫(8)约2-3mm，样品垫（1)压贴胶体微粒(金标)结合物释放垫（2)约2-3mm；
[0045] 1-3检测方法：
[0046] 将试纸直接插入约80ul血清/血浆/全血样品或标准品中约5-10秒，取出平放，10-30分钟内观察结果，30分钟后无效；
[0047] 检测样本:2ng/ml标准品巧00份临床随机阴性血清/血浆/全血 [004引1-4检测结果：
[0049] 评测临床上主要的产品性能指标说明：
[0050] 灵敏度:义用化g/ml柄;准品检测
[0051 ]总体符合率:真阴性、真阳性的临床符合性
[0052] 假阳率:错误的阳性结果占真阴性的比率
[0053] 反应膜本底稱白时间：10-30分钟，越快越好
[0化4] 杠色均匀性:裸眼直接认读 [0055] 具体检测结果对比见下表：
[0化6]
[0化7] 实施例2
[005引丙型肝炎抗体胶体金检测试纸提高灵敏度、减少假阳发生率、改良HOOK效应、加快 反应膜本底稱白、提升杠色均匀。
[0化9] 2_1制备过程：
[0060] 1)反应膜(4):将0.6mg/ml的丙型肝炎基因重组抗原A及1. Omg/ml的羊抗鼠多克隆 抗体平行包被于硝酸纤维膜的检测线位及对照线位，惊干制得反应膜4;
[0061] 2)胶体微粒(金标)结合物释放垫2:用巧樣酸Ξ钢还原法制得粒径为40nm的胶体 金颗粒，用相当于胶体金溶液质量0.7% (质量百分数）的0.1M/L碳酸钟调整PH值，再加入 lOug/ml丙型肝炎基因重组抗原B，快速混匀并加入相当于胶体金溶液质量1% (质量百分 数)体积的稳定剂，高速冷冻离屯、机5000转/分钟、10000转/分钟两次离屯、收集金标沉淀，用 纯化水及稳定剂等稀释金标沉淀涂布于无纺布上制得胶体微粒(金标)结合物释放垫2;
[0062] 注:用实施例1中所述同等条件标记鼠 IgG-起涂布于胶体微粒(金标)结合物释放 垫2中做为对照线5显色用。
[00创 3)样品垫1:用浓度为211^(毫摩尔）/1，？巧直为8.6的化13-肥1缓冲盐、0.1%(质量 百分数)的0P-10表面活性剂涂布玻璃纤维上，惊干制得样品垫1;
[0064] 4)胶体微粒(金标)结合物缓冲垫8:用2mM(毫摩尔)/L，PH值为8.0的棚酸缓冲盐， 0.05% (质量百分数）的吐溫20,0.45% (质量百分数)NaCl ,0.1% (质量百分数）酪蛋白， 0.02% (质量百分数)PVA涂布于无纺纸上，惊干制得缓冲垫(8)。
[00化]2-2组装：
[0066] 传统旧有模式(图1)
[0067] 在背衬(7)上，吸收垫(6)压贴反应膜(4)靠对照线(5)侧约0.5-lmm，胶体微粒(金 标)结合物释放垫（2)压贴反应膜(4)靠检测线（3)侧约0.5-lmm，样品垫（1)压贴胶体微粒 (金标)结合物释放垫(2)约2-3mm;
[0068] 新型改进模式(图2)
[0069] 在背衬（7)上，吸收垫（6)压贴反应膜(4)靠对照线5侧约0.5-lmm，胶体微粒（金 标)结合物缓冲垫(8)压贴反应膜(4)靠检测线（3)侧约0.5-lmm，胶体微粒(金标)结合物释 放垫（2)压贴缓冲垫（8)约2-3mm，样品垫（1)压贴胶体微粒（金标）结合物释放垫（2)约2-3mm；
[0070] 2-3检测方法：
[0071] 将试纸直接插入约80ul血清/血浆/全血样品或参考品中约5-10秒，取出平放，10-30分钟内观察结果，30分钟后无效；
[0072] 检测样本:2NCU/ml参考品巧00份临床随机阴性血清/血浆/全血+45份临检阳性样 本(含5份超强阳性样本）
[0073] 2-4检测结果：
[0074] 临床上主要的产品性能指标说明：
[0075] 灵敏度:采用2NCU/ml参考品检测
[0076] 总体符合率:真阴性、真阳性的临床符合性
[0077] 假阳率:错误的阳性结果占真阴性的比率
[0078] 反应膜本底稱白时间：10-30分钟，越快越好
[0079] 超强阳化00K):临床超强阳性血清样本5份
[0080] 杠色均匀性:裸眼直接认读
[0081] 具体检测结果对比见下表：
[0082]
[0083] 实施例3
[0084] 安非他明胶体金检测试纸提升灵敏度、加快反应膜本底稱白、提升杠色均匀。
[0085] 3-1制备过程：
[0086] 1)反应膜4:将0.2mg/ml的安非他明-BSA偶联物及0.8mg/ml的羊抗鼠多克隆抗体 平行包被于硝酸纤维膜的检测线位及对照线位，惊干制得反应膜4;
[0087] 2)胶体微粒(金标)结合物释放垫2:用巧樣酸Ξ钢还原法制得粒径为40nm的胶体 金颗粒，用相当于胶体金溶液质量0.9% (质量百分数）的0.1M/L碳酸钟调整PH值，再加入 lOug/ml安非他明单克隆抗体，快速混匀并加入相当于胶体金溶液质量1% (质量百分数)的 稳定剂，高速冷冻离屯、机5000转/分钟、10000转/分钟两次离屯、收集金标沉淀，用纯化水及 稳定剂等稀释金标沉淀涂布于无纺布上制得胶体微粒(金标)结合物释放垫2;
[008引 3)样品垫1:用浓度为2mM/L，PH值为8.6的Tri S-HC1缓冲盐、0.1 % (质量百分数）的 吐溫20表面活性剂涂布玻璃纤维上，惊干制得样品垫1;
[0089] 4)胶体微粒（金标）结合物缓冲垫8:用浓度为2mM/L，PH值为8.0的化iS-HC1缓冲 盐、0.02% (质量百分数)的十二烷基硫酸钢、浓度为2mM/L的抓TA-Na2、0.1 % (质量百分数） 酪蛋白、0.05% (质量百分数)PVP-K30涂布于无纺纸上，惊干制得缓冲垫8。
[0090] 3-2 组装：
[0091] 传统旧有模式(图1)
[0092] 在背衬(7)上，吸收垫(6)压贴反应膜(4)对照线巧)侧约0.5-lmm，胶体微粒(金标） 结合物释放垫（2)压贴反应膜(4)靠检测线（3)侧约0.5-lmm，样品垫（1)压贴胶体微粒(金 标)结合物释放垫(2)约2-3mm;
[0093] 新型改进模式(图2)
[0094] 在背衬7上，吸收垫(6)压贴反应膜(4)靠对照线(5)侧约0.5-lmm，胶体微粒(金标） 结合物缓冲垫(8)压贴反应膜(4)靠检测线(3)侧约0.5-lmm，胶体微粒(金标)结合物释放垫 2压贴缓冲垫(8)约2-3mm，样品垫1压贴胶体微粒(金标)结合物释放垫2约2-3mm;
[00巧]3-3检测方法：
[0096] 将试纸直接插入约80ul尿液及参考品3 -5秒，取出平放，5-15分钟内观察结果，20 分钟后无效；
[0097] 检测样本:100化g/ml、50化g/ml参考品巧0份临床随机尿液+40份阳性尿液
[0098] 3-4检测结果：
[0099] 临床上主要的产品性能指标说明：
[0100] 灵敏度:采用l〇〇〇ng/ml、5(K)ng/ml参考品检测
[0101] 总体符合率:真阴性、真阳性的临床符合性
[0102] 反应膜本底稱白时间：5-15分钟，越快越好
[0103] 杠色均匀性:裸眼直接认读
[0104] 具体检测结果对比见下表：
[0105]
[0106] 实施例4
[0107] 淋病胶体金检测试纸提升灵敏度、改善册0K效应、加快反应膜本底稱白、提升杠色 均匀；
[0108] 4-1制备过程：
[0109] 1)反应膜4:将1 .Omg/ml的淋球菌单克隆抗体A及1 .Omg/ml的羊抗鼠多克隆抗体平 行包被于硝酸纤维膜的检测线位及对照线位，惊干制得反应膜4;
[0110] 2)胶体微粒(金标)结合物释放垫2:用巧樣酸Ξ钢还原法制得40nm的胶体金颗粒， 用相当于胶体金溶液质量0.8% (质量百分数)的0.1M/L碳酸钟调整PH值，再加入lOug/ml淋 球菌单克隆抗体B，快速混匀并加入相当于胶体金溶液质量1 % (质量百分数）的稳定剂，高 速冷冻离屯、机5000转/分钟、10000转/分钟两次离屯、收集金标沉淀，用纯化水及稳定剂等稀 释金标沉淀涂布于无纺布上制得胶体微粒(金标)结合物释放垫2;
[0111] 3)样品垫1:用浓度为2mM/L，PH值为7.4的憐酸缓冲盐、0.1% (质量百分数)的吐溫 20表面活性剂涂布玻璃纤维上，惊干制得样品垫1;
[0112] 4)缓冲垫8:用浓度为5mM/L，PH值为7.6的憐酸缓冲盐、0.05% (质量百分数）的十 二烷基硫酸钢、0.1% (质量百分数)酪蛋白、0.05% (质量百分数)PVP-K30涂布于无纺纸上， 惊干制得缓冲垫8。
[0113] 5)样本裂解液:裂解A液为0.05% (质量百分数)的十二烷基硫酸钢+2% (质量百分 数)NaCl，裂解B液为5mM/L，PH值为7.6的憐酸缓冲盐。
[0114] 4-2 组装：
[011引传统旧有模式(图1)
[0116] 在背衬(7)上，吸收垫(6)压贴反应膜(4)靠对照线(5)侧约0.5-lmm，胶体微粒(金 标)结合物释放垫（2)压贴反应膜(4)靠检测线（3)侧约0.5-lmm，样品垫（1)压贴胶体微粒 (金标)结合物释放垫(2)约2-3mm;
[0117] 新型改进模式(图2)
[0118] 在背衬(7)上，吸收垫(6)压贴反应膜(4)靠对照线(5)侧约0.5-lmm，胶体微粒(金 标)结合物缓冲垫(8)压贴反应膜(4)靠检测线（3)侧约0.5-lmm，胶体微粒(金标)结合物释 放垫2压贴缓冲垫(8)约2-3mm，样品垫1压贴胶体微粒(金标)结合物释放垫(2)约2-3mm;
[0119] 4-3检测方法：
[0120] 将采集的标本置于300ul的裂解A液中2-3分钟上，再加入lOOul裂解B液混匀1-2分 钟，试纸直接插入约80ul混匀后的裂解液及参考品中3-5秒，取出平放，5-15分钟内观察结 果，20分钟后无效；
[0121 ] 检测样本:lX107CFU/ml、2X106CFU/ml参考品+40份临床随机样本+20份临床阳性样 品(含1份超强阳性样本）
[0122] 4-4检测结果：
[0123] 临床上主要的产品性能指标说明：
[0124] 灵敏度:采用lX107CFU/ml、2X106C即/ml参考品检测
[0125] 总体符合率:真阴性、真阳性的临床符合性
[0126] 反应膜本底稱白时间：5-15分钟，越快越好
[0127] 超强阳性化00K):临床超强阳性样本1份
[0128] 杠色均匀性:裸眼直接认读
[0129] 具体检测结果对比见下表：
[0130]
[0131]本发明中，所述百分比浓度没有特别指出的，均为质量百分比浓度。
【主权项】
1. 一种新型改进免疫层析试纸条，包括顺次搭接粘贴在背衬上的样品垫、标记了抗待 测物抗体的胶体微粒结合物释放垫、反应膜、吸收垫，其特征在于:待测物抗体的胶体微粒 释放垫与作为显示区的反应膜之间设有一个缓冲垫。2. 根据权利要求1所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:所述缓冲垫选用 的材质包括:玻璃纤维、滤纸、无纺布、无尘纸、反应膜聚酯膜或高分子复合物。3. 根据权利要求2所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于： 所述缓冲垫的尺寸为:厚度〇 · 1臟一1mm，长度3mm-10mm〇4. 根据权利要求1-3任一所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:所述缓冲 垫，让从胶体微粒结合物释放垫上崩解下来的抗待测物抗体的胶体微粒上反应膜之前，能 在其内更均一地溶解在检测样品中，并获得相对充足的反应时间与对应的目的检测物进行 更充分地免疫反应。5. 根据权利要求4所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:所述标记的抗待 测物抗体的胶体微粒为胶体金。6. 根据权利要求5所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:缓冲垫中进一步 引入缓冲盐体系。7. 根据权利要求6所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:缓冲垫引入缓冲 盐体系包括:碳酸盐缓冲盐、硼酸盐缓冲盐、磷酸盐缓冲盐、柠檬酸盐缓冲盐或Tris-HCl缓 冲盐。8. 根据权利要求7所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:缓冲垫引入的缓 冲盐体系所控制的PH值范围为6-10。9. 根据权利要求8所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:缓冲垫引入的缓 冲盐体系所控制的PH值范围为7.4-8.5。10. 根据权利要求9所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:检测样本为血 液类时，缓冲垫引入缓冲盐体系为硼酸盐缓冲盐;检测样本为尿液，缓冲垫引入缓冲盐体系 为Tris-HCl缓冲盐;检测样本为分泌物时，缓冲垫引入缓冲盐体系为磷酸盐缓冲盐。11. 根据权利要求6-10中任一所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:在缓 冲垫引入缓冲盐体系的基础上，进一步加入表面活性剂。12. 根据权利要求11所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:缓冲垫上加入 的表面活性剂选自非离子型表面活性剂或阴离子型表面活性剂。13. 根据权利要求12所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:缓冲垫上加入 的表面活性剂质量百分比浓度范围为0.02%-0.5%。14. 根据权利要求13所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:缓冲垫上加入 表面活性剂的质量百分比浓度范围为0.05%-0.2%。15. 根据权利要求14所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:缓冲垫上加入 的非离子型表面活性剂选自：吐温系列、曲通系列、NP系列、OP乳化剂系列、高级脂肪醇聚氧 乙烯醚及高级脂肪醇聚氧丙烯醚系列； 缓冲垫上加入的阴离子型表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、直链烷基苯磺酸钠、a-烯 烃磺酸盐、烷基磺酸盐、X-磺基单羧酸及其衍生物、脂肪酸磺烷基酯和脂肪酸磺烷基酰胺、 油酰氧基乙磺酸钠、二辛基琥珀酸磺酸钠、胆酸钠、去氧胆酸钠、硫酸酯盐、磷酸酯盐及其类 似结构的阴离子表面活性剂。16. 根据权利要求14所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:缓冲垫上加入 的表面活性剂为吐温-20或十二烷基硫酸钠。17. 根据权利要求15所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:缓冲垫中可进 一步引入其它试剂，所述其它试剂选自无机盐及金属络合剂、亲水的高分子、天然生物大分 子、动物血清、蛋白A、植物凝集素、特异性抗体或抗原、阻断剂中的一种或几种。18. 根据权利要求17所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于： 所述无机盐及金属络合剂选自NaCl、NaC03、K2C03、EDTA、EDTA-Na2; 所述亲水的高分子选自PVP系列、PEG系列、PVA系列及天然的琼脂、明胶； 所述天然生物大分子选自BSA系列、OVA系列、酪蛋白、奶粉及脱脂奶粉； 所述动物血清选自小鼠血清、山羊血清、羊血清。19. 一种新型改进免疫层析试纸条的应用，其特征在于应用于检测肝炎、淋病或毒品。20. 根据权利要求19所述的一种新型改进免疫层析试纸条的应用，其特征在于所述肝 炎为乙肝或丙肝，所述毒品为安非他明。
【专利摘要】本发明提供了一种新型改进免疫层析试纸条及其制备和应用。本发明在标记了待测物抗体的胶体微粒结合物释放垫与反应膜之间增设一个缓冲垫，让从释放垫上崩解下来的抗待测物抗体的胶体微粒上反应膜之前，能在缓冲垫内更均一地溶解在检测样品中，并获得相对充足的反应时间与对应的目的检测物进行更充分地免疫反应，从而达到抗待测物抗体与样品中目的检测物反应效率的最大化。本发明与现有的免疫层析试纸条相比，具有灵敏度高、假阳率低及检测线色均匀等优点，而且成本低廉，制作简便，适用于各种形式的免疫层析法检测试纸。
【IPC分类】G01N33/571, G01N33/94, G01N33/576, G01N33/558
【公开号】CN105486859
【申请号】CN201510814878
【发明人】余期川, 郑会义
【申请人】润和生物医药科技(汕头)有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年11月20日
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物技术领域，具体来说，设及一种新型改进免疫层析试纸条构建及 其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 免疫层析法是二十世纪九十年代兴起的快速诊断技术，其原理是利用抗原抗体反 应，在反应膜上预先固定好特异性抗原（或抗体)和第二抗体两种捕获剂，分别作为检测线 (Test line)和对照线（Con化〇1 line);及固定于胶体微粒结合物释放垫上并标记了抗待 测物抗体的胶体微粒。试纸条插入样品液中，样品液先溶解固定在胶体微粒结合物释放垫 上的胶体微粒，并与之发生特异性反应并形成复合物，当溶液在毛细管作用下到达抗原(或 抗体）区域(检测线)时，检测线上的特异性抗原与待测物和胶体微粒复合物再次发生特异 性结合，而被截留在检测线上，并显示出颜色。因此，可W根据试纸条检测线的颜色深浅或 有无来判断溶液中是否含有待测物。该方法与W往常规诊断方法相比具有W下突出优点：
[0003] 1).快速:全部检测过程仅需3-20分钟；
[0004] 2).简便:不需其它任何仪器设备，操作也极其简单，可随时随地进行；
[0005] 3).灵活:对标本既能成批检测，又可单份检测，患者可立刻拿到结果，不必等待；
[0006] 4).稳定:试剂稳定性好，可长期保存。
[0007] 该技术自发明W来得到了快速的发展，并应用在多个检测领域。被广大基层医疗 机构和家庭个人用户接受。是进行定性或半定量检测的一种有效途径，适用的检测标本种 类广泛。既可用于检查血，又可用于检验尿液或唾液，因而适合各种人群的疾病检查。
[000引传统旧有的免疫层析试纸条构成如图1所示，免疫层析试纸条主要包含五个部分： 加样区(样品垫）1、标记区（标记了抗待测物抗体的胶体微粒结合物释放垫)2、显示区（反应 膜)4、吸水区（吸收垫)6W及背衬7。所述试纸条由样品垫1、标记了抗待测物抗体的胶体微 粒结合物释放垫2、反应膜4、吸收垫6顺次搭接粘贴在背衬7上构成。其中，标记区(标记了抗 待测物抗体的胶体微粒结合物释放垫)2与显示区（反应膜)4是紧密相邻的。采用图1构成传 统旧有的免疫层析试纸条结合了免疫学实验的原理与薄层色谱技术，操作非常简单。
[0009]但是，传统旧有的免疫层析试纸条在设置存在着一个明显的缺陷，即在使用过程 中标记了抗待测物抗体的胶体微粒从结合物释放垫上崩解后就直接到达显示区并迅速地 通过了检测线3(Test line)。在运个过程中，标记了抗待测物抗体的胶体微粒往往无法迅 速均一地复溶在检测样品中，并与对应的目的检测物充分地进行免疫反应。事实上，在许多 传统旧有的免疫层析试纸条的检测中发现，由于传统旧有的免疫层析试纸条设置的局限， 加上抗待测物抗体的胶体微粒制作工艺的不完善W及检测样品在粘度及体积上的差异，使 得许多传统旧有的免疫层析试纸条中抗待测物抗体的胶体微粒崩解后均复溶得很不充分， 致使显示区（反应膜)膜面出现很多成团的不均匀的胶体微粒层析现象，即便有些免疫层析 试纸条表面上看起来较好的解决了标记了抗待测物抗体的胶体微粒从胶体微粒结合物释 放垫上的崩解后与检测样品的溶解问题，在显示区（反应膜)膜面上标记了抗待测物抗体的 胶体微粒裸眼目测也较为均匀，但实际上将崩解后标记了抗待测物抗体的胶体微粒与检测 样品的混溶液放在显微镜下观察，就可W看到标记了抗待测物抗体的胶体微粒并没有充分 均一地溶解在检测样品中因而无法与对应的目的检测物进行充分地免疫反应。致使标记 了抗待测物抗体的胶体微粒结合物释放垫的效率不能得到充分的发挥。运导致了传统旧有 的免疫层析试纸条灵敏度低、假阳性较高及检测线色不匀等质量问题，因此有必要对传统 旧有的免疫层析试纸条设置进行改良W弥补上述不足，W便进一步提高免疫层析试纸条灵 敏度及检测线色不匀等质量问题。
【发明内容】
[0010] 本发明提供了一种新型改进免疫层析试纸条及其制备和应用，本发明提供的试纸 条结构见图2.
[0011] 本发明经过大量研究，意外地发现如果在标记了待测物抗体的胶体微粒结合物释 放垫2与显示区（反应膜)4之间增设一个缓冲垫8,让从胶体微粒结合物释放垫2上崩解下来 的抗待测物抗体的胶体微粒上反应膜之前，能在缓冲垫8内更均一地溶解在检测样品中，并 获得相对充足的反应时间与对应的目的检测物进行更充分地免疫反应。从而达到抗待测物 抗体与样品中目的检测物反应效率的最大化的结果。结构示意图见图2。
[0012] 针对不同的检测样品W及相关免疫层析试纸条质控要求，缓冲垫8可选用的材质 包括有:玻璃纤维、滤纸、无纺布、无尘纸、反应膜、聚醋膜、高分子复合物等;优选无尘纸。
[0013] 针对不同的检测样品W及相关免疫层析试纸条质控要求，缓冲垫8可选用的材质 尺寸：厚度 0.1mm-1mm，长度 3mm-10mm。
[0014] 本发明中，标记待测物抗体的胶体微粒优选为胶体金。
[0015] 针对不同的检测样品W及相关免疫层析试纸条质控要求，缓冲垫8引入缓冲盐体 系W控制体系的PH值促进抗待测物抗体的胶体微粒溶解并充分地进行免疫反应。
[0016] 缓冲垫8(图2)可引入缓冲盐体系包括有:碳酸盐缓冲盐、棚酸盐缓冲盐、憐酸盐缓 冲盐、巧樣酸盐缓冲盐、Tris-HCl缓冲盐等;本发明的优选方案为:检测样本为血液类时，优 选棚酸盐缓冲盐;检测样本为尿液，优选化i S-肥1缓冲盐;检测样本为分泌物时，优选憐酸 盐缓冲盐。
[0017] 针对不同的检测样品W及相关免疫层析试纸条质控要求，缓冲垫8可引入的缓冲 盐体系所控制的PH值范围为6-10，优选PH范围为7.4-8.5。
[0018] 针对不同的检测样品W及相关免疫层析试纸条具体要求，可在胶体微粒结合物缓 冲垫8引入缓冲盐体系的基础上进一步加入表面活性剂。胶体微粒结合物缓冲垫8上可加入 的表面活性剂缓冲盐体系包括有:非离子型表面活性剂；阴离子型表面活性剂及两性离子 型表面活性剂。
[0019] 胶体微粒结合物缓冲垫8上可加入的非离子型表面活性剂优选:吐溫系列、曲通系 列、NP系列、0P乳化剂系列、高级脂肪醇聚氧乙締酸及高级脂肪醇聚氧丙締酸系列中的一种 或几种促进免疫反应。最优选吐溫-20。
[0020] 胶体微粒结合物缓冲垫8上可加入的非离子型表面活性剂的质量百分比浓度浓度 范围优选为0.02%-0.5%:更优选0.05%-0.2%。
[0021] 胶体微粒结合物缓冲垫8上可加入的阴离子型表面活性剂优选:十二烷基硫酸钢、 直链烷基苯横酸钢、a-締控横酸盐、烷基横酸盐、X-横基单簇酸及其衍生物、脂肪酸横烷基 醋和脂肪酸横烷基酷胺、油酷氧基乙横酸钢、二辛基班巧酸横酸钢、胆酸钢、去氧胆酸钢、硫 酸醋盐、憐酸醋盐等及其类似结构的阴离子表面活性剂一种或几种促进促进抗待测物抗体 的胶体微粒溶解并充分地进行免疫反应。最优选十二烷基硫酸钢。
[0022] 胶体微粒结合物缓冲垫8上可加入的阴离子型的表面活性剂的质量百分比浓度浓 度范围优选为0.02%-0.5%:更优选为0.05%-0.2%。
[0023] 针对不同的检测样品W及相关免疫层析试纸条质控要求，可在缓冲垫8进一步引 入无机盐及金属络合剂促进促进抗待测物抗体的胶体微粒溶解并充分地进行免疫反应。无 机盐及金属络合剂包括有:船(：1、船(：03、1(2(：03、邸了4、邸了4-船2等；
[0024] 针对不同的检测样品W及相关免疫层析试纸条具体要求，可在缓冲垫8进一步引 入亲水的高分子促进抗待测物抗体的胶体微粒溶解并充分地进行免疫反应。亲水的高分子 包括有:PVP系列、PEG系列、PVA系列及天然的琼脂、明胶等;优选PVP系列。
[0025] 针对不同的检测样品W及相关免疫层析试纸条具体要求，可在缓冲垫8进一步引 入天然生物大分子促进抗待测物抗体的胶体微粒溶解并充分地进行免疫反应。天然生物大 分子包括有:BSA系列、OVA系列、酪蛋白、奶粉及脱脂奶粉等;优选酪蛋白。
[0026] 针对血液类检测样品，还可在缓冲垫8引入的动物血清用于消除或减少非特异性 反应。动物血清包括有:小鼠血清、山羊血清、羊血清等；
[0027] 可在缓冲垫8引入的其它试剂还包括有:蛋白A、植物凝集素、特异性抗体或抗原、 阻断剂等，去除非特异性，减少假阳的发生率。
[0028] 本发明提供的新型改进免疫层析试纸条，解决了现有技术中的试纸条标记了抗待 测物抗体的胶体微粒无法迅速均一地复溶在检测样品中，并与对应的目的检测物充分地进 行免疫反应的不足，克服或消除了显示区（反应膜)膜面出现很多成团的不均匀的胶体微粒 层析现象、W及标记了抗待测物抗体的胶体微粒金标结合物释放垫的效率不能得到充分的 发挥等质量问题。通过对传统旧有的免疫层析试纸条设置的改进，本发明与现有的免疫层 析试纸条相比，具有灵敏度高、假阳性低及检测线色均匀等优点，而且成本低廉，制作简便， 适用于各种形式的免疫层析法检测试纸。
【附图说明】
[0029] 图1为传统旧有的免疫层析法检测试纸结构示意图。其中，1为加样区（样品垫）、2 为标记区（标记了抗待测物抗体的胶体微粒结合物释放垫）、3为检测线、4为显示区（反应 膜）、5为对照线、6为吸水区（吸收垫）、7为背衬。
[0030] 图2为本发明实施例中新型改进的免疫层析法检测试纸结构示意图。其中，1为加 样区（样品垫）、2为标记区（标记了抗待测物抗体的胶体微粒结合物释放垫）、3为检测线、4 为显示区(反应膜）、5为对照线、6为吸水区（吸收垫）、7为背衬、8为缓冲垫 。
【具体实施方式】
[0031] 从实施例的快速免疫层析显色标记物胶体金，相应的也可W顺延到其它显色标记 物的免疫层析体系中。
[0032] 提供下述最佳实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施 方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明的 其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均属于本发明 的保护范围之内。
[0033] 实施例1
[0034] 乙肝表面抗原胶体金检测试纸提高灵敏度，去除假阳性，加快反应膜本底稱白，提 升杠色均匀。
[0035] 1-1制备过程：
[0036] 1)反应膜4:将0.5mg/ml的乙肝表面抗原单克隆抗体A及1.2mg/ml的羊抗鼠多克隆 抗体平行包被于硝酸纤维膜的检测线位及对照线位，惊干制得反应膜4;
[0037] 2)胶体微粒(金标)结合物释放垫2:用巧樣酸Ξ钢还原法制得粒径为40nm的胶体 金颗粒，用胶体金溶液质量1% (质量百分数）的0.1M/L碳酸钟溶液调整PH，再加入lOug/ml 乙肝表面抗原单克隆抗体B，快速混匀并加入胶体金体积溶液质量1% (质量百分数)的稳定 剂，高速冷冻离屯、机5000转/分钟、10000转/分钟两次离屯、收集金标沉淀，用纯化水及稳定 剂等稀释金标沉淀涂布于聚醋膜上制得胶体微粒(金标)结合物释放垫2;
[003引 3)样品垫1:用浓度为211^(毫摩尔）/1，？巧直为8.6的时13寸(：1缓冲盐，加入0.1% (质量百分数)的0P-10表面活性剂涂布玻璃纤维上，惊干制得样品垫2;
[0039] 4)缓冲垫8:用浓度为2mM(毫摩尔)/L，PH值为8.0的棚酸缓冲盐、0.05% (质量百分 数)的吐溫20，0.45 % (质量百分数)化C1，2 % (质量百分数）山羊血清，0.02 % (质量百分数） PVA涂布于无纺纸上，惊干制得缓冲垫8。
[0040] 1-2 组装：
[0041] 传统旧有模式(图1)
[0042] 在背衬(7)上，吸收垫(6)压贴反应膜(4)对照线巧)侧0.5-lmm，胶体微粒(金标)结 合物释放垫(2)压贴反应膜(4)靠近检测线(3)侧0.5-lmm，样品垫1压贴胶体微粒(金标)结 合物释放垫(2)约2-3mm;
[0043] 新型改进模式(图2)
[0044] 在背衬(7)上，吸收垫(6)压贴反应膜(4)靠近对照线（5)侧约0.5-lmm，胶体微粒 (金标)结合物缓冲垫(8)压贴反应膜(4)靠近检测线3侧约0.5-lmm，胶体微粒(金标)结合物 释放垫（2)压贴缓冲垫(8)约2-3mm，样品垫（1)压贴胶体微粒(金标)结合物释放垫（2)约2-3mm；
[0045] 1-3检测方法：
[0046] 将试纸直接插入约80ul血清/血浆/全血样品或标准品中约5-10秒，取出平放，10-30分钟内观察结果，30分钟后无效；
[0047] 检测样本:2ng/ml标准品巧00份临床随机阴性血清/血浆/全血 [004引1-4检测结果：
[0049] 评测临床上主要的产品性能指标说明：
[0050] 灵敏度:义用化g/ml柄;准品检测
[0051 ]总体符合率:真阴性、真阳性的临床符合性
[0052] 假阳率:错误的阳性结果占真阴性的比率
[0053] 反应膜本底稱白时间：10-30分钟，越快越好
[0化4] 杠色均匀性:裸眼直接认读 [0055] 具体检测结果对比见下表：
[0化6]
[0化7] 实施例2
[005引丙型肝炎抗体胶体金检测试纸提高灵敏度、减少假阳发生率、改良HOOK效应、加快 反应膜本底稱白、提升杠色均匀。
[0化9] 2_1制备过程：
[0060] 1)反应膜(4):将0.6mg/ml的丙型肝炎基因重组抗原A及1. Omg/ml的羊抗鼠多克隆 抗体平行包被于硝酸纤维膜的检测线位及对照线位，惊干制得反应膜4;
[0061] 2)胶体微粒(金标)结合物释放垫2:用巧樣酸Ξ钢还原法制得粒径为40nm的胶体 金颗粒，用相当于胶体金溶液质量0.7% (质量百分数）的0.1M/L碳酸钟调整PH值，再加入 lOug/ml丙型肝炎基因重组抗原B，快速混匀并加入相当于胶体金溶液质量1% (质量百分 数)体积的稳定剂，高速冷冻离屯、机5000转/分钟、10000转/分钟两次离屯、收集金标沉淀，用 纯化水及稳定剂等稀释金标沉淀涂布于无纺布上制得胶体微粒(金标)结合物释放垫2;
[0062] 注:用实施例1中所述同等条件标记鼠 IgG-起涂布于胶体微粒(金标)结合物释放 垫2中做为对照线5显色用。
[00创 3)样品垫1:用浓度为211^(毫摩尔）/1，？巧直为8.6的化13-肥1缓冲盐、0.1%(质量 百分数)的0P-10表面活性剂涂布玻璃纤维上，惊干制得样品垫1;
[0064] 4)胶体微粒(金标)结合物缓冲垫8:用2mM(毫摩尔)/L，PH值为8.0的棚酸缓冲盐， 0.05% (质量百分数）的吐溫20,0.45% (质量百分数)NaCl ,0.1% (质量百分数）酪蛋白， 0.02% (质量百分数)PVA涂布于无纺纸上，惊干制得缓冲垫(8)。
[00化]2-2组装：
[0066] 传统旧有模式(图1)
[0067] 在背衬(7)上，吸收垫(6)压贴反应膜(4)靠对照线(5)侧约0.5-lmm，胶体微粒(金 标)结合物释放垫（2)压贴反应膜(4)靠检测线（3)侧约0.5-lmm，样品垫（1)压贴胶体微粒 (金标)结合物释放垫(2)约2-3mm;
[0068] 新型改进模式(图2)
[0069] 在背衬（7)上，吸收垫（6)压贴反应膜(4)靠对照线5侧约0.5-lmm，胶体微粒（金 标)结合物缓冲垫(8)压贴反应膜(4)靠检测线（3)侧约0.5-lmm，胶体微粒(金标)结合物释 放垫（2)压贴缓冲垫（8)约2-3mm，样品垫（1)压贴胶体微粒（金标）结合物释放垫（2)约2-3mm；
[0070] 2-3检测方法：
[0071] 将试纸直接插入约80ul血清/血浆/全血样品或参考品中约5-10秒，取出平放，10-30分钟内观察结果，30分钟后无效；
[0072] 检测样本:2NCU/ml参考品巧00份临床随机阴性血清/血浆/全血+45份临检阳性样 本(含5份超强阳性样本）
[0073] 2-4检测结果：
[0074] 临床上主要的产品性能指标说明：
[0075] 灵敏度:采用2NCU/ml参考品检测
[0076] 总体符合率:真阴性、真阳性的临床符合性
[0077] 假阳率:错误的阳性结果占真阴性的比率
[0078] 反应膜本底稱白时间：10-30分钟，越快越好
[0079] 超强阳化00K):临床超强阳性血清样本5份
[0080] 杠色均匀性:裸眼直接认读
[0081] 具体检测结果对比见下表：
[0082]
[0083] 实施例3
[0084] 安非他明胶体金检测试纸提升灵敏度、加快反应膜本底稱白、提升杠色均匀。
[0085] 3-1制备过程：
[0086] 1)反应膜4:将0.2mg/ml的安非他明-BSA偶联物及0.8mg/ml的羊抗鼠多克隆抗体 平行包被于硝酸纤维膜的检测线位及对照线位，惊干制得反应膜4;
[0087] 2)胶体微粒(金标)结合物释放垫2:用巧樣酸Ξ钢还原法制得粒径为40nm的胶体 金颗粒，用相当于胶体金溶液质量0.9% (质量百分数）的0.1M/L碳酸钟调整PH值，再加入 lOug/ml安非他明单克隆抗体，快速混匀并加入相当于胶体金溶液质量1% (质量百分数)的 稳定剂，高速冷冻离屯、机5000转/分钟、10000转/分钟两次离屯、收集金标沉淀，用纯化水及 稳定剂等稀释金标沉淀涂布于无纺布上制得胶体微粒(金标)结合物释放垫2;
[008引 3)样品垫1:用浓度为2mM/L，PH值为8.6的Tri S-HC1缓冲盐、0.1 % (质量百分数）的 吐溫20表面活性剂涂布玻璃纤维上，惊干制得样品垫1;
[0089] 4)胶体微粒（金标）结合物缓冲垫8:用浓度为2mM/L，PH值为8.0的化iS-HC1缓冲 盐、0.02% (质量百分数)的十二烷基硫酸钢、浓度为2mM/L的抓TA-Na2、0.1 % (质量百分数） 酪蛋白、0.05% (质量百分数)PVP-K30涂布于无纺纸上，惊干制得缓冲垫8。
[0090] 3-2 组装：
[0091] 传统旧有模式(图1)
[0092] 在背衬(7)上，吸收垫(6)压贴反应膜(4)对照线巧)侧约0.5-lmm，胶体微粒(金标） 结合物释放垫（2)压贴反应膜(4)靠检测线（3)侧约0.5-lmm，样品垫（1)压贴胶体微粒(金 标)结合物释放垫(2)约2-3mm;
[0093] 新型改进模式(图2)
[0094] 在背衬7上，吸收垫(6)压贴反应膜(4)靠对照线(5)侧约0.5-lmm，胶体微粒(金标） 结合物缓冲垫(8)压贴反应膜(4)靠检测线(3)侧约0.5-lmm，胶体微粒(金标)结合物释放垫 2压贴缓冲垫(8)约2-3mm，样品垫1压贴胶体微粒(金标)结合物释放垫2约2-3mm;
[00巧]3-3检测方法：
[0096] 将试纸直接插入约80ul尿液及参考品3 -5秒，取出平放，5-15分钟内观察结果，20 分钟后无效；
[0097] 检测样本:100化g/ml、50化g/ml参考品巧0份临床随机尿液+40份阳性尿液
[0098] 3-4检测结果：
[0099] 临床上主要的产品性能指标说明：
[0100] 灵敏度:采用l〇〇〇ng/ml、5(K)ng/ml参考品检测
[0101] 总体符合率:真阴性、真阳性的临床符合性
[0102] 反应膜本底稱白时间：5-15分钟，越快越好
[0103] 杠色均匀性:裸眼直接认读
[0104] 具体检测结果对比见下表：
[0105]
[0106] 实施例4
[0107] 淋病胶体金检测试纸提升灵敏度、改善册0K效应、加快反应膜本底稱白、提升杠色 均匀；
[0108] 4-1制备过程：
[0109] 1)反应膜4:将1 .Omg/ml的淋球菌单克隆抗体A及1 .Omg/ml的羊抗鼠多克隆抗体平 行包被于硝酸纤维膜的检测线位及对照线位，惊干制得反应膜4;
[0110] 2)胶体微粒(金标)结合物释放垫2:用巧樣酸Ξ钢还原法制得40nm的胶体金颗粒， 用相当于胶体金溶液质量0.8% (质量百分数)的0.1M/L碳酸钟调整PH值，再加入lOug/ml淋 球菌单克隆抗体B，快速混匀并加入相当于胶体金溶液质量1 % (质量百分数）的稳定剂，高 速冷冻离屯、机5000转/分钟、10000转/分钟两次离屯、收集金标沉淀，用纯化水及稳定剂等稀 释金标沉淀涂布于无纺布上制得胶体微粒(金标)结合物释放垫2;
[0111] 3)样品垫1:用浓度为2mM/L，PH值为7.4的憐酸缓冲盐、0.1% (质量百分数)的吐溫 20表面活性剂涂布玻璃纤维上，惊干制得样品垫1;
[0112] 4)缓冲垫8:用浓度为5mM/L，PH值为7.6的憐酸缓冲盐、0.05% (质量百分数）的十 二烷基硫酸钢、0.1% (质量百分数)酪蛋白、0.05% (质量百分数)PVP-K30涂布于无纺纸上， 惊干制得缓冲垫8。
[0113] 5)样本裂解液:裂解A液为0.05% (质量百分数)的十二烷基硫酸钢+2% (质量百分 数)NaCl，裂解B液为5mM/L，PH值为7.6的憐酸缓冲盐。
[0114] 4-2 组装：
[011引传统旧有模式(图1)
[0116] 在背衬(7)上，吸收垫(6)压贴反应膜(4)靠对照线(5)侧约0.5-lmm，胶体微粒(金 标)结合物释放垫（2)压贴反应膜(4)靠检测线（3)侧约0.5-lmm，样品垫（1)压贴胶体微粒 (金标)结合物释放垫(2)约2-3mm;
[0117] 新型改进模式(图2)
[0118] 在背衬(7)上，吸收垫(6)压贴反应膜(4)靠对照线(5)侧约0.5-lmm，胶体微粒(金 标)结合物缓冲垫(8)压贴反应膜(4)靠检测线（3)侧约0.5-lmm，胶体微粒(金标)结合物释 放垫2压贴缓冲垫(8)约2-3mm，样品垫1压贴胶体微粒(金标)结合物释放垫(2)约2-3mm;
[0119] 4-3检测方法：
[0120] 将采集的标本置于300ul的裂解A液中2-3分钟上，再加入lOOul裂解B液混匀1-2分 钟，试纸直接插入约80ul混匀后的裂解液及参考品中3-5秒，取出平放，5-15分钟内观察结 果，20分钟后无效；
[0121 ] 检测样本:lX107CFU/ml、2X106CFU/ml参考品+40份临床随机样本+20份临床阳性样 品(含1份超强阳性样本）
[0122] 4-4检测结果：
[0123] 临床上主要的产品性能指标说明：
[0124] 灵敏度:采用lX107CFU/ml、2X106C即/ml参考品检测
[0125] 总体符合率:真阴性、真阳性的临床符合性
[0126] 反应膜本底稱白时间：5-15分钟，越快越好
[0127] 超强阳性化00K):临床超强阳性样本1份
[0128] 杠色均匀性:裸眼直接认读
[0129] 具体检测结果对比见下表：
[0130]
[0131]本发明中，所述百分比浓度没有特别指出的，均为质量百分比浓度。
【主权项】
1. 一种新型改进免疫层析试纸条，包括顺次搭接粘贴在背衬上的样品垫、标记了抗待 测物抗体的胶体微粒结合物释放垫、反应膜、吸收垫，其特征在于:待测物抗体的胶体微粒 释放垫与作为显示区的反应膜之间设有一个缓冲垫。2. 根据权利要求1所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:所述缓冲垫选用 的材质包括:玻璃纤维、滤纸、无纺布、无尘纸、反应膜聚酯膜或高分子复合物。3. 根据权利要求2所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于： 所述缓冲垫的尺寸为:厚度〇 · 1臟一1mm，长度3mm-10mm〇4. 根据权利要求1-3任一所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:所述缓冲 垫，让从胶体微粒结合物释放垫上崩解下来的抗待测物抗体的胶体微粒上反应膜之前，能 在其内更均一地溶解在检测样品中，并获得相对充足的反应时间与对应的目的检测物进行 更充分地免疫反应。5. 根据权利要求4所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:所述标记的抗待 测物抗体的胶体微粒为胶体金。6. 根据权利要求5所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:缓冲垫中进一步 引入缓冲盐体系。7. 根据权利要求6所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:缓冲垫引入缓冲 盐体系包括:碳酸盐缓冲盐、硼酸盐缓冲盐、磷酸盐缓冲盐、柠檬酸盐缓冲盐或Tris-HCl缓 冲盐。8. 根据权利要求7所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:缓冲垫引入的缓 冲盐体系所控制的PH值范围为6-10。9. 根据权利要求8所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:缓冲垫引入的缓 冲盐体系所控制的PH值范围为7.4-8.5。10. 根据权利要求9所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:检测样本为血 液类时，缓冲垫引入缓冲盐体系为硼酸盐缓冲盐;检测样本为尿液，缓冲垫引入缓冲盐体系 为Tris-HCl缓冲盐;检测样本为分泌物时，缓冲垫引入缓冲盐体系为磷酸盐缓冲盐。11. 根据权利要求6-10中任一所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:在缓 冲垫引入缓冲盐体系的基础上，进一步加入表面活性剂。12. 根据权利要求11所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:缓冲垫上加入 的表面活性剂选自非离子型表面活性剂或阴离子型表面活性剂。13. 根据权利要求12所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:缓冲垫上加入 的表面活性剂质量百分比浓度范围为0.02%-0.5%。14. 根据权利要求13所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:缓冲垫上加入 表面活性剂的质量百分比浓度范围为0.05%-0.2%。15. 根据权利要求14所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:缓冲垫上加入 的非离子型表面活性剂选自：吐温系列、曲通系列、NP系列、OP乳化剂系列、高级脂肪醇聚氧 乙烯醚及高级脂肪醇聚氧丙烯醚系列； 缓冲垫上加入的阴离子型表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、直链烷基苯磺酸钠、a-烯 烃磺酸盐、烷基磺酸盐、X-磺基单羧酸及其衍生物、脂肪酸磺烷基酯和脂肪酸磺烷基酰胺、 油酰氧基乙磺酸钠、二辛基琥珀酸磺酸钠、胆酸钠、去氧胆酸钠、硫酸酯盐、磷酸酯盐及其类 似结构的阴离子表面活性剂。16. 根据权利要求14所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:缓冲垫上加入 的表面活性剂为吐温-20或十二烷基硫酸钠。17. 根据权利要求15所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于:缓冲垫中可进 一步引入其它试剂，所述其它试剂选自无机盐及金属络合剂、亲水的高分子、天然生物大分 子、动物血清、蛋白A、植物凝集素、特异性抗体或抗原、阻断剂中的一种或几种。18. 根据权利要求17所述的一种新型改进免疫层析试纸条，其特征在于： 所述无机盐及金属络合剂选自NaCl、NaC03、K2C03、EDTA、EDTA-Na2; 所述亲水的高分子选自PVP系列、PEG系列、PVA系列及天然的琼脂、明胶； 所述天然生物大分子选自BSA系列、OVA系列、酪蛋白、奶粉及脱脂奶粉； 所述动物血清选自小鼠血清、山羊血清、羊血清。19. 一种新型改进免疫层析试纸条的应用，其特征在于应用于检测肝炎、淋病或毒品。20. 根据权利要求19所述的一种新型改进免疫层析试纸条的应用，其特征在于所述肝 炎为乙肝或丙肝，所述毒品为安非他明。
【专利摘要】本发明提供了一种新型改进免疫层析试纸条及其制备和应用。本发明在标记了待测物抗体的胶体微粒结合物释放垫与反应膜之间增设一个缓冲垫，让从释放垫上崩解下来的抗待测物抗体的胶体微粒上反应膜之前，能在缓冲垫内更均一地溶解在检测样品中，并获得相对充足的反应时间与对应的目的检测物进行更充分地免疫反应，从而达到抗待测物抗体与样品中目的检测物反应效率的最大化。本发明与现有的免疫层析试纸条相比，具有灵敏度高、假阳率低及检测线色均匀等优点，而且成本低廉，制作简便，适用于各种形式的免疫层析法检测试纸。
【IPC分类】G01N33/571, G01N33/94, G01N33/576, G01N33/558
【公开号】CN105486859
【申请号】CN201510814878
【发明人】余期川, 郑会义
【申请人】润和生物医药科技(汕头)有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年11月20日
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