一种用于细胞分选和富集的微流控芯片及其应用
一种用于细胞分选和富集的微流控芯片及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于现代医学技术领域，具体涉及一种用于细胞分选和富集的微流控芯片 及其应用。
【背景技术】
[0002] 癌症是发达国家第一位、发展中国家第二位的死亡病因。从临床上讲，造成癌症患 者死亡率高的主要原因是疾病诊断的延迟和治疗方案的不恰当。从生理上来说，癌症造成 的死亡大多数是由于肿瘤细胞通过血源性途径迁移到全身其他器官导致的。在送个过程 中，转移癌细胞即循环癌细胞（circulating tumor cells, CTCs)在癌症转移中起着关键的 作用。越来越多的证据表明肿瘤细胞从原发部位转移到其他部位在癌症发生的早期就已经 发生。因此，收集CTCs并对其进行生物化学分析，一方面能为癌症病人的早期诊断提供了 一个有效的渠道，另一方面，它们也可W提供转移性恶性肿瘤的相关生物学信息。
[0003] CTCs往往具有W下特点：外周血中CTCs的含量极少，大约每1ml血液中含有 1-100个CTCs,因此从外周血中分选CTCs面临巨大的技术挑战；作为上皮细胞的CTCs往往 比血细胞大很多；CTCs的变形性较大，而且，癌细胞越软，侵袭转移能力越强。CTCs的W上 特性使得从外周血中收集CTCs面临种种困难。
[0004] 现有的CTCs分选富集方法主要包括Η种；（1)基于细胞大小的微过滤设备。似免 疫磁珠分选系统：即采用交联有抗体anti-EpCAM巧pithelial Cell A化esion Molecule, 上皮细胞粘附分子）的纳米磁珠捕获CTCs,再借助磁力作用分选CTCs。该方法后来发展成 为目前CTCs检测领域唯一经美国抑A认证的产品Cell Search?。（3)微流控芯片系统：该 技术采用包括抗体和核酸契合寡聚物（aptamer)在内的捕获分子修饰在目标物种或者材 料表面，然后再借助于微流体的特定复杂结构控制细胞一材料界面之间的相互作用力。
[0005] W上策略在CTCs分选富集中存在着一些限制，比如，采用方法（1)进行细胞分选 时，特异性不高，严重制约着该方法捕获细胞的纯度；由于磁珠的摩擦作用和细胞侵入性， 通过方法（2)获得的细胞往往都是死细胞，只能实现细胞的个数统计，而无法对细胞的生 物特征作进一步研究；方法（3)用于富集环境中相对数目较多的目标细胞时是行之有效的 手段，但对于CTCs等相对数目较少的细胞，即便能够将其与非目标细胞分开，却缺乏对细 胞进行收集或富集的手段。难W获得目标细胞。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种用于细胞分选和富集的微流控芯片，该微流控芯片中含有环境 响应性材料，能够实现黏附在芯片上的目标细胞的可控释放，便于目标细胞的分选富集。
[0007] -种用于细胞分选和富集的微流控芯片，包括叠置固定的芯片本体和盖体，所述 盖体设有凹槽、与凹槽相连通的进样通道和出样通道，所述凹槽的开口朝向芯片本体；
[000引所述芯片本体由W下方法制备获得：
[0009] (a)在导电基底表面进行壳聚糖/普鲁±藍纳米颗粒的层层自组装处理；
[0010] (b)在步骤（a)所获产品的表面进行聚二甲基二帰丙基氯化倭/聚丙帰酸的层层 自组装处理；
[0011] (C)对步骤化）所获产品依次进行駿基活化处理、亲和素修饰、生物素化抗体偶 联，获得所述芯片本体。
[0012] 步骤（a)在导电基底表面形成微电压响应释放层，步骤化）在微电压响应释放层 外形成连接层，连接层外带有駿基（由PAA提供）；然后对连接层外的駿基进行活化处理， 并在駿基上连接亲和素，最后利用亲和素与生物素之间的作用力，将能与目标细胞特异性 结合的抗体偶联在连接层外，形成细胞黏附层，从而获得所述芯片本体。
[0013] 样品经进样通道注入凹槽中，凹槽的开口朝下，从而样品中细胞可与凹槽开口处 的芯片本体充分接触，样品中的目标细胞被芯片本体外的抗体捕获，从而固定在芯片本体 表面；未被捕获的非目标细胞则为游离状态，从出样通道先行流出。
[0014] 目标细胞释放的方法为：对芯片本体施加微电压（约1. 25V)，微电压响应释放层 因普鲁±藍（PB)纳米颗粒发生氧化还原反应变为电中性而瓦解，目标细胞即释放，进而被 收集起来。
[0015] 本发明中，芯片本体表面尽量保持平整、光滑，盖体可采用PDMS材料制成，便于 在其上设置凹槽、进样通道和出样通道。芯片本体与盖体之间的固定方式为：当盖体较薄 (3mm W下）时，分别采用离子蚀刻机对盖体与芯片本体的接触面进行表面居基化处理，然 后将盖体与芯片本体贴合，直接密闭封装；当盖体较厚（3mm W上）时，采用小型文件夹将盖 体与芯片本体上下固定即可。
[0016] 具体地，所述含有微电压响应释放层的芯片本体的制备方法为：
[0017] (a)在导电基底表面进行壳聚糖/普鲁±藍纳米颗粒的层层自组装处理；
[001引微电压响应释放层（CHI/PB)。的调控因素为电压，因此要求基底具有导电性能，作 为优选，所述导电基底为IT0导电玻璃。
[0019] 在制备芯片本体之前，IT0导电玻璃或玻璃需通过等离子体刻蚀等手段进行清洗； 清洗后，IT0导电玻璃或玻璃表面带负电荷。而层层自组装是通过材料与材料之间的静电 相互作用实现的，因此：
[0020] 步骤（a)中，将导电基底交替地浸泡在壳聚糖溶液、普鲁±藍纳米颗粒溶液中进 行层层自组装处理，浸泡次数均为10次W上，每次浸泡5min W上；在交替浸泡的间隙，需采 用pH 4. 0的去离子水清洗至少Η分钟，洗去前一次浸泡中未紧密组装的分子，保证结构稳 定，下同。
[0021] 优选地，导电基底在壳聚糖溶液、普鲁±藍纳米颗粒溶液中的浸泡次数均为21~ 30次（即（CHI/PB) η中层数η为21~30)，每次浸泡lOmin。
[002引在η > 21时，（CHI/PB)。能够完整地覆盖导电基底，施加电压后可W实现目标细胞 的完全释放。若η值太小，（CHI/PB)。覆盖不完全，难W保证目标细胞的有效释放。
[0023] 壳聚糖（CHI)带正电荷，普鲁±藍（ΡΒ)纳米颗粒带负电荷；交替浸泡在上述溶液 中，从而能在带负电荷的导电基底上通过静电吸引力进行层层自组装。
[0024] 作为优选，所述壳聚糖溶液的浓度为0. 15~15mg/mU溶剂为0. 01~1Μ醋酸溶 液；所述普鲁±藍纳米颗粒溶液的浓度为0. 15~15mg/mU普鲁±藍纳米颗粒的粒径为 10 ~20nm。
[00巧]作为进一步优选，所述壳聚糖溶液的浓度为1. 5mg/mU溶剂为0.1 M醋酸溶液；所 述普鲁±藍纳米颗粒溶液的浓度为1. 5mg/mU普鲁±藍纳米颗粒的粒径为10~20nm。
[0026] 在该浓度下，高分子溶液既具有较好的溶解性和流动性，同时又能满足层层自组 装所需要的浓度要求。普鲁±藍纳米颗粒的小尺寸保证了采用颗粒进行层层自组装的可行 性，若颗粒太大，自组装的难度就会增加。
[0027] 化）在步骤（a)所获产品的表面进行聚二甲基二帰丙基氯化倭/聚丙帰酸的层层 自组装处理；
[0028] 形成微电压响应释放层（CHI/PB)。后，处于最外层的为带负电荷的普鲁±藍纳米 颗粒；为了在材料表面引入駿基，需要对表面进行聚二甲基二帰丙基氯化倭（PDADMC)/聚 丙帰酸（PAA)的层层自组装处理。因此，将所获产品交替地浸泡在聚二甲基二帰丙基氯化 倭溶液、聚丙帰酸溶液中，浸泡次数均为2次W上，每次浸泡时间为5min W上。
[0029] 聚二甲基二帰丙基氯化倭 （PDADMAC)带正电荷，聚丙帰酸（PAA)带负电荷，不仅便 于形成静电吸引力，且聚丙帰酸裸露在外侧，其駿基可用于连接亲和素。
[0030] 聚二甲基二帰丙基氯化倭溶液和聚丙帰酸溶液的浓度优选为1~lOmg/mU更优 选为5mg/血；采用的溶剂均为抑为4的0. 5M氯化钢溶液。连接层（PDADMAC/PAA)。中，层 数η优选为4 (即各浸泡4次），W保证连接层表面带有足够量的駿基。
[0031] (C)对步骤化）所获产品依次进行駿基活化处理、亲和素修饰、生物素化抗体偶 联，获得所述芯片本体。
[003引首先，利用1-己基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺巧DC)/Ν-居基玻巧醜亚 胺（N服）作为交联剂进行駿基活化处理，EDC的浓度优选为0. 2M，N服的浓度优选为0. 05M。
[0033] 然后，置于10 μ g/mL的亲和素溶液中赔育90min，亲和素的氨基与温度响应释放 层外的駿基偶联，从而完成亲和素修饰。
[0034] 最后，置于生物素化抗体溶液中赔育，利用生物素与亲和素的相互作用将生物素 化抗体偶联在温度响应释放层外，即完成芯片本体的制备。
[0035] 抗体的种类视目标细胞的种类而定，当本发明的微流控芯片用于分选和富集 CTCs时，优选采用生物素化的anti-EpCAM，生物素化抗体偶联的条件为：生物素化的 anti-EpCAM溶液浓度为10 μ g/mL(生物素化的anti-EpCAM溶于含0. 1 % BSA的1 XPBS 中），37°C下赔育60min〇
[0036] 本发明还提供了一种细胞分选和富集装置，包括：
[0037] 所述微流控芯片；
[0038] 微量注射泉，与进样通道相连；
[0039] Η通管，包括主管W及一端与主管相连通的侧管，所述主管一端与出样通道对接， 另一端连接有目标细胞收集管，所述侧管与废液收集管相连，主管与侧管的连通处设有Η 通球阀；
[0040] 电化学工作站，用于向芯片本体施加电压。
[0041] 微量注射泉将样品经进样通道注入凹槽内，目标细胞吸附在芯片本体表面，非目 标细胞先经出样通道、Η通管流入废液收集管（此时目标细胞收集管的通路关闭，由Η通 球阀实现）；经清洗后，利用电化学工作站的两个电极向芯片施加电压，促使目标细胞释 放，并经出样通道、Η通管流入目标细胞收集管中被收集起来（此时废液收集管的通路关 闭，由Η通球阀实现）。
[0042] 需要释放目标细胞时，可直接对微流控芯片施加电压，也可将芯片本体分离出来， 对芯片本体施加电压，此时释放的目标细胞可直接吸取，不必经过出样管道、Η通管等造成 不必要的损耗。
[0043] 在释放目标细胞之前，微流控芯片可W进行多次目标细胞捕获，W获得更多的目 标细胞。
[0044] 本发明还提供了所述微流控芯片在分选和富集循环肿瘤细胞中的应用。对于目标 细胞含量较少的样品，本发明的微流控芯片捕获目标细胞的效率极高，如用于在外周血中 分选富集循环肿瘤细胞。
[0045] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0046] (1)本发明在微流控芯片中引入微电压响应释放层送一环境刺激响应型材料，借 助于环境刺激响应型材料在光、电、磁、温度W及特异性酶等外在刺激的作用能够发生性质 变化的特性，实现被捕获的细胞（包括微生物）在更广范围下的特异性无损释放、富集；
[0047] (2)本发明的微流控芯片具有良好的细胞捕获效率，在血液样品流速0. 5mL/h情 况下，可W获得95%~100%的CTCs捕获效率；而且，从癌症病人的新鲜血液样品中被捕获 的CTCs具有很好的细胞活性，便于后续的科学研究和病情评价分析。
【附图说明】
[0048] 图1为含微电压响应释放层的芯片本体的制备过程及工作原理图；
[0049] 其中，"Oxygen plasma etch"表示氧等离子体蚀刻，"Layer by layer"表示层层 自组装，CHI/PB表示壳聚糖/普鲁±藍纳米颗粒，PAA/PDADMAC表示聚丙帰酸/聚二甲基二 帰丙基氯化倭，畑S/EDC表示N-居基玻巧醜亚胺/1-己基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二 亚胺，Anti-EpCAM表示抗上皮细胞粘附分子抗体；
[0050] 图2a为本发明一种细胞分选和富集装置的结构示意图；
[0051] 图2b为图2a中的A-A剖面图；
[0052] 图3a为微电压响应释放层（CHI/PB)。中η分别取0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21，24, 27时 所对应产品的外观图；
[0053] 图3b为利用楠圆偏振光谱仪测得的不同微电压响应释放层处理层数的产品的薄 膜厚度；
[0054] 其中，"Thickness (nm)"表示厚度（nm)，"Number of Bilayers (η)"表示 CHI/PB 的层数（η);
[0055] 图3c为利用紫外可见分光光度计检测不同微电压响应释放层处理层数的产品在 700nm处的吸收值的类线性变化图；
[0056] 其中，"Absorbance (700nm)"表示 700nm 处的吸光度，"Number of Bilayers (η)" 表示CHI/PB的层数（η);
[0057] 图3d为利用扫描电子显微镜获得畑Ι/ΡΒ)。中η = 27的产品表面形貌图；
[005引图3e为利用原子力显微镜获得畑I/PB)。中η = 27的产品表面形貌图；
[0059] 图4a为利用微流控芯片捕获肝癌细胞化pG2后的显微图片；
[0060] 图4b为经过电化学处理后芯片本体的显微图片；
[0061] 图4c为随着电化学作用时间的延长芯片本体的厚度变化曲线；
[0062] 其中，"Absorbance (700nm)"表示700nm处的吸光度，"Time (min)"表示电化学作 用时间（min);
[0063] 图4d为随着电化学作用时间的延长被捕获细胞的吸附率变化曲线；
[0064] 其中，"Harvest cell (%)"表示被捕获细胞的吸附率（％)，"Time (min)"表示电 化学作用时间（min);
[0065] 图4e为吸附在芯片本体表面的细胞活性表征图；
[0066] 图4f为被捕获细胞释放后的细胞活性表征图；
[0067] 图4g为畑I/PB)。中η = 15时芯片本体上被捕获细胞的释放效率图；
[0068] 图地为（CHI/PB)。中η = 21时芯片本体上被捕获细胞的释放效率图；
[0069] 图5a为样品流速对微流控芯片的细胞捕获率的影响；
[0070] 其中，"Flow rate (mL/h)"表示流体流速（mL/h)/'CapUire }deld(% )"表示捕获 率（％ );
[0071] 图化为微流控芯片对不同溶液环境中、不同浓度化pG2细胞的捕获率；
[0072] 其中，"Sp;Lked number of cells"表不细胞浓度；"Cap1:ure }deld (%)"表不捕 获率（％ );
[0073] 图5c为微流控芯片对不同癌细胞的捕获率；
[0074] 其中，"CapUire }deld(% )"表示捕获率（％ );
[00巧]图5d为利用免疫英光染色验证被捕获细胞的类型；
[0076] 图6a为利用微流控芯片对临床样本中CTCs进行分选；
[0077] 其中，左上图为利用D API (4'，6-二脉基-2-苯基剛巧）对被捕获细胞进行细胞核 染色的结果，右上图为被捕获细胞的细胞角蛋白（切tokeratin)染色情况，左下图为确认 被捕获细胞表面有无 CD45的情况，右下图为前Η张图片的整合结果；
[0078] 图化为对分选获得的CTCs进行mRNA提取的结果图；
[0079] 其中，Marker表示分子量标准，control表示对照，Released表示被释放细胞。
【具体实施方式】
[0080] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
[0081] 本实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；其中的定量试验，均设置 Η次重复实验，结果取平均值；所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店 购买得到的。
[0082] 本【具体实施方式】中用到的主要实验材料包括：
[008引 （1)试验用癌细胞株：均购自ATCC，产品目录号分别为：肝癌细胞株化ep G2, ATCC⑥皿-8065?)，肺腺癌细胞株（A549, ATCC⑩CRM-C化-185?)，乳腺癌细胞株 (MCF7, ATCC⑥HTB-22?)，口腔鱗状细胞癌细胞株（邸，ATCC⑧C化-17?)和宫颈癌细胞 株化eLa，（ ATCC⑥ C化-2?)。
[0084] 细胞在相应培养基中生长至一定浓度，然后采用膜酶消化约lOmin，收集细胞并计 数后用于后续实验测试。如有必要，采用DAPI对细胞进行预标记。根据后续需要，将细胞 W 100~100, 000个/mL的浓度分别分散于PBS、全血或裂解血中。
[0085] 似细胞培养基（DMEM、RPMI-IMO等）购自Invitrogen，胎牛血清（FC巧购自 Sigma-Al化ich,生物素修饰的人源 lipCAM 抗体化iotin-anti-EpCAM)购自 R&D systems, 1-己基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐购自TCI，其他化学试剂购自Wako, IT0导 电玻璃购自 DeltaTechnologies。
[008引 做壳聚糖溶液的配制鹿聚糖W 1. 5mg/血的浓度溶解于0. 1M醋酸溶液中，然后 采用0. 45 μ m聚離讽超滤膜真空抽滤，所得溶液使用盐酸或者氨氧化钢溶液调节抑至4. 0。
[0087] (4) PB纳米颗粒溶液的配制；在揽拌状态下，将lOmM的化C12溶液逐滴加入相同体 积的50mM而化(CN) e和KC1溶液中，然后采用3, OOODa纤维素透析膜对反应液进行透析；收 集透析残余溶液，采用邻苯二氨钟缓冲液或盐酸和氨氧化钢溶液调节pH至4. 0。保持溶液 中PB纳米颗粒终浓度为1. 5mg/mL。
[0088] (5)聚二甲基二帰丙基氯化倭溶液和聚丙帰酸溶液的配制；将聚丙帰酸钢和聚二 甲基二帰丙基氯化倭分别溶解于0. 5M氯化钢溶液中，终浓度为5g/L。
[0089] 上述化CI2溶液、KsFe (CN) e溶液、KC1溶液、盐酸、氨氧化钢溶液氯化钢溶液均采用 Η蒸水配制。
[0090] 实施例1芯片本体的制备
[0091] 芯片本体的制备过程及工作原理如图1所示，其制备过程包括W下步骤：
[009引 （1)依次采用二氯甲焼、丙丽、甲醇和去离子水超声清洗口0导电玻璃15min，然后 使用等离子体刻蚀（Harrick PCD 32G)处理IT0导电玻璃5min，将处理后的IT0导电玻璃 放入事先配好的壳聚糖溶液中静置3min ;
[0093] (2)按照层层自组装的标准方法，将IT0导电玻璃交替地浸泡在壳聚糖溶液、普鲁 ±藍纳米颗粒溶液中进行层层自组装处理，每次浸泡lOmin，两次浸泡的间隙采用抑4. 0 的去离子水清洗3min，在IT0导电玻璃表面形成微电压响应释放层（CHI/PB)27 ;
[0094] (3)按照层层自组装的标准方法，将步骤（1)所获产品交替地浸泡在聚二甲基二 帰丙基氯化倭溶液、聚丙帰酸溶液中进行层层自组装处理，每次浸泡lOmin，两次浸泡的间 隙采用抑4. 0的去离子水清洗3min，在（CHI/PB)27外形成连接层（PDADMAC/PAA)4 ;
[0095] (4)利用邸C(0. 2M)/N服(0. 5M)对步骤（3)所获产品进行駿基活化处理；
[009引 妨将步骤（4)所获产品置于10 μ g/ml的亲和素溶液中赔育90min ;
[0097] (6)将步骤（5)所获产品置于10 μ g/mL的生物素化人上皮细胞吸附因子抗体溶液 中（溶于含有0. 1% BSA的1XPBS中），37°C下赔育60min ;获得含微电压响应释放层的芯 片本体。
[009引实施例2细胞分选和富集装置的制备
[009引如图2a所示，本实施例一种细胞分选和富集装置，包括微流控芯片1、微量注射泉 2、H通管3、废液收集管4、目标细胞收集管5 W及电化学工作站（图中省略）。
[0100] 由图2a和化可见，微流控芯片1包括叠置固定的的芯片本体12 (由实施例1制 得）和盖体11，盖体11设有凹槽13、与凹槽13相连通的进样通道14和出样通道15,且凹 槽13的开口朝向芯片本体12。
[010。 盖体11采用PDMS材料制成，便于在其上设置凹槽13、进样通道14和出样通道15。 盖体11与芯片本体12的固定方式为；当盖体11较薄（3mm W下）时，分别采用离子蚀刻机 对盖体11与芯片本体12的接触面进行居基化处理，然后将盖体11与芯片本体12贴合，直 接密闭封装；当盖体11较厚（3mm w上）时，采用小型文件夹将盖体11与芯片本体12上下 固定即可。
[0102] 如图2a所示，微量注射泉2通过第一连接管16与进样通道14相连，用于注入样 品，并控制样品的流动速度；Η通管3包括主管31 W及一端与主管31相连通的侧管32,主 管31 -端通过第二连接管17与出样通道15对接，另一端连接有目标细胞收集管5,侧管 32与废液收集管4相连，主管31与侧管32的连通处设有Η通球阀33 ;电化学工作站用于 向芯片本体12施加电压。
[0103] 本实施例细胞分选和富集装置的工作原理为：
[0104] 微量注射泉2将样品经进样通道14注入凹槽13内，目标细胞吸附在芯片本体12 表面，非目标细胞先经出样通道15、Η通管3流入废液收集管4 (此时目标细胞收集管5的 通路关闭，由Η通球阀33实现）；经清洗后，利用电化学工作站的两个电极向芯片本体12 施加电压，促使目标细胞释放，并经出样通道15、Η通管3流入目标细胞收集管5中被收集 起来（此时废液收集管4的通路关闭，由Η通球阀33实现）。从Η通管3流出的目标细胞 液也可直接被细胞培养皿收集起来，经培养后做进一步的生物化学分析。
[0105] 对于含有温度响应释放层的微流控芯片1，则直接将微流控芯片1置于4Γ下一段 时间，促使目标细胞释放，并被目标细胞收集管收集。
[0106] 需要释放目标细胞时，可直接对微流控芯片1施加电压或低温处理，也可将芯片 本体12分离出来，对芯片本体12施加电压或低温处理，此时释放的目标细胞可直接吸取， 不必经过出样管道15、Η通管3等造成不必要的损耗。
[0107] 在释放目标细胞之前，可多次加样，从而微流控芯片1可W进行多次目标细胞捕 获，W获得更多的目标细胞。
[010引实施例3形貌表征和性能测试
[0109] (1)对实施例1步骤（2)所获产品进行形貌表征
[0110] 图3a所示的为微电压响应释放层畑Ι/ΡΒ)η中η分别取 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21，24, 27时，所对应产品的外观图。
[0111] 利用楠圆偏振光搏仪测量不同处理层数的产品的薄膜厚度，结果如图3b所示。
[0112] 利用紫外可见分光光度计检测不同处理层数的产品在700nm处的吸收值的类线 性变化，结果如图3c所示。
[0113] 利用扫描电子显微镜获得η = 27的产品表面形貌图，如图3d所示。
[0114] 利用原子力显微镜获得η = 27的产品表面形貌图，如图3e所示。
[0115] (2)对实施例1芯片本体的细胞捕获与释放性能进行测试
[0116] W肝癌细胞化pG2为例，测试芯片本体的细胞捕获与释放性能；将芯片本体放置 于12孔板中，将ImL浓度为105个/血的细胞涂于芯片本体上，37°C、5% (?的环境下赔育 45min，然后采用磯酸缓冲溶液冲洗3次。然后对芯片本体施加1. 25V的电压考察被捕获细 胞的释放性能。结果如图4a、4b、4c、4d、4e、4f所示。
[0117] 由图4a、4b可见，芯片本体能够高效捕获化pG2,并且在对芯片本体施加电压 (1. 25V)后，胎pG2能够有效释放；由图4c、4d可见，随着芯片本体施加电压的时间的延长， 芯片本体的厚度逐渐变小，HepG2在芯片本体表面的吸附率也逐渐降低；由图4e、4f可见， HepG2无论是吸附还是释放，其细胞活力均较高，表面本发明的芯片本体对细胞基本无损 伤。
[0118] 同时，本实施例还发现，（CHI/PB)。中η取不同数值时，芯片本体上被捕获细胞完全 释放的时间会有差异。结果如图4g、4h所示。
[0119] 由图4g可见，η = 15时，所得到的芯片本体在细胞释放过程中不能实现100%的 细胞释放效果；由图地可见，η = 21时，芯片本体可W实现100%的细胞释放效率；η = 27 时，芯片本体也可W实现100%的细胞释放效率。
[0120] (3)对微流控芯片的细胞捕获与释放性能进行测试
[0121] 利用实施例2的细胞分选和富集装置，测试样品流速对微流控芯片的细胞捕获率 的影响，结果见图5曰。由图5a可见，在不同的样品流速下，微流控芯片的细胞捕获率存在显 著不同，流速越大，捕获率越低。
[0122] 分别利用PBS溶液、全血、裂解血配置不同浓度的肝癌细胞溶液，测试微流控芯片 对化pG2的捕获率，结果见图化。由图化可见，流速为0. 5mL/h时，微流控芯片在Η种溶液 环境下均可W达到90% W上的细胞捕获率，表明该微流控芯片可W完成多种溶液环境下的 细胞分选目标，且结果基本保持稳定一致。
[0123] 利用PBS缓冲溶液分别配置相同浓度（100个/血）的各癌细胞溶液（口腔鱗癌邸 细胞，肺癌Α549细胞，人宫颈癌化la细胞和人乳腺癌MC巧细胞），测试微流控芯片对各癌 细胞的捕获率，结果见图5c。由图5c可见，该微流控芯片对上皮细胞源的实体瘤细胞具有 广谱的通用性。
[0124] 将捕获有细胞的芯片本体置于含22mM calcein AM和4mM ethidium bromide的 PBS缓冲溶液中赔育30min，然后采用磯酸缓冲溶液清洗芯片本体并置于英光显微镜下观 察结果（见图5d)。结合激光共聚焦显微镜确定被捕获细胞为肿瘤细胞，而不是血液中的其 他细胞。
[0125] 实施例4临床肿瘤样本的应用实例
[0126] 在医院中采用包含有邸TA抗凝剂的真空取血管采集健康人及膜腺癌肿瘤病人的 外周血，放置于4°C冰箱，并在24小时内处理完毕。
[0127] 利用实施例2的装置对各外周血样本进行分选处理，处理步骤为：
[0128] 采用0. 5mL/h的流速进行细胞捕获测试，测试外周血总量为每个样本ImL。采用免 疫英光染色鉴定被捕获细胞种类，并对捕获细胞进行RNA提取，反转录，PCR和凝胶电泳测 试，结果见图6曰、化所示。
[0129] 由图6a可见，利用本发明的装置从膜腺癌肿瘤病人的裂解血样本中成功分选到 CTCs细胞，而从健康人的裂解血样本中未分选到CTCs细胞，并由免疫英光染色证实。由图 化可见，通过本发明装置获取的CTCs细胞实现了对mRNA的无损提取，证实了本发明装置对 CTCs细胞后续分子分析的可行性。
【主权项】
1. 一种用于细胞分选和富集的微流控芯片，其特征在于，包括叠置固定的芯片本体和 盖体，所述盖体设有凹槽、与凹槽相连通的进样通道和出样通道，所述凹槽的开口朝向芯片 本体； 所述芯片本体由以下方法制备获得： (a) 在导电基底表面进行壳聚糖/普鲁士蓝纳米颗粒的层层自组装处理； (b) 在步骤（a)所获产品的表面进行聚二甲基二烯丙基氯化铵/聚丙烯酸的层层自组 装处理； (c) 对步骤（b)所获产品依次进行羧基活化处理、亲和素修饰、生物素化抗体偶联，获 得所述芯片本体。2. 如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，步骤（a)中，将导电基底交替地浸泡 在壳聚糖溶液、普鲁士蓝纳米颗粒溶液中进行层层自组装处理，浸泡次数均为10次以上， 每次浸泡5min以上。3. 如权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，导电基底在壳聚糖溶液、普鲁士蓝纳 米颗粒溶液中的浸泡次数均为21~30次，每次浸泡lOmin。4. 如权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述壳聚糖溶液的浓度为0. 1~ 10mg/mL，溶剂为0. 01~1M醋酸溶液；所述普鲁士蓝纳米颗粒溶液的浓度为0. 15~15mg/ mL，普鲁士蓝纳米颗粒的粒径为10~20nm。5. 如权利要求1~4任一所述的微流控芯片，其特征在于，所述导电基底为ITO导电玻 3?〇6. 如权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于，步骤（b)中，将步骤（a)所获产品交 替地浸泡在聚二甲基二烯丙基氯化铵溶液、聚丙烯酸溶液中进行层层自组装处理，浸泡次 数均为2次以上，每次浸泡时间为5min以上。7. -种细胞分选和富集装置，其特征在于，包括： 如权利要求1~6任一所述的微流控芯片； 微量注射泵，与进样通道相连； 三通管，包括主管以及一端与主管相连通的侧管，所述主管一端与出样通道对接，另一 端连接有目标细胞收集管，所述侧管与废液收集管相连，主管与侧管的连通处设有三通球 阀； 电化学工作站，用于向芯片本体施加电压。8. 如权利要求1~6任一所述微流控芯片在分选和富集循环肿瘤细胞中的应用。9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述微流控芯片上偶联的生物素化抗体为 生物素化的anti-EpCAM，生物素化抗体偶联的条件为：生物素化的anti-EpCAM溶液浓度为 10μg/mL〇
【专利摘要】本发明公开了一种用于细胞分选和富集的微流控芯片及其应用。微流控芯片包括叠置固定的芯片本体和盖体，所述盖体设有凹槽、与凹槽相连通的进样通道和出样通道，所述凹槽的开口朝向芯片本体；芯片本体由以下方法制备获得：(a)在导电基底表面进行壳聚糖/普鲁士蓝纳米颗粒的层层自组装处理；(b)在步骤(a)所获产品的表面进行聚二甲基二烯丙基氯化铵/聚丙烯酸的层层自组装处理；(c)对步骤(b)所获产品依次进行羧基活化处理、亲和素修饰、生物素化抗体偶联，获得所述芯片本体。本发明在微流控芯片中引入环境刺激响应型材料，其在外界刺激的作用能够发生性质变化，能够实现被捕获细胞的可控、无损释放。
【IPC分类】G01N35/00, G01N33/574
【公开号】CN105486865
【申请号】CN201410467913
【发明人】王本, 肖云, 唐睿康
【申请人】浙江大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年9月15日
【技术领域】
[0001] 本发明属于现代医学技术领域，具体涉及一种用于细胞分选和富集的微流控芯片 及其应用。
【背景技术】
[0002] 癌症是发达国家第一位、发展中国家第二位的死亡病因。从临床上讲，造成癌症患 者死亡率高的主要原因是疾病诊断的延迟和治疗方案的不恰当。从生理上来说，癌症造成 的死亡大多数是由于肿瘤细胞通过血源性途径迁移到全身其他器官导致的。在送个过程 中，转移癌细胞即循环癌细胞（circulating tumor cells, CTCs)在癌症转移中起着关键的 作用。越来越多的证据表明肿瘤细胞从原发部位转移到其他部位在癌症发生的早期就已经 发生。因此，收集CTCs并对其进行生物化学分析，一方面能为癌症病人的早期诊断提供了 一个有效的渠道，另一方面，它们也可W提供转移性恶性肿瘤的相关生物学信息。
[0003] CTCs往往具有W下特点：外周血中CTCs的含量极少，大约每1ml血液中含有 1-100个CTCs,因此从外周血中分选CTCs面临巨大的技术挑战；作为上皮细胞的CTCs往往 比血细胞大很多；CTCs的变形性较大，而且，癌细胞越软，侵袭转移能力越强。CTCs的W上 特性使得从外周血中收集CTCs面临种种困难。
[0004] 现有的CTCs分选富集方法主要包括Η种；（1)基于细胞大小的微过滤设备。似免 疫磁珠分选系统：即采用交联有抗体anti-EpCAM巧pithelial Cell A化esion Molecule, 上皮细胞粘附分子）的纳米磁珠捕获CTCs,再借助磁力作用分选CTCs。该方法后来发展成 为目前CTCs检测领域唯一经美国抑A认证的产品Cell Search?。（3)微流控芯片系统：该 技术采用包括抗体和核酸契合寡聚物（aptamer)在内的捕获分子修饰在目标物种或者材 料表面，然后再借助于微流体的特定复杂结构控制细胞一材料界面之间的相互作用力。
[0005] W上策略在CTCs分选富集中存在着一些限制，比如，采用方法（1)进行细胞分选 时，特异性不高，严重制约着该方法捕获细胞的纯度；由于磁珠的摩擦作用和细胞侵入性， 通过方法（2)获得的细胞往往都是死细胞，只能实现细胞的个数统计，而无法对细胞的生 物特征作进一步研究；方法（3)用于富集环境中相对数目较多的目标细胞时是行之有效的 手段，但对于CTCs等相对数目较少的细胞，即便能够将其与非目标细胞分开，却缺乏对细 胞进行收集或富集的手段。难W获得目标细胞。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种用于细胞分选和富集的微流控芯片，该微流控芯片中含有环境 响应性材料，能够实现黏附在芯片上的目标细胞的可控释放，便于目标细胞的分选富集。
[0007] -种用于细胞分选和富集的微流控芯片，包括叠置固定的芯片本体和盖体，所述 盖体设有凹槽、与凹槽相连通的进样通道和出样通道，所述凹槽的开口朝向芯片本体；
[000引所述芯片本体由W下方法制备获得：
[0009] (a)在导电基底表面进行壳聚糖/普鲁±藍纳米颗粒的层层自组装处理；
[0010] (b)在步骤（a)所获产品的表面进行聚二甲基二帰丙基氯化倭/聚丙帰酸的层层 自组装处理；
[0011] (C)对步骤化）所获产品依次进行駿基活化处理、亲和素修饰、生物素化抗体偶 联，获得所述芯片本体。
[0012] 步骤（a)在导电基底表面形成微电压响应释放层，步骤化）在微电压响应释放层 外形成连接层，连接层外带有駿基（由PAA提供）；然后对连接层外的駿基进行活化处理， 并在駿基上连接亲和素，最后利用亲和素与生物素之间的作用力，将能与目标细胞特异性 结合的抗体偶联在连接层外，形成细胞黏附层，从而获得所述芯片本体。
[0013] 样品经进样通道注入凹槽中，凹槽的开口朝下，从而样品中细胞可与凹槽开口处 的芯片本体充分接触，样品中的目标细胞被芯片本体外的抗体捕获，从而固定在芯片本体 表面；未被捕获的非目标细胞则为游离状态，从出样通道先行流出。
[0014] 目标细胞释放的方法为：对芯片本体施加微电压（约1. 25V)，微电压响应释放层 因普鲁±藍（PB)纳米颗粒发生氧化还原反应变为电中性而瓦解，目标细胞即释放，进而被 收集起来。
[0015] 本发明中，芯片本体表面尽量保持平整、光滑，盖体可采用PDMS材料制成，便于 在其上设置凹槽、进样通道和出样通道。芯片本体与盖体之间的固定方式为：当盖体较薄 (3mm W下）时，分别采用离子蚀刻机对盖体与芯片本体的接触面进行表面居基化处理，然 后将盖体与芯片本体贴合，直接密闭封装；当盖体较厚（3mm W上）时，采用小型文件夹将盖 体与芯片本体上下固定即可。
[0016] 具体地，所述含有微电压响应释放层的芯片本体的制备方法为：
[0017] (a)在导电基底表面进行壳聚糖/普鲁±藍纳米颗粒的层层自组装处理；
[001引微电压响应释放层（CHI/PB)。的调控因素为电压，因此要求基底具有导电性能，作 为优选，所述导电基底为IT0导电玻璃。
[0019] 在制备芯片本体之前，IT0导电玻璃或玻璃需通过等离子体刻蚀等手段进行清洗； 清洗后，IT0导电玻璃或玻璃表面带负电荷。而层层自组装是通过材料与材料之间的静电 相互作用实现的，因此：
[0020] 步骤（a)中，将导电基底交替地浸泡在壳聚糖溶液、普鲁±藍纳米颗粒溶液中进 行层层自组装处理，浸泡次数均为10次W上，每次浸泡5min W上；在交替浸泡的间隙，需采 用pH 4. 0的去离子水清洗至少Η分钟，洗去前一次浸泡中未紧密组装的分子，保证结构稳 定，下同。
[0021] 优选地，导电基底在壳聚糖溶液、普鲁±藍纳米颗粒溶液中的浸泡次数均为21~ 30次（即（CHI/PB) η中层数η为21~30)，每次浸泡lOmin。
[002引在η > 21时，（CHI/PB)。能够完整地覆盖导电基底，施加电压后可W实现目标细胞 的完全释放。若η值太小，（CHI/PB)。覆盖不完全，难W保证目标细胞的有效释放。
[0023] 壳聚糖（CHI)带正电荷，普鲁±藍（ΡΒ)纳米颗粒带负电荷；交替浸泡在上述溶液 中，从而能在带负电荷的导电基底上通过静电吸引力进行层层自组装。
[0024] 作为优选，所述壳聚糖溶液的浓度为0. 15~15mg/mU溶剂为0. 01~1Μ醋酸溶 液；所述普鲁±藍纳米颗粒溶液的浓度为0. 15~15mg/mU普鲁±藍纳米颗粒的粒径为 10 ~20nm。
[00巧]作为进一步优选，所述壳聚糖溶液的浓度为1. 5mg/mU溶剂为0.1 M醋酸溶液；所 述普鲁±藍纳米颗粒溶液的浓度为1. 5mg/mU普鲁±藍纳米颗粒的粒径为10~20nm。
[0026] 在该浓度下，高分子溶液既具有较好的溶解性和流动性，同时又能满足层层自组 装所需要的浓度要求。普鲁±藍纳米颗粒的小尺寸保证了采用颗粒进行层层自组装的可行 性，若颗粒太大，自组装的难度就会增加。
[0027] 化）在步骤（a)所获产品的表面进行聚二甲基二帰丙基氯化倭/聚丙帰酸的层层 自组装处理；
[0028] 形成微电压响应释放层（CHI/PB)。后，处于最外层的为带负电荷的普鲁±藍纳米 颗粒；为了在材料表面引入駿基，需要对表面进行聚二甲基二帰丙基氯化倭（PDADMC)/聚 丙帰酸（PAA)的层层自组装处理。因此，将所获产品交替地浸泡在聚二甲基二帰丙基氯化 倭溶液、聚丙帰酸溶液中，浸泡次数均为2次W上，每次浸泡时间为5min W上。
[0029] 聚二甲基二帰丙基氯化倭 （PDADMAC)带正电荷，聚丙帰酸（PAA)带负电荷，不仅便 于形成静电吸引力，且聚丙帰酸裸露在外侧，其駿基可用于连接亲和素。
[0030] 聚二甲基二帰丙基氯化倭溶液和聚丙帰酸溶液的浓度优选为1~lOmg/mU更优 选为5mg/血；采用的溶剂均为抑为4的0. 5M氯化钢溶液。连接层（PDADMAC/PAA)。中，层 数η优选为4 (即各浸泡4次），W保证连接层表面带有足够量的駿基。
[0031] (C)对步骤化）所获产品依次进行駿基活化处理、亲和素修饰、生物素化抗体偶 联，获得所述芯片本体。
[003引首先，利用1-己基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺巧DC)/Ν-居基玻巧醜亚 胺（N服）作为交联剂进行駿基活化处理，EDC的浓度优选为0. 2M，N服的浓度优选为0. 05M。
[0033] 然后，置于10 μ g/mL的亲和素溶液中赔育90min，亲和素的氨基与温度响应释放 层外的駿基偶联，从而完成亲和素修饰。
[0034] 最后，置于生物素化抗体溶液中赔育，利用生物素与亲和素的相互作用将生物素 化抗体偶联在温度响应释放层外，即完成芯片本体的制备。
[0035] 抗体的种类视目标细胞的种类而定，当本发明的微流控芯片用于分选和富集 CTCs时，优选采用生物素化的anti-EpCAM，生物素化抗体偶联的条件为：生物素化的 anti-EpCAM溶液浓度为10 μ g/mL(生物素化的anti-EpCAM溶于含0. 1 % BSA的1 XPBS 中），37°C下赔育60min〇
[0036] 本发明还提供了一种细胞分选和富集装置，包括：
[0037] 所述微流控芯片；
[0038] 微量注射泉，与进样通道相连；
[0039] Η通管，包括主管W及一端与主管相连通的侧管，所述主管一端与出样通道对接， 另一端连接有目标细胞收集管，所述侧管与废液收集管相连，主管与侧管的连通处设有Η 通球阀；
[0040] 电化学工作站，用于向芯片本体施加电压。
[0041] 微量注射泉将样品经进样通道注入凹槽内，目标细胞吸附在芯片本体表面，非目 标细胞先经出样通道、Η通管流入废液收集管（此时目标细胞收集管的通路关闭，由Η通 球阀实现）；经清洗后，利用电化学工作站的两个电极向芯片施加电压，促使目标细胞释 放，并经出样通道、Η通管流入目标细胞收集管中被收集起来（此时废液收集管的通路关 闭，由Η通球阀实现）。
[0042] 需要释放目标细胞时，可直接对微流控芯片施加电压，也可将芯片本体分离出来， 对芯片本体施加电压，此时释放的目标细胞可直接吸取，不必经过出样管道、Η通管等造成 不必要的损耗。
[0043] 在释放目标细胞之前，微流控芯片可W进行多次目标细胞捕获，W获得更多的目 标细胞。
[0044] 本发明还提供了所述微流控芯片在分选和富集循环肿瘤细胞中的应用。对于目标 细胞含量较少的样品，本发明的微流控芯片捕获目标细胞的效率极高，如用于在外周血中 分选富集循环肿瘤细胞。
[0045] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0046] (1)本发明在微流控芯片中引入微电压响应释放层送一环境刺激响应型材料，借 助于环境刺激响应型材料在光、电、磁、温度W及特异性酶等外在刺激的作用能够发生性质 变化的特性，实现被捕获的细胞（包括微生物）在更广范围下的特异性无损释放、富集；
[0047] (2)本发明的微流控芯片具有良好的细胞捕获效率，在血液样品流速0. 5mL/h情 况下，可W获得95%~100%的CTCs捕获效率；而且，从癌症病人的新鲜血液样品中被捕获 的CTCs具有很好的细胞活性，便于后续的科学研究和病情评价分析。
【附图说明】
[0048] 图1为含微电压响应释放层的芯片本体的制备过程及工作原理图；
[0049] 其中，"Oxygen plasma etch"表示氧等离子体蚀刻，"Layer by layer"表示层层 自组装，CHI/PB表示壳聚糖/普鲁±藍纳米颗粒，PAA/PDADMAC表示聚丙帰酸/聚二甲基二 帰丙基氯化倭，畑S/EDC表示N-居基玻巧醜亚胺/1-己基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二 亚胺，Anti-EpCAM表示抗上皮细胞粘附分子抗体；
[0050] 图2a为本发明一种细胞分选和富集装置的结构示意图；
[0051] 图2b为图2a中的A-A剖面图；
[0052] 图3a为微电压响应释放层（CHI/PB)。中η分别取0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21，24, 27时 所对应产品的外观图；
[0053] 图3b为利用楠圆偏振光谱仪测得的不同微电压响应释放层处理层数的产品的薄 膜厚度；
[0054] 其中，"Thickness (nm)"表示厚度（nm)，"Number of Bilayers (η)"表示 CHI/PB 的层数（η);
[0055] 图3c为利用紫外可见分光光度计检测不同微电压响应释放层处理层数的产品在 700nm处的吸收值的类线性变化图；
[0056] 其中，"Absorbance (700nm)"表示 700nm 处的吸光度，"Number of Bilayers (η)" 表示CHI/PB的层数（η);
[0057] 图3d为利用扫描电子显微镜获得畑Ι/ΡΒ)。中η = 27的产品表面形貌图；
[005引图3e为利用原子力显微镜获得畑I/PB)。中η = 27的产品表面形貌图；
[0059] 图4a为利用微流控芯片捕获肝癌细胞化pG2后的显微图片；
[0060] 图4b为经过电化学处理后芯片本体的显微图片；
[0061] 图4c为随着电化学作用时间的延长芯片本体的厚度变化曲线；
[0062] 其中，"Absorbance (700nm)"表示700nm处的吸光度，"Time (min)"表示电化学作 用时间（min);
[0063] 图4d为随着电化学作用时间的延长被捕获细胞的吸附率变化曲线；
[0064] 其中，"Harvest cell (%)"表示被捕获细胞的吸附率（％)，"Time (min)"表示电 化学作用时间（min);
[0065] 图4e为吸附在芯片本体表面的细胞活性表征图；
[0066] 图4f为被捕获细胞释放后的细胞活性表征图；
[0067] 图4g为畑I/PB)。中η = 15时芯片本体上被捕获细胞的释放效率图；
[0068] 图地为（CHI/PB)。中η = 21时芯片本体上被捕获细胞的释放效率图；
[0069] 图5a为样品流速对微流控芯片的细胞捕获率的影响；
[0070] 其中，"Flow rate (mL/h)"表示流体流速（mL/h)/'CapUire }deld(% )"表示捕获 率（％ );
[0071] 图化为微流控芯片对不同溶液环境中、不同浓度化pG2细胞的捕获率；
[0072] 其中，"Sp;Lked number of cells"表不细胞浓度；"Cap1:ure }deld (%)"表不捕 获率（％ );
[0073] 图5c为微流控芯片对不同癌细胞的捕获率；
[0074] 其中，"CapUire }deld(% )"表示捕获率（％ );
[00巧]图5d为利用免疫英光染色验证被捕获细胞的类型；
[0076] 图6a为利用微流控芯片对临床样本中CTCs进行分选；
[0077] 其中，左上图为利用D API (4'，6-二脉基-2-苯基剛巧）对被捕获细胞进行细胞核 染色的结果，右上图为被捕获细胞的细胞角蛋白（切tokeratin)染色情况，左下图为确认 被捕获细胞表面有无 CD45的情况，右下图为前Η张图片的整合结果；
[0078] 图化为对分选获得的CTCs进行mRNA提取的结果图；
[0079] 其中，Marker表示分子量标准，control表示对照，Released表示被释放细胞。
【具体实施方式】
[0080] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
[0081] 本实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；其中的定量试验，均设置 Η次重复实验，结果取平均值；所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店 购买得到的。
[0082] 本【具体实施方式】中用到的主要实验材料包括：
[008引 （1)试验用癌细胞株：均购自ATCC，产品目录号分别为：肝癌细胞株化ep G2, ATCC⑥皿-8065?)，肺腺癌细胞株（A549, ATCC⑩CRM-C化-185?)，乳腺癌细胞株 (MCF7, ATCC⑥HTB-22?)，口腔鱗状细胞癌细胞株（邸，ATCC⑧C化-17?)和宫颈癌细胞 株化eLa，（ ATCC⑥ C化-2?)。
[0084] 细胞在相应培养基中生长至一定浓度，然后采用膜酶消化约lOmin，收集细胞并计 数后用于后续实验测试。如有必要，采用DAPI对细胞进行预标记。根据后续需要，将细胞 W 100~100, 000个/mL的浓度分别分散于PBS、全血或裂解血中。
[0085] 似细胞培养基（DMEM、RPMI-IMO等）购自Invitrogen，胎牛血清（FC巧购自 Sigma-Al化ich,生物素修饰的人源 lipCAM 抗体化iotin-anti-EpCAM)购自 R&D systems, 1-己基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐购自TCI，其他化学试剂购自Wako, IT0导 电玻璃购自 DeltaTechnologies。
[008引 做壳聚糖溶液的配制鹿聚糖W 1. 5mg/血的浓度溶解于0. 1M醋酸溶液中，然后 采用0. 45 μ m聚離讽超滤膜真空抽滤，所得溶液使用盐酸或者氨氧化钢溶液调节抑至4. 0。
[0087] (4) PB纳米颗粒溶液的配制；在揽拌状态下，将lOmM的化C12溶液逐滴加入相同体 积的50mM而化(CN) e和KC1溶液中，然后采用3, OOODa纤维素透析膜对反应液进行透析；收 集透析残余溶液，采用邻苯二氨钟缓冲液或盐酸和氨氧化钢溶液调节pH至4. 0。保持溶液 中PB纳米颗粒终浓度为1. 5mg/mL。
[0088] (5)聚二甲基二帰丙基氯化倭溶液和聚丙帰酸溶液的配制；将聚丙帰酸钢和聚二 甲基二帰丙基氯化倭分别溶解于0. 5M氯化钢溶液中，终浓度为5g/L。
[0089] 上述化CI2溶液、KsFe (CN) e溶液、KC1溶液、盐酸、氨氧化钢溶液氯化钢溶液均采用 Η蒸水配制。
[0090] 实施例1芯片本体的制备
[0091] 芯片本体的制备过程及工作原理如图1所示，其制备过程包括W下步骤：
[009引 （1)依次采用二氯甲焼、丙丽、甲醇和去离子水超声清洗口0导电玻璃15min，然后 使用等离子体刻蚀（Harrick PCD 32G)处理IT0导电玻璃5min，将处理后的IT0导电玻璃 放入事先配好的壳聚糖溶液中静置3min ;
[0093] (2)按照层层自组装的标准方法，将IT0导电玻璃交替地浸泡在壳聚糖溶液、普鲁 ±藍纳米颗粒溶液中进行层层自组装处理，每次浸泡lOmin，两次浸泡的间隙采用抑4. 0 的去离子水清洗3min，在IT0导电玻璃表面形成微电压响应释放层（CHI/PB)27 ;
[0094] (3)按照层层自组装的标准方法，将步骤（1)所获产品交替地浸泡在聚二甲基二 帰丙基氯化倭溶液、聚丙帰酸溶液中进行层层自组装处理，每次浸泡lOmin，两次浸泡的间 隙采用抑4. 0的去离子水清洗3min，在（CHI/PB)27外形成连接层（PDADMAC/PAA)4 ;
[0095] (4)利用邸C(0. 2M)/N服(0. 5M)对步骤（3)所获产品进行駿基活化处理；
[009引 妨将步骤（4)所获产品置于10 μ g/ml的亲和素溶液中赔育90min ;
[0097] (6)将步骤（5)所获产品置于10 μ g/mL的生物素化人上皮细胞吸附因子抗体溶液 中（溶于含有0. 1% BSA的1XPBS中），37°C下赔育60min ;获得含微电压响应释放层的芯 片本体。
[009引实施例2细胞分选和富集装置的制备
[009引如图2a所示，本实施例一种细胞分选和富集装置，包括微流控芯片1、微量注射泉 2、H通管3、废液收集管4、目标细胞收集管5 W及电化学工作站（图中省略）。
[0100] 由图2a和化可见，微流控芯片1包括叠置固定的的芯片本体12 (由实施例1制 得）和盖体11，盖体11设有凹槽13、与凹槽13相连通的进样通道14和出样通道15,且凹 槽13的开口朝向芯片本体12。
[010。 盖体11采用PDMS材料制成，便于在其上设置凹槽13、进样通道14和出样通道15。 盖体11与芯片本体12的固定方式为；当盖体11较薄（3mm W下）时，分别采用离子蚀刻机 对盖体11与芯片本体12的接触面进行居基化处理，然后将盖体11与芯片本体12贴合，直 接密闭封装；当盖体11较厚（3mm w上）时，采用小型文件夹将盖体11与芯片本体12上下 固定即可。
[0102] 如图2a所示，微量注射泉2通过第一连接管16与进样通道14相连，用于注入样 品，并控制样品的流动速度；Η通管3包括主管31 W及一端与主管31相连通的侧管32,主 管31 -端通过第二连接管17与出样通道15对接，另一端连接有目标细胞收集管5,侧管 32与废液收集管4相连，主管31与侧管32的连通处设有Η通球阀33 ;电化学工作站用于 向芯片本体12施加电压。
[0103] 本实施例细胞分选和富集装置的工作原理为：
[0104] 微量注射泉2将样品经进样通道14注入凹槽13内，目标细胞吸附在芯片本体12 表面，非目标细胞先经出样通道15、Η通管3流入废液收集管4 (此时目标细胞收集管5的 通路关闭，由Η通球阀33实现）；经清洗后，利用电化学工作站的两个电极向芯片本体12 施加电压，促使目标细胞释放，并经出样通道15、Η通管3流入目标细胞收集管5中被收集 起来（此时废液收集管4的通路关闭，由Η通球阀33实现）。从Η通管3流出的目标细胞 液也可直接被细胞培养皿收集起来，经培养后做进一步的生物化学分析。
[0105] 对于含有温度响应释放层的微流控芯片1，则直接将微流控芯片1置于4Γ下一段 时间，促使目标细胞释放，并被目标细胞收集管收集。
[0106] 需要释放目标细胞时，可直接对微流控芯片1施加电压或低温处理，也可将芯片 本体12分离出来，对芯片本体12施加电压或低温处理，此时释放的目标细胞可直接吸取， 不必经过出样管道15、Η通管3等造成不必要的损耗。
[0107] 在释放目标细胞之前，可多次加样，从而微流控芯片1可W进行多次目标细胞捕 获，W获得更多的目标细胞。
[010引实施例3形貌表征和性能测试
[0109] (1)对实施例1步骤（2)所获产品进行形貌表征
[0110] 图3a所示的为微电压响应释放层畑Ι/ΡΒ)η中η分别取 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21，24, 27时，所对应产品的外观图。
[0111] 利用楠圆偏振光搏仪测量不同处理层数的产品的薄膜厚度，结果如图3b所示。
[0112] 利用紫外可见分光光度计检测不同处理层数的产品在700nm处的吸收值的类线 性变化，结果如图3c所示。
[0113] 利用扫描电子显微镜获得η = 27的产品表面形貌图，如图3d所示。
[0114] 利用原子力显微镜获得η = 27的产品表面形貌图，如图3e所示。
[0115] (2)对实施例1芯片本体的细胞捕获与释放性能进行测试
[0116] W肝癌细胞化pG2为例，测试芯片本体的细胞捕获与释放性能；将芯片本体放置 于12孔板中，将ImL浓度为105个/血的细胞涂于芯片本体上，37°C、5% (?的环境下赔育 45min，然后采用磯酸缓冲溶液冲洗3次。然后对芯片本体施加1. 25V的电压考察被捕获细 胞的释放性能。结果如图4a、4b、4c、4d、4e、4f所示。
[0117] 由图4a、4b可见，芯片本体能够高效捕获化pG2,并且在对芯片本体施加电压 (1. 25V)后，胎pG2能够有效释放；由图4c、4d可见，随着芯片本体施加电压的时间的延长， 芯片本体的厚度逐渐变小，HepG2在芯片本体表面的吸附率也逐渐降低；由图4e、4f可见， HepG2无论是吸附还是释放，其细胞活力均较高，表面本发明的芯片本体对细胞基本无损 伤。
[0118] 同时，本实施例还发现，（CHI/PB)。中η取不同数值时，芯片本体上被捕获细胞完全 释放的时间会有差异。结果如图4g、4h所示。
[0119] 由图4g可见，η = 15时，所得到的芯片本体在细胞释放过程中不能实现100%的 细胞释放效果；由图地可见，η = 21时，芯片本体可W实现100%的细胞释放效率；η = 27 时，芯片本体也可W实现100%的细胞释放效率。
[0120] (3)对微流控芯片的细胞捕获与释放性能进行测试
[0121] 利用实施例2的细胞分选和富集装置，测试样品流速对微流控芯片的细胞捕获率 的影响，结果见图5曰。由图5a可见，在不同的样品流速下，微流控芯片的细胞捕获率存在显 著不同，流速越大，捕获率越低。
[0122] 分别利用PBS溶液、全血、裂解血配置不同浓度的肝癌细胞溶液，测试微流控芯片 对化pG2的捕获率，结果见图化。由图化可见，流速为0. 5mL/h时，微流控芯片在Η种溶液 环境下均可W达到90% W上的细胞捕获率，表明该微流控芯片可W完成多种溶液环境下的 细胞分选目标，且结果基本保持稳定一致。
[0123] 利用PBS缓冲溶液分别配置相同浓度（100个/血）的各癌细胞溶液（口腔鱗癌邸 细胞，肺癌Α549细胞，人宫颈癌化la细胞和人乳腺癌MC巧细胞），测试微流控芯片对各癌 细胞的捕获率，结果见图5c。由图5c可见，该微流控芯片对上皮细胞源的实体瘤细胞具有 广谱的通用性。
[0124] 将捕获有细胞的芯片本体置于含22mM calcein AM和4mM ethidium bromide的 PBS缓冲溶液中赔育30min，然后采用磯酸缓冲溶液清洗芯片本体并置于英光显微镜下观 察结果（见图5d)。结合激光共聚焦显微镜确定被捕获细胞为肿瘤细胞，而不是血液中的其 他细胞。
[0125] 实施例4临床肿瘤样本的应用实例
[0126] 在医院中采用包含有邸TA抗凝剂的真空取血管采集健康人及膜腺癌肿瘤病人的 外周血，放置于4°C冰箱，并在24小时内处理完毕。
[0127] 利用实施例2的装置对各外周血样本进行分选处理，处理步骤为：
[0128] 采用0. 5mL/h的流速进行细胞捕获测试，测试外周血总量为每个样本ImL。采用免 疫英光染色鉴定被捕获细胞种类，并对捕获细胞进行RNA提取，反转录，PCR和凝胶电泳测 试，结果见图6曰、化所示。
[0129] 由图6a可见，利用本发明的装置从膜腺癌肿瘤病人的裂解血样本中成功分选到 CTCs细胞，而从健康人的裂解血样本中未分选到CTCs细胞，并由免疫英光染色证实。由图 化可见，通过本发明装置获取的CTCs细胞实现了对mRNA的无损提取，证实了本发明装置对 CTCs细胞后续分子分析的可行性。
【主权项】
1. 一种用于细胞分选和富集的微流控芯片，其特征在于，包括叠置固定的芯片本体和 盖体，所述盖体设有凹槽、与凹槽相连通的进样通道和出样通道，所述凹槽的开口朝向芯片 本体； 所述芯片本体由以下方法制备获得： (a) 在导电基底表面进行壳聚糖/普鲁士蓝纳米颗粒的层层自组装处理； (b) 在步骤（a)所获产品的表面进行聚二甲基二烯丙基氯化铵/聚丙烯酸的层层自组 装处理； (c) 对步骤（b)所获产品依次进行羧基活化处理、亲和素修饰、生物素化抗体偶联，获 得所述芯片本体。2. 如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，步骤（a)中，将导电基底交替地浸泡 在壳聚糖溶液、普鲁士蓝纳米颗粒溶液中进行层层自组装处理，浸泡次数均为10次以上， 每次浸泡5min以上。3. 如权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，导电基底在壳聚糖溶液、普鲁士蓝纳 米颗粒溶液中的浸泡次数均为21~30次，每次浸泡lOmin。4. 如权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述壳聚糖溶液的浓度为0. 1~ 10mg/mL，溶剂为0. 01~1M醋酸溶液；所述普鲁士蓝纳米颗粒溶液的浓度为0. 15~15mg/ mL，普鲁士蓝纳米颗粒的粒径为10~20nm。5. 如权利要求1~4任一所述的微流控芯片，其特征在于，所述导电基底为ITO导电玻 3?〇6. 如权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于，步骤（b)中，将步骤（a)所获产品交 替地浸泡在聚二甲基二烯丙基氯化铵溶液、聚丙烯酸溶液中进行层层自组装处理，浸泡次 数均为2次以上，每次浸泡时间为5min以上。7. -种细胞分选和富集装置，其特征在于，包括： 如权利要求1~6任一所述的微流控芯片； 微量注射泵，与进样通道相连； 三通管，包括主管以及一端与主管相连通的侧管，所述主管一端与出样通道对接，另一 端连接有目标细胞收集管，所述侧管与废液收集管相连，主管与侧管的连通处设有三通球 阀； 电化学工作站，用于向芯片本体施加电压。8. 如权利要求1~6任一所述微流控芯片在分选和富集循环肿瘤细胞中的应用。9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述微流控芯片上偶联的生物素化抗体为 生物素化的anti-EpCAM，生物素化抗体偶联的条件为：生物素化的anti-EpCAM溶液浓度为 10μg/mL〇
【专利摘要】本发明公开了一种用于细胞分选和富集的微流控芯片及其应用。微流控芯片包括叠置固定的芯片本体和盖体，所述盖体设有凹槽、与凹槽相连通的进样通道和出样通道，所述凹槽的开口朝向芯片本体；芯片本体由以下方法制备获得：(a)在导电基底表面进行壳聚糖/普鲁士蓝纳米颗粒的层层自组装处理；(b)在步骤(a)所获产品的表面进行聚二甲基二烯丙基氯化铵/聚丙烯酸的层层自组装处理；(c)对步骤(b)所获产品依次进行羧基活化处理、亲和素修饰、生物素化抗体偶联，获得所述芯片本体。本发明在微流控芯片中引入环境刺激响应型材料，其在外界刺激的作用能够发生性质变化，能够实现被捕获细胞的可控、无损释放。
【IPC分类】G01N35/00, G01N33/574
【公开号】CN105486865
【申请号】CN201410467913
【发明人】王本, 肖云, 唐睿康
【申请人】浙江大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年9月15日
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