基于特异性多抗的结核分枝杆菌抗原检测方法
基于特异性多抗的结核分枝杆菌抗原检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属临床免疫检测技术领域，涉及结核分枝杆菌特异性抗原的检测方法。
【背景技术】
[0002] 结核病（TuberculosisiTB)是一种古老的疾病。目前，由于缺乏有效的疫苗，缺乏 高特异性和敏感性诊断试剂及耐药性结核病的不断涌现等原因，该病仍然是全球公共卫生 的重大威胁。2014年世界卫生组织（World化alth化ganization，WH0)发布报告，在2012 年估计有860万新发病例，130万人死于结核病，其中有30万人为HIV阳性。我国TB发病 率为100万，仅次于印度，居世界第2位。所W TB的预防和控制在我国尤为重要。
[0003] 有效控制TB的障碍在于缺乏早期、准确的诊断方法。分枝杆菌培养是诊断的金 标准，但耗时长且相对昂贵；涂片镜检法检出率低；分子生物学检测技术对实验设备和操 作要求较高，易出现假阳性结果；特异性的细胞免疫检测，因在发展中国家人群中结核分枝 杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB)的潜伏感染率高，不适合推广使用；临床症状 及胸部X光检查的结果不是特异性的，需要其他辅助诊断。再者，肺外结核、艾滋（Human Immunodeficiency Virus, HIV)合并感染的TB、婴幼儿感染的TB、菌阴TB的诊断对上述的 方法都是巨大的挑战。
[0004] 机体受到MTB感染后，体内首先出现的是MTB特异性抗原，TB抗原检测不受宿主免 疫功能状态的影响，可W作为MTB存在的直接证据，避免了由于结核菌的抗原性较弱、属间 和种间共同抗原决定簇的存在，W及TB患者免疫应答低下等原因导致的体液免疫检测或 细胞免疫检测的假阳性及假阴性问题；TB抗原检测为活动性肺结核的诊断提供了确定的 证据，提示可W立即启动抗结核治疗；TB抗原检测快速、操作方便，如果发展成床旁检测， 抗原检测方法可W将结核病的诊断扩展到远程卫生室甚至患者家庭；TB抗原检测可W 了 解待检样本中MTB抗原浓度与患者治疗前后的疾病状态之间的关系，从而有助于监测治疗 是否成功及治疗是否复发。因此MTB抗原定性定量的检测方法可能具有很高的应用价值。
[0005] 化学发光免疫分析（Qiemiluminescence Immunoassay, CLIA)是近年来继放射免 疫分析和酶免疫分析之后发展起来的一种高灵敏度的微量测定技术，具有高灵敏度、检测 范围广、操作简便快速等优点，作为放射性免疫分析、酶免疫分析的替代者，是当前最理想 的免疫分析方法。
[0006] 目前商业化结核分枝杆菌抗原检测试剂盒都是基于单一抗原的检测，仅检测一种 抗原，检测灵敏度较低，限制了抗原检测方法在临床中的应用，需要开发灵敏度更高的结核 分枝杆菌抗原检测方法。
【发明内容】
[0007] 先前检测抗原的研究都是针对单一抗原进行，本发明则采用融合抗原制备多克隆 抗体进行检测，可W同时检测Η种不同的抗原，较单一抗原相比可W提高敏感性。本发明提 供了双抗体夹必检测结核分枝杆菌特异性抗原的检测方法，包括W下步骤：
[0008] a 制备融合抗原 38邸-ESAT6-CFP10 ;
[000引 b使用a中制备的融合抗原38邸-ESAT6-CFP10巧[J备抗体；
[0010] C将b中制备的抗体包被板；
[0011] d向包被后的板中加入测试样品，使测试样品中的结核分枝杆菌抗原与所包被抗 体结合；
[001引 f丢弃板中液体；
[0013] g向板中加入经过标记的在b中制备的抗体，W检测样品中的结核分枝杆菌抗原。
[0014] 其中所制备的抗体为多克隆抗体，通过非人哺乳动物制备，包括兔、绵羊、山羊、 马、戰或豚鼠等。其中步骤g中的抗体用酶，辣根过氧化物酶或碱性磯酸酶，标记，或者用生 物素进行标记。其中所述样品是细菌培养上清、细菌裂解液、血清、血浆、姨、胸水、腹水或尿 液。
[0015] 本发明还提供了另一种检测结核分枝杆菌特异性抗原检测方法，包括W下步骤：
[0016] a 制备融合抗原 38邸-ESAT6-CFP10 ;
[0017] b使用a制备的融合抗原38邸-ESAT6-CFP10制备抗体；
[001引 C将b中制备的抗体包被板；
[0019] d向包被后的板中加入测试样品，使测试样品中的结核分枝杆菌抗原与包被抗体 结合；
[0020] f丢弃板中液体；
[0021] g向板中加入在b中制备的抗体，使其与板中的结核分枝杆菌抗原结合；
[0022] h再次弃去板中液体；
[0023] I加入经过标记的抗b中制备抗体来源物种的次级抗体，W检测样品中的结核分 枝杆菌抗原。
[0024] 其中所制备的抗体为多克隆抗体，通过非人哺乳动物制备，包括兔、绵羊、山羊、 马、戰或豚鼠等。其中步骤I中标记的次级抗体用酶，辣根过氧化物酶或碱性磯酸酶，标记， 或者用生物素进行标记。其中所述样品是细菌培养上清、细菌裂解液、血清、血浆、姨、胸水、 腹水或尿液。
【附图说明】
[0025] 图1显示结核分枝杆菌特异性抗原检测的标准曲线
[0026] 图2显示1、2、3、4、10号结核患者在不同治疗时间段血清中抗原浓度变化
[0027] 图3显示5、6号结核患者在不同治疗时间段血清中抗原浓度变化
[0028] 图4显示7、8、11号结核患者在不同治疗时间段血清中抗原浓度变化
[0029] 图5显示培养上清中的结核特异性抗原浓度分布 具体实施方案
[0030] 实施例1结核分枝杆菌特异性多克隆抗体的制备
[0031] 1. W结核分枝杆菌册7RV基因组序列为模板，通过基因工程手段，克隆融合蛋白 38邸-ESAT6-CFP10 基因，序列为沈Q ID NO 1。
[003引 2.将克隆基因转入表达载体，表达融合蛋白38邸-ESAT6-CFP10,序列为SEQ ID NO 2，通过凝胶电泳及测序进行分析。
[0033] 3.采用离子交换层析纯化技术，纯化表达融合蛋白。
[0034] 4.将纯化的融合蛋白采用标准的免疫程序免疫家兔，获得相应的多克隆抗体，并 通过辛酸-硫酸倭沉淀法纯化得到IgG。
[0035] 5.采用改良过贿酸钢法，用辣根过氧化物酶标记纯化的融合蛋白IgG。
[0036] 实施例2双抗体夹必结核分枝杆菌抗原化学发光定性定量检测方法的建立
[0037] 经方阵滴定，确定包被抗体浓度、酶标抗体浓度，并配备其他相关试剂，建立双抗 体夹必结核分枝杆菌抗原化学发光定性定量检测方法，具体步骤如下：
[0038] 1.包被；取多抗38邸-ESAT6-CFP10 W 2. 5 μ g/ml的浓度溶解于碳酸盐缓冲液中， W ?οομ 1/孔加入化学发光板中，4°C赔育16h W上；
[003引 2.洗板；用1 X PBS、PH7. 2~7. 4的缓冲液洗板2次；
[0040] 3.封闭；用封闭液W 100μ 1/孔加入化学发光板中，4°C赔育16h ;
[0041] 4.干燥；在温度18~26°C、湿度< 20%条件下干燥过夜。
[0042] 5.封袋；用铅巧袋抽真空封装包被板2~8Γ保存。
[0043] 6.加样；在96孔化学发光酶标板的包被孔中，每孔加入50μ 1样品处理液，然后 分别加入50 μ 1待测样品，37°C赔育60min〇
[0044] 7.洗板；用洗板机W洗涂液洗板5次，在吸水纸上拍干。
[004引 8.加酶：每孔中加入100 μ 1抗38邸-ESAT6-CFP10多克隆抗体酶结合物，37°C赔 育45分钟。
[004引 9.洗板；同步骤似。
[0047] 10.加底物海孔中先后加入化学发光底物液A、化学发光底物液B各50 μ 1，避光 显色< 5分钟。
[0048] 11.测定；显色反应后，使用化学发光检测仪检测发光信号值并记录。
[ 0049] 12. W阴性对照发光度（RLU)的平均值巧500为临界值（CUT OFF);待检样品的 化11值>临界值（CUT OF巧为阳性，待检样品化11值<临界值（CUT OF巧为阴性。
[0050] 实施例3标准曲线的建立
[0051] 1.将抗原标准品稀释为 0ng/ml、2. 5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、 80ng/ml，按实施例2的方法进行检测。
[0052] 2. W标准品浓度值的对数值为横坐标狂轴），W标准品发光强度值的对数值为纵 坐标灯轴），建立标准曲线，进行计算。
[0053] 3.检测结果表1所示：
[0054] 表1抗原标准品的检测
[00 巧]
[0056] 标准曲线为y = 0. 7917X+4. 607 (R2 = 0. 9998)(图1)，同时得到抗原浓度的计算 方程式为y = 15583x+89992(R2 = 0. 9962)。可W看出，建立的结核分枝杆菌抗原化学发光 定性定量检测方法的检测范围大，精密度及准确性都比较高。
[0057] 实施例4接受治疗的结核患者血清中的抗原浓度测定
[0058] 按实施例2方法定量检测接受治疗的12例结核患者血清中的结核分枝杆菌特异 性抗原，结果如表2所示，数值为血清中结核分枝杆菌特异性抗原的浓度。
[0059] 表2接受治疗的结核患者在不同时间段血清中抗原浓度的变化
[0060]
[0061] 注表示检测得到的化学发光值低于cut-off值
[0062] 如上表，1、2、3、4、10号结核患者在接受治疗后15天开始，血清中的抗原浓度有大 幅的下降，随着治疗的进行，抗原浓度越来越低；5、6号结核患者在开始接受治疗时，血清 中的抗原浓度有较大幅度的下降，但到150天时，抗原浓度大幅升高，继续接受治疗到180 天时血清中的抗原浓度又开始下降；7、8、11号结核患者在接受治疗后，血清中的抗原浓度 出现一定程度的下降，同时伴随着治疗时间的延长，浓度在持续的下降；9、12号结核患者 在接受治疗15天一直到180天时，在血清中已经检测不到结核特异性抗原的存在。
[0063] 实施例5分枝杆菌培养上清中的抗原浓度检测
[0064] 按实施例2方法定性、定量检测结核分枝杆菌培养上清中的特异性抗原：在50份 培养阳性的上清中结核分枝杆菌特异性抗原的检出率为92% (46/50)，对46例抗原检测呈 阳性的上清中抗原浓度进行计算，得到的特异性抗原的浓度范围为0. 79ng/ml~39. 9ng/ ml ;在59份分枝杆菌培养阴性的上清中，结核分枝杆菌特异性抗原的检出率为27. 11% (16/59)，对16份抗原检测呈阳性的上清中的抗原浓度进行计算，得到特异性抗原的浓度 为 0. 75ng/ml ~23. 78ng/ml。
[0065] 实施例6与抗体联合检测的应用
[0066] 1.按实施例2方法定性检测151例结核病患者血清，与市售的商业抗体检测试剂 盒A进行联合检测，结果如表3所示：
[0067] 表3与商业化试剂盒A的检测结果
[0068]
[0069] 如上表，结核分枝杆菌抗原检测联合试剂盒A抗体检测，可将检出率从只使用试 剂盒A检测的48. 34 %提高到60. 93%。
[0070] 2.按实施例2方法定性检测151例结核病患者血清，与市售的商业抗体检测试剂 盒B进行联合检测，结果如表3所示：
[0071] 表3与商业化试剂盒B的检测结果
[0072]
[0073] 如上表，结核分枝杆菌抗原检测联合试剂盒B抗体检测，可将检出率从只使用试 剂盒B检测的59. 6 %提高到66. 89%。
[0074] 3.按实施例2方法定性检测151例结核病患者血清，与市售的商业抗体检测试剂 盒A和B进行联合检测，结果如表4所示：
[0075] 表4与商业化试剂盒A和B的检测结果
[0076]
[0077] 如上表，结核分枝杆菌抗原检测联合试剂盒A和B抗体检测，可将检出率从使用试 剂盒A和B (至少有一个为阳性）检测的68. 87%提高到76. 16%。
[0078] 通过W上实例，可W明确显示出本发明具有特异性强、灵敏度高，能定量检测待测 样本中的结核分枝杆菌特异性抗原，与抗体联合检测能提高检出率，而且没有产生任何污 染，对结核病的诊断及治疗疗效的监测具有一定的辅助作用。
【主权项】
1. 一种检测结核分枝杆菌抗原的方法，其特征在于包括下列步骤： a制备融合抗原38KD-ESAT6-CFP10 ; b使用a中制备的融合抗原38KD-ESAT6-CFP10制备抗体；c将b中制备的抗体包被板； d向包被后的板中加入测试样品，使测试样品中的结核分枝杆菌抗原与所包被抗体结 合； f丢弃板中液体； g向板中加入经过标记的在b中制备的抗体，以检测样品中的结核分枝杆菌抗原。2. 权利要求1的方法，其特征在于，所述抗体是多克隆抗体。3. 权利要求2的方法，其特征在于，所述多克隆抗体通过非人哺乳动物制备。4. 权利要求3的方法，其特征在于，所述非人哺乳动物是兔、绵羊、山羊、马、骡或豚鼠 等。5. 权利要求1或2的方法，其特征在于，所述g中的抗体用酶标记。6. 权利要求5的方法，其特征在于，所述酶是辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。7. 权利要求6的方法，其特征在于，所述样品是细菌培养上清、细菌裂解液、血清、血 浆、痰、胸水、腹水或尿液。8. 权利要求1或2的方法，其特征在于，所述g中的抗体用生物素标记。9. 权利要求8的方法，其特征在于，所述样品是细菌培养上清、细菌裂解液、血清、血 浆、痰、胸水、腹水或尿液。10. -种检测结核分枝杆菌抗原的方法，其特征在于包括下列步骤： a制备融合抗原38KD-ESAT6-CFP10 ; b使用a制备的融合抗原38KD-ESAT6-CFP10制备抗体；c将b中制备的抗体包被板； d向包被后的板中加入测试样品，使测试样品中的结核分枝杆菌抗原与包被抗体结 合； f丢弃板中液体； g向板中加入在b中制备的抗体，使其与板中的结核分枝杆菌抗原结合；h再次弃去板中液体； I加入经过标记的抗b中制备抗体来源物种的次级抗体，以检测样品中的结核分枝杆 菌抗原。11. 权利要求10的方法，其特征在于，所述抗体是多克隆抗体。12. 权利要求11的方法，其特征在于，所述抗体通过非人哺乳动物制备。13. 权利要求12的方法，其特征在于，所述非人哺乳动物是兔、绵羊、山羊、马、骡或豚 鼠等。14. 权利要求10或11的方法，其特征在于，所述I中标记的次级抗体是用酶标记。15. 权利要求14的方法，其特征在于，所述酶是辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。16. 权利要求15的方法，其特征在于，所述样品是细菌培养上清、细菌裂解液、血清、血 浆、痰、胸水、腹水或尿液。17. 权利要求10或11的方法，其特征在于，所述I中标记的次级抗体是用生物素标记。18.权利要求17的方法，其特征在于，所述样品是细菌培养上清、细菌裂解液、血清、血 浆、痰、胸水、腹水或尿液。
【专利摘要】本发明属临床免疫检测技术领域，涉及结核分枝杆菌抗原的检测方法。采用基因工程手段获得结核分枝杆菌特异性抗原38KD，ESAT6，CFP10融合表达所产生的融合蛋白38KD-ESAT6-CFP10。以上述抗原免疫动物所产生的免疫血清经纯化得到抗38KD-ESAT6-CFP10多克隆抗体，用于包被及检测。建立双抗体夹心结核分枝杆菌抗原检测方法。该方法优势在于灵敏度高、特异性强，能定量检测待测样本中的结核分枝杆菌特异性抗原，同时与抗体联合检测能提高阳性检出率。
【IPC分类】G01N33/569
【公开号】CN105486860
【申请号】CN201410524707
【发明人】冯晓燕, 张贺秋, 戴振华, 修冰水, 杨锡琴
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年10月9日
【技术领域】
[0001] 本发明属临床免疫检测技术领域，涉及结核分枝杆菌特异性抗原的检测方法。
【背景技术】
[0002] 结核病（TuberculosisiTB)是一种古老的疾病。目前，由于缺乏有效的疫苗，缺乏 高特异性和敏感性诊断试剂及耐药性结核病的不断涌现等原因，该病仍然是全球公共卫生 的重大威胁。2014年世界卫生组织（World化alth化ganization，WH0)发布报告，在2012 年估计有860万新发病例，130万人死于结核病，其中有30万人为HIV阳性。我国TB发病 率为100万，仅次于印度，居世界第2位。所W TB的预防和控制在我国尤为重要。
[0003] 有效控制TB的障碍在于缺乏早期、准确的诊断方法。分枝杆菌培养是诊断的金 标准，但耗时长且相对昂贵；涂片镜检法检出率低；分子生物学检测技术对实验设备和操 作要求较高，易出现假阳性结果；特异性的细胞免疫检测，因在发展中国家人群中结核分枝 杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB)的潜伏感染率高，不适合推广使用；临床症状 及胸部X光检查的结果不是特异性的，需要其他辅助诊断。再者，肺外结核、艾滋（Human Immunodeficiency Virus, HIV)合并感染的TB、婴幼儿感染的TB、菌阴TB的诊断对上述的 方法都是巨大的挑战。
[0004] 机体受到MTB感染后，体内首先出现的是MTB特异性抗原，TB抗原检测不受宿主免 疫功能状态的影响，可W作为MTB存在的直接证据，避免了由于结核菌的抗原性较弱、属间 和种间共同抗原决定簇的存在，W及TB患者免疫应答低下等原因导致的体液免疫检测或 细胞免疫检测的假阳性及假阴性问题；TB抗原检测为活动性肺结核的诊断提供了确定的 证据，提示可W立即启动抗结核治疗；TB抗原检测快速、操作方便，如果发展成床旁检测， 抗原检测方法可W将结核病的诊断扩展到远程卫生室甚至患者家庭；TB抗原检测可W 了 解待检样本中MTB抗原浓度与患者治疗前后的疾病状态之间的关系，从而有助于监测治疗 是否成功及治疗是否复发。因此MTB抗原定性定量的检测方法可能具有很高的应用价值。
[0005] 化学发光免疫分析（Qiemiluminescence Immunoassay, CLIA)是近年来继放射免 疫分析和酶免疫分析之后发展起来的一种高灵敏度的微量测定技术，具有高灵敏度、检测 范围广、操作简便快速等优点，作为放射性免疫分析、酶免疫分析的替代者，是当前最理想 的免疫分析方法。
[0006] 目前商业化结核分枝杆菌抗原检测试剂盒都是基于单一抗原的检测，仅检测一种 抗原，检测灵敏度较低，限制了抗原检测方法在临床中的应用，需要开发灵敏度更高的结核 分枝杆菌抗原检测方法。
【发明内容】
[0007] 先前检测抗原的研究都是针对单一抗原进行，本发明则采用融合抗原制备多克隆 抗体进行检测，可W同时检测Η种不同的抗原，较单一抗原相比可W提高敏感性。本发明提 供了双抗体夹必检测结核分枝杆菌特异性抗原的检测方法，包括W下步骤：
[0008] a 制备融合抗原 38邸-ESAT6-CFP10 ;
[000引 b使用a中制备的融合抗原38邸-ESAT6-CFP10巧[J备抗体；
[0010] C将b中制备的抗体包被板；
[0011] d向包被后的板中加入测试样品，使测试样品中的结核分枝杆菌抗原与所包被抗 体结合；
[001引 f丢弃板中液体；
[0013] g向板中加入经过标记的在b中制备的抗体，W检测样品中的结核分枝杆菌抗原。
[0014] 其中所制备的抗体为多克隆抗体，通过非人哺乳动物制备，包括兔、绵羊、山羊、 马、戰或豚鼠等。其中步骤g中的抗体用酶，辣根过氧化物酶或碱性磯酸酶，标记，或者用生 物素进行标记。其中所述样品是细菌培养上清、细菌裂解液、血清、血浆、姨、胸水、腹水或尿 液。
[0015] 本发明还提供了另一种检测结核分枝杆菌特异性抗原检测方法，包括W下步骤：
[0016] a 制备融合抗原 38邸-ESAT6-CFP10 ;
[0017] b使用a制备的融合抗原38邸-ESAT6-CFP10制备抗体；
[001引 C将b中制备的抗体包被板；
[0019] d向包被后的板中加入测试样品，使测试样品中的结核分枝杆菌抗原与包被抗体 结合；
[0020] f丢弃板中液体；
[0021] g向板中加入在b中制备的抗体，使其与板中的结核分枝杆菌抗原结合；
[0022] h再次弃去板中液体；
[0023] I加入经过标记的抗b中制备抗体来源物种的次级抗体，W检测样品中的结核分 枝杆菌抗原。
[0024] 其中所制备的抗体为多克隆抗体，通过非人哺乳动物制备，包括兔、绵羊、山羊、 马、戰或豚鼠等。其中步骤I中标记的次级抗体用酶，辣根过氧化物酶或碱性磯酸酶，标记， 或者用生物素进行标记。其中所述样品是细菌培养上清、细菌裂解液、血清、血浆、姨、胸水、 腹水或尿液。
【附图说明】
[0025] 图1显示结核分枝杆菌特异性抗原检测的标准曲线
[0026] 图2显示1、2、3、4、10号结核患者在不同治疗时间段血清中抗原浓度变化
[0027] 图3显示5、6号结核患者在不同治疗时间段血清中抗原浓度变化
[0028] 图4显示7、8、11号结核患者在不同治疗时间段血清中抗原浓度变化
[0029] 图5显示培养上清中的结核特异性抗原浓度分布 具体实施方案
[0030] 实施例1结核分枝杆菌特异性多克隆抗体的制备
[0031] 1. W结核分枝杆菌册7RV基因组序列为模板，通过基因工程手段，克隆融合蛋白 38邸-ESAT6-CFP10 基因，序列为沈Q ID NO 1。
[003引 2.将克隆基因转入表达载体，表达融合蛋白38邸-ESAT6-CFP10,序列为SEQ ID NO 2，通过凝胶电泳及测序进行分析。
[0033] 3.采用离子交换层析纯化技术，纯化表达融合蛋白。
[0034] 4.将纯化的融合蛋白采用标准的免疫程序免疫家兔，获得相应的多克隆抗体，并 通过辛酸-硫酸倭沉淀法纯化得到IgG。
[0035] 5.采用改良过贿酸钢法，用辣根过氧化物酶标记纯化的融合蛋白IgG。
[0036] 实施例2双抗体夹必结核分枝杆菌抗原化学发光定性定量检测方法的建立
[0037] 经方阵滴定，确定包被抗体浓度、酶标抗体浓度，并配备其他相关试剂，建立双抗 体夹必结核分枝杆菌抗原化学发光定性定量检测方法，具体步骤如下：
[0038] 1.包被；取多抗38邸-ESAT6-CFP10 W 2. 5 μ g/ml的浓度溶解于碳酸盐缓冲液中， W ?οομ 1/孔加入化学发光板中，4°C赔育16h W上；
[003引 2.洗板；用1 X PBS、PH7. 2~7. 4的缓冲液洗板2次；
[0040] 3.封闭；用封闭液W 100μ 1/孔加入化学发光板中，4°C赔育16h ;
[0041] 4.干燥；在温度18~26°C、湿度< 20%条件下干燥过夜。
[0042] 5.封袋；用铅巧袋抽真空封装包被板2~8Γ保存。
[0043] 6.加样；在96孔化学发光酶标板的包被孔中，每孔加入50μ 1样品处理液，然后 分别加入50 μ 1待测样品，37°C赔育60min〇
[0044] 7.洗板；用洗板机W洗涂液洗板5次，在吸水纸上拍干。
[004引 8.加酶：每孔中加入100 μ 1抗38邸-ESAT6-CFP10多克隆抗体酶结合物，37°C赔 育45分钟。
[004引 9.洗板；同步骤似。
[0047] 10.加底物海孔中先后加入化学发光底物液A、化学发光底物液B各50 μ 1，避光 显色< 5分钟。
[0048] 11.测定；显色反应后，使用化学发光检测仪检测发光信号值并记录。
[ 0049] 12. W阴性对照发光度（RLU)的平均值巧500为临界值（CUT OFF);待检样品的 化11值>临界值（CUT OF巧为阳性，待检样品化11值<临界值（CUT OF巧为阴性。
[0050] 实施例3标准曲线的建立
[0051] 1.将抗原标准品稀释为 0ng/ml、2. 5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、 80ng/ml，按实施例2的方法进行检测。
[0052] 2. W标准品浓度值的对数值为横坐标狂轴），W标准品发光强度值的对数值为纵 坐标灯轴），建立标准曲线，进行计算。
[0053] 3.检测结果表1所示：
[0054] 表1抗原标准品的检测
[00 巧]
[0056] 标准曲线为y = 0. 7917X+4. 607 (R2 = 0. 9998)(图1)，同时得到抗原浓度的计算 方程式为y = 15583x+89992(R2 = 0. 9962)。可W看出，建立的结核分枝杆菌抗原化学发光 定性定量检测方法的检测范围大，精密度及准确性都比较高。
[0057] 实施例4接受治疗的结核患者血清中的抗原浓度测定
[0058] 按实施例2方法定量检测接受治疗的12例结核患者血清中的结核分枝杆菌特异 性抗原，结果如表2所示，数值为血清中结核分枝杆菌特异性抗原的浓度。
[0059] 表2接受治疗的结核患者在不同时间段血清中抗原浓度的变化
[0060]
[0061] 注表示检测得到的化学发光值低于cut-off值
[0062] 如上表，1、2、3、4、10号结核患者在接受治疗后15天开始，血清中的抗原浓度有大 幅的下降，随着治疗的进行，抗原浓度越来越低；5、6号结核患者在开始接受治疗时，血清 中的抗原浓度有较大幅度的下降，但到150天时，抗原浓度大幅升高，继续接受治疗到180 天时血清中的抗原浓度又开始下降；7、8、11号结核患者在接受治疗后，血清中的抗原浓度 出现一定程度的下降，同时伴随着治疗时间的延长，浓度在持续的下降；9、12号结核患者 在接受治疗15天一直到180天时，在血清中已经检测不到结核特异性抗原的存在。
[0063] 实施例5分枝杆菌培养上清中的抗原浓度检测
[0064] 按实施例2方法定性、定量检测结核分枝杆菌培养上清中的特异性抗原：在50份 培养阳性的上清中结核分枝杆菌特异性抗原的检出率为92% (46/50)，对46例抗原检测呈 阳性的上清中抗原浓度进行计算，得到的特异性抗原的浓度范围为0. 79ng/ml~39. 9ng/ ml ;在59份分枝杆菌培养阴性的上清中，结核分枝杆菌特异性抗原的检出率为27. 11% (16/59)，对16份抗原检测呈阳性的上清中的抗原浓度进行计算，得到特异性抗原的浓度 为 0. 75ng/ml ~23. 78ng/ml。
[0065] 实施例6与抗体联合检测的应用
[0066] 1.按实施例2方法定性检测151例结核病患者血清，与市售的商业抗体检测试剂 盒A进行联合检测，结果如表3所示：
[0067] 表3与商业化试剂盒A的检测结果
[0068]
[0069] 如上表，结核分枝杆菌抗原检测联合试剂盒A抗体检测，可将检出率从只使用试 剂盒A检测的48. 34 %提高到60. 93%。
[0070] 2.按实施例2方法定性检测151例结核病患者血清，与市售的商业抗体检测试剂 盒B进行联合检测，结果如表3所示：
[0071] 表3与商业化试剂盒B的检测结果
[0072]
[0073] 如上表，结核分枝杆菌抗原检测联合试剂盒B抗体检测，可将检出率从只使用试 剂盒B检测的59. 6 %提高到66. 89%。
[0074] 3.按实施例2方法定性检测151例结核病患者血清，与市售的商业抗体检测试剂 盒A和B进行联合检测，结果如表4所示：
[0075] 表4与商业化试剂盒A和B的检测结果
[0076]
[0077] 如上表，结核分枝杆菌抗原检测联合试剂盒A和B抗体检测，可将检出率从使用试 剂盒A和B (至少有一个为阳性）检测的68. 87%提高到76. 16%。
[0078] 通过W上实例，可W明确显示出本发明具有特异性强、灵敏度高，能定量检测待测 样本中的结核分枝杆菌特异性抗原，与抗体联合检测能提高检出率，而且没有产生任何污 染，对结核病的诊断及治疗疗效的监测具有一定的辅助作用。
【主权项】
1. 一种检测结核分枝杆菌抗原的方法，其特征在于包括下列步骤： a制备融合抗原38KD-ESAT6-CFP10 ; b使用a中制备的融合抗原38KD-ESAT6-CFP10制备抗体；c将b中制备的抗体包被板； d向包被后的板中加入测试样品，使测试样品中的结核分枝杆菌抗原与所包被抗体结 合； f丢弃板中液体； g向板中加入经过标记的在b中制备的抗体，以检测样品中的结核分枝杆菌抗原。2. 权利要求1的方法，其特征在于，所述抗体是多克隆抗体。3. 权利要求2的方法，其特征在于，所述多克隆抗体通过非人哺乳动物制备。4. 权利要求3的方法，其特征在于，所述非人哺乳动物是兔、绵羊、山羊、马、骡或豚鼠 等。5. 权利要求1或2的方法，其特征在于，所述g中的抗体用酶标记。6. 权利要求5的方法，其特征在于，所述酶是辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。7. 权利要求6的方法，其特征在于，所述样品是细菌培养上清、细菌裂解液、血清、血 浆、痰、胸水、腹水或尿液。8. 权利要求1或2的方法，其特征在于，所述g中的抗体用生物素标记。9. 权利要求8的方法，其特征在于，所述样品是细菌培养上清、细菌裂解液、血清、血 浆、痰、胸水、腹水或尿液。10. -种检测结核分枝杆菌抗原的方法，其特征在于包括下列步骤： a制备融合抗原38KD-ESAT6-CFP10 ; b使用a制备的融合抗原38KD-ESAT6-CFP10制备抗体；c将b中制备的抗体包被板； d向包被后的板中加入测试样品，使测试样品中的结核分枝杆菌抗原与包被抗体结 合； f丢弃板中液体； g向板中加入在b中制备的抗体，使其与板中的结核分枝杆菌抗原结合；h再次弃去板中液体； I加入经过标记的抗b中制备抗体来源物种的次级抗体，以检测样品中的结核分枝杆 菌抗原。11. 权利要求10的方法，其特征在于，所述抗体是多克隆抗体。12. 权利要求11的方法，其特征在于，所述抗体通过非人哺乳动物制备。13. 权利要求12的方法，其特征在于，所述非人哺乳动物是兔、绵羊、山羊、马、骡或豚 鼠等。14. 权利要求10或11的方法，其特征在于，所述I中标记的次级抗体是用酶标记。15. 权利要求14的方法，其特征在于，所述酶是辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。16. 权利要求15的方法，其特征在于，所述样品是细菌培养上清、细菌裂解液、血清、血 浆、痰、胸水、腹水或尿液。17. 权利要求10或11的方法，其特征在于，所述I中标记的次级抗体是用生物素标记。18.权利要求17的方法，其特征在于，所述样品是细菌培养上清、细菌裂解液、血清、血 浆、痰、胸水、腹水或尿液。
【专利摘要】本发明属临床免疫检测技术领域，涉及结核分枝杆菌抗原的检测方法。采用基因工程手段获得结核分枝杆菌特异性抗原38KD，ESAT6，CFP10融合表达所产生的融合蛋白38KD-ESAT6-CFP10。以上述抗原免疫动物所产生的免疫血清经纯化得到抗38KD-ESAT6-CFP10多克隆抗体，用于包被及检测。建立双抗体夹心结核分枝杆菌抗原检测方法。该方法优势在于灵敏度高、特异性强，能定量检测待测样本中的结核分枝杆菌特异性抗原，同时与抗体联合检测能提高阳性检出率。
【IPC分类】G01N33/569
【公开号】CN105486860
【申请号】CN201410524707
【发明人】冯晓燕, 张贺秋, 戴振华, 修冰水, 杨锡琴
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年10月9日
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